PLOS ONE: Wnt /β-catenina Sinalização Melhora a ciclooxigenase-2 (COX2) transcricional Atividade no câncer gástrico Cells

Abstract

Fundo

O aumento da expressão da enzima ciclooxigenase-2 (COX2) é uma das principais características do cancro gástrico (CG), que é uma das principais causas de morte no mundo, principalmente na Ásia e América do Sul. Embora a via de sinalização /β-catenina Wnt foi envolvido na ativação da transcrição do gene COX2, o mecanismo preciso modular essa resposta ainda é desconhecida.

Metodologia /Principais Achados

Aqui nós estudamos a regulação da transcrição do gene COX2 em linhas celulares de GC e avaliou se este fenómeno é modulada pela sinalização de Wnt /β-catenina. Em primeiro lugar, examinada a expressão de ARNm em células COX2 GC e verificou que existe um padrão de expressão diferencial de acordo com elevados níveis de localizada nuclear β-catenina. O tratamento farmacológico com qualquer um de lítio ou ácido valpróico e indução molecular com Wnt3a significativamente melhorada expressão de ARNm de COX2 canónica purificado de uma dose e modo dependente do tempo. supressão de série de um fragmento de 1,6 Kpb do promotor COX2 e experiências gain- ou perda de função nos permitiu identificar uma região sensível mínima de Wnt /β-catenina que consiste de 0,8 Kpb do promotor de COX2 (pCOX2-0.8), que mostraram resposta máxima em ensaios de gene-repórter. A actividade desta região promotora pCOX2-0.8 foi ainda confirmada por ensaios de ligação de mutagênese e DNA-proteína do local indicado.

Conclusões /Significado

Nós concluímos que o promotor mínimo pCOX2-0.8 contém uma novo factor de célula T funcional /factor de intensificador linfóide (TCF /LEF) elemento -response (TBE o sítio II; -689 /-684) que responde directamente a sinalização de Wnt /β-catenina e melhorada que pode ser importante para o aparecimento /progressão de GC

Citation:. Nuñez F, Bravo S, Cruzat F, Montecino M, de Ferrari GV (2011) Wnt /β-catenina Sinalização Melhora a ciclooxigenase-2 (COX2) transcricional Atividade em células de câncer gástrico. PLoS ONE 6 (4): e18562. doi: 10.1371 /journal.pone.0018562

editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de novembro de 2010; Aceito: 11 de março de 2011; Publicação: 06 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Nuñez et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela CTI-câncer, Programa Bicentenario en Ciencia y Tecnología (PBCT) - número de concessão Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT) PBCT-6 do governo chileno (MM e GVD). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é uma doença multifatorial, caracterizada por neoplasias altamente malignas na mucosa gástrica, e representa a segunda maior causa de morte por câncer em todo o mundo com a maior prevalência na Ásia e América do Sul [1], [ ,,,0],2], [3]. fatores de risco associados ambientais incluem a dieta, o consumo de tabaco, obesidade e Helicobacter pylori
infecção [4]. Várias mutações em genes supressores de tumores, incluindo P53, polipose adenomatosa coli (APC), E-caderina e RUNX3 [3], [5], bem como em oncogenes como K-ras, HER2 e β-catenina [3], [6], [7], têm sido documentadas em GC. Além disso, a sobre-expressão de vários genes foi documentada, incluindo WNT2B [8], TC1 (C8orf4) [9], e a enzima ciclo-oxigenase 2 (COX2), que catalisa o passo crucial na produção de prostaglandina E2, um mediador chave de inflamação da articulação [10], [11].

tem sido observado que a expressão do gene COX2 é significativamente aumentada em tecidos de adenocarcinomas gástricos humanos, quando comparados com pares de amostras de mucosa gástrica desprovida de células cancerosas [10 ]. Tal aumento da expressão tem sido proposto para afectar a intensidade da invasão, tamanho, metástases dos nódulos linfáticos, o desenvolvimento do tumor e mau prognóstico [4], [12], [13]. A este respeito, grandes quantidades de dados descrevem actividade quimio-preventiva e anticancerígeno de drogas anti-inflamatórias não esteróides (AINEs), incluindo inibidores selectivos de COX2 como tratamentos potenciais para GC [10], [11], [14].

controlo transcricional do gene COX2 depende da maquinaria molecular que interage com o promotor de COX2, que parece ser controlada por meio da actividade de várias vias de sinalização [15], [16], [17]. Com efeito, foi inicialmente estabelecido que CRE (-59 /-53), o NF-IL6 (-132 /-124) e NF-kB (-233 /-214) sequências de consenso no promotor COX2 eram necessários para a expressão do gene [16]. estudos funcionais subsequentes no promotor COX2 identificou uma série de elementos reguladores que participam na transcrição do gene, incluindo AP-1, AP-2, Sp-1, C /EBP [18], [19], [20] e proteínas pertencente ao factor T-Cell /fator potenciador linfóide (TCF /LEF) da família de fatores de transcrição, que são cruciais para a transdução de sinal /β-catenina Wnt [21].

a /β-catenina via de sinalização Wnt é amplamente reconhecida como desempenhando um papel importante na doença humana, particularmente no aparecimento e desenvolvimento de cancro [22], [23], [24]. Curiosamente, as experiências recentes em células de GC derivado demonstraram uma relação entre a expressão de COX2 e a inibição de glicogénio sintase quinase-3β (GSK3β) da enzima [25], que é um componente chave de Wnt que fosforila β-catenina e promove a sua degradação subsequente através proteassoma [26]. A relação entre Wnt /β-catenina e COX2 expressão em modelos de células de cancro diferentes é adicionalmente suportada a partir dos seguintes estudos. Em primeiro lugar, tem-se observado no epitélio mamário que Wnt /β-catenina desempenha um efeito indirecto sobre COX2 de transcrição, o que poderia ser mediada por sobre-regulação de um factor PEA3 intermediário [27]. Em segundo lugar, e em contraste com um modo de acção indirecta, Araki e cols. [21] relataram que em células de cancro do cólon, há uma indução da expressão de COX2 através de um mecanismo β-catenina /TCF dependente, e caracteriza-se parcialmente um local de consenso de TCF /LEF ligação (TBE: núcleo CTTTG) posicionada 1079 pb a montante do inicio da transcrição site da promotora COX2. Em terceiro lugar, foi observado que em pacientes com cancro do cólon e linhas celulares derivadas que há uma associação entre a sobre-expressão das proteínas associadas a via Wnt LEF-1 e Pontin52 /TIP49a e a sobre-regulação da expressão de COX2 [28]. Finalmente, utilizando condrócitos, tem sido demonstrado que LEF-1, em conjunto com β-catenina, COX2 expressão regulada por ligação directa do complexo LEF-1 /β-catenina a região 3 'UTR do locus genómico COX2 [29] . Portanto, no presente não é uma imagem clara de como se a sinalização de Wnt está envolvido na expressão do gene COX2, ou como o seu papel no aparecimento de GC /progressão. Aqui procurou-se compreender se existe uma regulação directa da expressão do gene COX2 via sinalização de Wnt /β-catenina e para identificar elementos reguladores de Wnt /β-catenina na região promotora do gene COX2 que pode regular positivamente COX2 de transcrição em células de GC.

Materiais e Métodos

células e condições de cultura

linhagens de células humanas MKN45 (Coleção japonesa dos recursos biológicos de investigação, Japão), N87, SNU1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38 e HEK293 (American Type Culture Collection; Rockville, MD) foram utilizados neste estudo. células MKN45, N87, SNU1 KATOIII e foram cultivadas em RPMI média (Gibco); AGS em meio F12K (Hyclone); WI38 em EMEM (Gibco); e HEK293 em meio DMEM (Gibco). O meio de cultura foi suplementado com 10% FBS (Gibco) (AGS com 20%) e 1% de penicilina /estreptomicina. Linhas celulares foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO _{2 e humidade saturada.}

Plasmídeos e mutagénese dirigida ao local

O SuperTOPFlash-luciferase e o renilla- pRL-TK plasmídeos de luciferase [30], o β-catenina constitutivo activo (S33Y) [31] e os plasmídeos de expressão ΔTCF4 dominante-negativos [32] foram descritos anteriormente. COX2 quimérico fragmentos de promotor-luciferase foram gerados por PCR a partir de ADN genómico humano utilizando iniciadores específicos que contêm sítios de restrição e subsequentemente inserido no vector pGL3-Basic (Promega). As mutações no sítio de TBE-II (-689 /-684) do promotor de COX2 foram gerados utilizando iniciadores pCOX-0,8-TBEMUT com o kit mutagesis dirigida ao local QuickChange (Stratagene). As construções foram verificadas através de sequenciação directa (ABI-3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). sequências de iniciadores são descritas na Tabela S1.

semiquantitativa e em tempo real de RT-PCR

O ARN total foi extraído em condições livres de ARNase, utilizando TRIZOL (Invitrogen) e 2 ug de ARN foi transcrito reversamente com 200 U de Superscript II Reverse Transcriptase (RT) (Invitrogen), utilizando 500 ng de iniciadores oligo (dT). Determinação experimental da COX2, c-myc e os níveis de ARNm de CCND1 foi realizada de acordo com [33]. Em resumo, os ADNc foram sujeitos a PCR em Tempo Real no Sistema de iCycler iQ um (Bio-Rad Laboratories). Cada volume de reacção de 25 uL continha 1 unidade de Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen), 1x tampão de reacção (Tris-HCl 20 mM pH 8,4, e KCl 50 mM), MgCl 1,5 mM _{2, 2,5 ug de BSA, 0,01% Glicerol , 200 M de dNTPs, solução verde 0,3X SYBR e 0,4 mM de primers específicos (ver Tabela S1). As condições de PCR foram as seguintes: 90 segundos a 94 ° C e em seguida 30 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 62 ° C e 30 segundos a 72 ° C. Todas as reacções foram realizadas em triplicado e os resultados obtidos para cada gene foram normalizados com os obtidos em paralelo com β-actina. A qualidade do RNA e PCR produtos foi monitorizada ao longo das experiências através de electroforese em géis de agarose a 1%, corados com brometo de etídio.}

A indução da via de sinalização /β-catenina Wnt

sinalização Wnt estava farmacologicamente induzida em células MKN45 semeadas em placas de cultura de 6 poços a 80-90% de confluência (isto é, 1, 2, 4 e 8 horas de incubação), quer com mM de LiCl (Sigma) ou 5-10 mM de ácido valpróico 20/10 (VA; Sigma) como previamente descrito [34], [35]. Em seguida, as células foram colhidas para extracção de ARNm e a determinação do tempo-real, de PCR, como descrito acima. Da mesma forma, MKN45 células foram estimuladas durante 2 horas com 200 e 400 ng /ml de proteína Wnt3a purificado. A purificação do Wnt3a foi realizada como descrito [36].

actividade de transcrição do promotor de COX2

Actividade do promotor de COX2 foi medida em 80-90% confluentes MKN45, AGS, WI38 e HEK293 as células semeadas em placas de 6 cavidades de cultura. Resumidamente, as células foram co-transfectadas utilizando FuGENE (Roche) por 24 com o pCOX2-luciferase ou os repórteres pSuperTOPFlash e quer β-catenina activa constitutiva (S33Y) [31] ou o ΔTCF4 dominante-negativo [32] construções. O plasmídeo de luciferase de Renilla pRL-TK foi usada como um controlo interno. Firefly e actividades luciferase de Renilla foram determinados utilizando o Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega) num instrumento leitor multiplacas Victor-3 (Perkin Elmer), como descrito anteriormente [30]. actividades de luciferase relativas foram expressa dividindo a actividade de luciferase de pirilampo com a actividade de luciferase Renilla para cada amostra (N = 3, cada um em triplicado).

imunoprecipitação (chip) ensaios Chromatin

estudos foram realizados em ChIP células MKN45, como descrito anteriormente [37]. A fracção de β-catenina nuclear ligado quer aos locais de TBE I, II, III ou IV no promotor COX2 humana foi imunoprecipitada com anticorpos anti β-catenina (Santa Cruz) e avaliadas por Real-Time PCR utilizando iniciadores específicos (Tabela S1) . Além disso, a fracção da RNA polimerase II (Pol-II) e histonas acetiladas H3 e H4 (H3ac e H4ac) ligado quer à região de TBE-II (-793 /-594) ou da região proximal (-118 /+ 62 ) do promotor COX2 foi avaliada de forma semelhante (anti-Pol-II, Santa Cruz; H3ac e H4ac, Upstate). Como um controlo positivo utilizou-se o local de TBE c-myc [38]. A especificidade dos anticorpos foi determinada com IgG de coelho normal-(Santa Cruz).

electroforética ensaio de desvio de mobilidade (EMSA)

EMSA foi realizada utilizando oligonucleótidos que contêm quer a sequência de consenso do tipo selvagem COX2 TBE-II (ver Tabela S1) ou sequências TBE mutantes previamente relatados [39]. Em resumo, de tipo selvagem e mutados oligonucleótidos ^{32P-marcadas foram incubadas em tampão com extractos nucleares de células MKN-45 de ligação durante 30 minutos a 30 ° C. Subsequentemente, os complexos DNA-proteína foram separadas a partir de oligonucleótidos livres num gel de poliacrilamida não desnaturante a 5%. Após a electroforese, o gel foi seco e exposto a película durante um dia. A visualização das bandas radioactivas foram analisadas por autorradiografia. especificidade de ligação foi verificada por incubação os complexos DNA-proteína na presença de um excesso não marcado de tipo selvagem ou mutantes, os oligonucleótidos [21], [39].}

A análise estatística

Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes com três repetições. Os dados são apresentados como a média ± DP. Várias comparações entre os grupos foram realizadas por ANOVA de uma via utilizando o software STATISTICA 9.0. P
. ≪ 0,05 foi considerado significativo

Resultados

expressão COX2 se correlaciona com os níveis de β-catenina nucleares em células GC

Inicialmente determinaram a expressão os níveis de ARNm de COX2 em GC humana linhagens de células MKN45, N87, SNU1, SNU16, KATOIII e AGS [40], [41], [42], bem como WI38 fibroblastos utilizados aqui como uma linha celular de controlo [43], que examina se eles foram correlacionados com a sinalização de Wnt /β-catenina. Como representado na Figura 1, altos níveis de expressão de COX2 foram observadas tão cedo quanto 26 ciclos de amplificação por PCR em linhas de células metastáticas MKN45, e SNU16 KATOIII, e também na linha de células AGS que é derivado a partir de um tumor primário. Este resultado está de acordo com os níveis de expressão COX2 detectados anteriormente em MKN45, KATOIII e células AGS [44], [45], [46]. Em contraste, os níveis de ARNm de COX2 ou eram muito baixos em fibroblastos WI38 ou indetectável em N87 e células SNU1 (Figura 1A), sugerindo que este padrão de expressão diferencial de não está relacionada com fases metastáticos ou o nível de transformação celular. Notavelmente, os níveis nuclear β-catenina foram intimamente relacionado com a expressão de COX2, uma vez que foram observados níveis elevados da proteína em células MKN45, AGS, SNU16 e KATOIII, em comparação com N87, SNU1 e células WI38 (Figura 1B), o que implica um papel para Wnt sinalização na expressão de mRNA em células de COX2 GC.

aumento da expressão de COX2 via Wnt /β-catenina sinalização

de modo a examinar se a cascata de Wnt está envolvida na expressão da COX2, células MKN45 foram farmacologicamente estimulada por diferentes períodos de tempo (isto é, 1, 2, 4 e 8 horas), quer com lítio (LiCl) ou ácido valpróico (VA), uma vez que ambas as drogas têm sido mostrado previamente para modular a sinalização de Wnt através da inibição da actividade GSK3β e, assim, aumentar nuclear níveis de β-catenina [34], [35]. Curiosamente, foi observada uma melhoria notável na expressão de COX2 induzida por LiCl 10-20 mM ou 5-10 mM, VA, que começou logo após a incubação com os compostos e que atingiu o pico após duas horas de tratamento (Figura 2A). determinação em tempo real de níveis de ARNm de COX2 em células MKN45 semelhante tratados com LiCl ou Va (2 h) indicou que COX2 foi significativamente regulada para cima (Figura 2B) e que este efeito foi acompanhado com o observado nos genes alvo /β-catenina Wnt c-myc [47] e ciclina D1 [48]. Em seguida, a fim de excluir a possibilidade de que o fenômeno observado refletiu efeitos não-específicos das drogas que atuam sobre as proteínas que afetam diferentes cascatas de sinalização, foi aplicado diretamente uma proteína purificada Wnt3a totalmente funcional para células MKN45 (ver Métodos). Estas experiências demonstraram claramente que 200-400 ng /ml de Wnt3a significativamente melhorada expressão de ARNm de COX2 purificado após curtos períodos de incubação (Figura 2), que explica parcialmente o efeito rápido de LiCl e VA e suportando uma correlação directa entre canónica de Wnt /β-catenina activação e estimulação da COX-2 a transcrição em células de GC.

a identificação de novos locais de TBE no promotor do gene
COX2

estudos anteriores indicaram que um local sensível TBE /β-catenina Wnt ( núcleo de consenso: CTTTG) está localizado na -1079 /-1074 pb a montante do local de início da transcrição (TSS) do gene COX2 humano [21] (local IV; Figura 3A, ver também Figura S1). Prosseguir com a digitalização da sequência a montante de 1.600 bp do TSS [49] permitiu-nos identificar 3 novos locais TBE putativos: -877 /-872 pb (site III; orientação sentido), -689 /-684 pb e -318 /-313 pb (Sites II e I, respectivamente, tanto na orientação anti-sentido) (Figura 3A), que não são conservadas entre os genes de murino (Figura COX2 S1) e humano. Por conseguinte, o segmento clonado de 1600 pb a partir do promotor humano da COX2 (pCOX2), incluindo todos os quatro locais de TBE, no vector pGL3-basic fundido ao gene da luciferase para ser utilizada subsequentemente em ensaios de repórter (Figura 3A). Notavelmente, em paralelo a transfecção de 10 ng deste construto em MKN-45 e células HEK293 revelou que pCOX2 exibida uma maior actividade do promotor basal significativa (9 vezes) em células MKN45 (Figura 3B e C). Colocámos a hipótese de que esta actividade de promotor basal pCOX2 superior poderia estar relacionada com o elevado conteúdo de β-catenina nuclear nesta linha de células GC (Figura 1B). Assim, as células MKN45 e HEK293 foram co-transfectadas com pCOX2 na presença de doses mais baixas de uma proteína constitutiva activa β-catenina (S33Y) [31]. Como pode ser observado na Figura 3, a actividade pCOX2 foi efectivamente aumentada em ambos os tipos celulares, sugerindo que β-catenina pode ligar-se e, em seguida, activar factores de transcrição TCF /LEF nos locais TBE funcionais dentro do promotor pCOX2.

Contribuição de TBE sites para a actividade do promotor em células COX2 GC

Para dissecar a contribuição de sítios reactivos TBE Wnt /β-catenina sobre a actividade de transcrição do promotor de COX2 quatro deleções pCOX2 constructos foram gerados: pCOX-1,2 (-1123 /+ 35 pb); pCOX-0,8 (-741 /+ 35 pb); pCOX-0,65 (-582 /+ 35 pb); e pCOX-0,4 (-371 /+ 35 pb) (Figura 4A). Estas construções foram subsequentemente ensaiadas para a sua actividade através de transfecções transientes em células MKN45 e AGS, utilizando os fibroblastos WI38 como uma linha celular de controlo. Consistente com os níveis de expressão de COX2 endógenas nestas linhas celulares GC (Figura 1A), deleções pCOX2 retido diferentes níveis de actividade em células MKN45 e AGS (Figura 4B e C). Em contraste, a actividade do promotor não foi detectada em fibroblastos WI38 (Figura 4D), mesmo quando as doses de transfecção dessas células foram aumentados 8 vezes (isto é, de 50 a 400 ng) (Figura S2). É importante notar, e de acordo com relatórios anteriores [50], as células WI38 expresso eficientemente uma construção de luciferase repórter contendo o promotor do gene da p21 (Figura S2), que indica que, nestas células de controlo da maquinaria molecular responsável pela indução de COX2 transcrição não é activa . Experiências adicionais revelaram que a transfecção em células MKN45 e AGS com o constructo pCOX2-0.8, que tem 859 pb suprimidos a partir da 1,6 Kb pCOX2 repórter (Figura 4A), resultou num aumento significativo na actividade de promotor quando comparado com o repórter pCOX2-1.2 (Figura 4A-C). Como não foram observadas diferenças significativas entre os 1,6 Kb pCOX2 e construções pCOX2-1.2 (Figura S3), não efectuar análises suplementares com a construção maior. Importante, pCOX2-0.8 representado o fragmento do promotor de tamanho mínimo que exibe a actividade máxima basal, uma vez que mais de deleção quer 159 ou 370 pb a partir da extremidade 5 ', como é o caso com o pCOX2-0.65 ou construções pCOX2-0.4, respectivamente , diminuiu mais de 2 vezes os níveis de atividade basal pCOX2. Estes resultados indicam que a região compreendida entre 0,8 e 0,65 Kpb a montante do TSS do gene COX2, e que inclui um elemento de resposta a novel TBE (TBE O sítio II; -689 /-684), pode ser um componente chave durante a regulação da o nível basal de expressão de genes COX2 em células GC.

regulação positiva de pCOX2-0.8 via Wnt /β-catenina sinalização

a seguir, analisou o efeito da sinalização de Wnt /β-catenina na novela O sítio II TBE. Nós transfectadas células MKN45 com a construção repórter pCOX2-0.8 e co-expressa a proteína activa constitutiva β-catenina S33Y observar que houve uma (duas vezes) melhoria significativa da actividade de transcrição de pCOX2-0.8. Este aumento β-catenina mediada era específica uma vez que a construção pCOX2-0.4 não foi estimulada nesta β-catenina sobre-expressão de condição (Figura 5A e B). Para controlar a sinalização de Wnt /β-catenina em células MKN45 foi utilizado o /β-catenina SuperTOPFLASH responsivo (STF) repórter Wnt transportar 12 cópias de um TBE em conjunto [32], que foi transfectado sozinho ou na presença do plasmídeo que codifica para a proteína mutante S33Y β-catenina. Curiosamente, enquanto que a co-expressão com a proteína β-catenina S33Y mutante em células MKN45 foi capaz de aumentar (1,9 vezes) a actividade do repórter STF, níveis elevados de actividade STF basal foram detectados na ausência do β-catenina mutante (Figura 5C). Este resultado está de acordo com nossas descobertas anteriores de altos níveis de β-catenina nuclear endógena neste tipo de células (ver Figura 1B), e confirma que este factor nuclear é funcional. Para confirmar ainda mais este achado, foi realizada experiências idênticas em células HEK293 e obtidos resultados essencialmente semelhantes, embora, neste caso, uma curva de dose-resposta claro foi obtido quando pCOX2-0.8 foi transfectado na presença de concentrações crescentes do constitutivamente activa β-catenina S33Y proteína (Figura S4). Além disso, verificou-se que a actividade STF em células HEK293 que era altamente sensível aos níveis do mutante exógeno β-catenina (Figura S4C).

Para explorar ainda mais os efeitos da via /β-catenina Wnt na actividade do pCOX2-0.8 foram realizadas experiências de perda de função com um TCF4 negativo dominante (ΔTCF) construir, que codifica para um factor de transcrição faltam 30 resíduos a partir do seu terminal amino e que é incapaz de se ligar β-catenina [32] . Nós descobrimos que em células MKN45 ΔTCF expressão reduzida dos elevados níveis de transcrição basal pCOX2-0.8 de um modo dependente da dose (Figura 5D). Este resultado confirma o papel fundamental dos fatores de transcrição TCF /LEF entre os reguladores da actividade da sequência do promotor pCOX2-0.8, e ainda apoia a ideia de que o TBE site II (-689 /-684) está envolvido na resposta ao Wnt /sinalização β-catenina.

Finalmente, para tratar directamente a função do sítio II em TBE Wnt regulação /β-catenina mediada do promotor COX2, que introduzido por mutagénese dirigida ao local de uma alteração na chave de dois nucleótidos da sequência de consenso do núcleo TBE o sítio II (isto é, pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Estas alterações têm sido mostrado previamente para suprimir a transcrição de Wnt /β-catenina mediada por [39]. estudos de transfecção transitória revelou que a mutação do sítio II TBE diminuiu significativamente (2-3 vezes) da actividade basal de pCOX2-0.8 construir em células MKN45 (Figura 5E), quando comparado com o tipo selvagem construção do promotor pCOX2-0.8. Além disso, e de acordo com os nossos resultados anteriores, a mutação deste local TBE II quase completamente bloqueada β-catenina mediada por aumento do construto pCOX2-0.8 (Figura S4). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o sítio II TBE (-689 /-684) é um componente funcional na regulação da transcrição do gene da COX2.

β-catenina se liga à região promotora do gene da COX2 contendo o sítio II TBE

Como uma conformação transcricionalmente activo da estrutura da cromatina é reflectido por um elevado nível de acetilação da histona [51], que precipitou fragmentos de ligação cruzada de cromatina (tamanho médio de 300-500 pb) isolado a partir de células MKN45 usando anticorpos policlonais específicos para H3 histonas acetiladas e H4. Da mesma forma, foi detectada a ligação de ARN polimerase II (pol II) como um parâmetro normalmente associada com a actividade de transcrição. Nós examinamos o enriquecimento em nossas precipitados de duas sequências de promotor: promotor proximal região (PP) (-118 /+ 62 do TSS) e na região distal (-793 /-594) do promotor COX2 contendo o local de consenso TBE II ( -689 /-684). Em particular, o sítio II TBE foi alvo uma vez que experiências anteriores indicaram uma ligação preferencial de β-catenina a esta região promotora (Figura S5). Como um controlo positivo, foi avaliada de ligação no local do TBE no promotor do gene c-myc (-1447 /-1144 de SST), que foi previamente descrito em células de cancro do cólon [38].

acetilado histonas H3 e H4 e a enzima polimerase II foram encontrados para se ligar dentro da região promotora proximal (Figura 6A), o que indica que a estrutura da cromatina em torno do promotor COX2 em células MKN45 é em uma conformação aberta, assim, de acordo com os nossos resultados anteriores demonstram que o gene COX2 é transcrever de forma activa. Notavelmente, a proteína β-catenina foi imunoprecipitada a partir de amostras MKN45 principalmente em associação com a região do promotor abrangendo a sequência de TBE -684 /-689 no gene da COX2 (Figura 6B). Este factor foi quase não detectável na região promotora proximal, indicando que endógena β-catenina nuclear é recrutado principalmente para o TBE O sítio II nestas células GC. Como esperado, endógena β-catenina foi semelhante ligado ao sítio promotor TBE c-myc, em níveis que são comparáveis ​​às observadas no promotor do gene COX2 (Figura 6C).

Colectivamente, estas experiências indicam que o TBE o sítio II está directamente envolvida na activação da transcrição mediada por β-catenina do promotor COX2. Para confirmar ainda mais estes resultados, realizados ensaios de deslocamento da mobilidade electroforética (EMSA) em extractos nucleares de células MKN45. Para isso, preparou 34 oligonucleotídeos baseados em emparelhado; uma contendo o tipo selvagem -689 /-684 TBE sequência do sítio II (isto é, CTACAAAGA; resíduos sublinhados representando o núcleo), e dois oligonucleótidos contendo as mutações missense quer no núcleo da TBE O sítio II (isto é, CTACGAGGA: TBE-Mut1) ou na sequência flanqueadora (isto é CGCCAAAGA: TBE-Mut2), como relatado anteriormente [21], [39]. Como mostrado na Figura 6D, a sonda TBE de tipo selvagem marcado radioactivamente foi capaz de formar complexos de ADN-proteína retardadas quando incubados com extractos nucleares de células MKN45. Estes complexos proteína-ADN eram específicos uma vez que a adição de um excesso de oligonucleótidos do tipo selvagem frio (50 vezes) inibiu drasticamente a formação do complexo DNA-proteína (Figura 6D, pista 3 e 4, respectivamente). A sonda radiomarcada mutante TBE-Mut1 foi nem capaz de formar complexos de ADN-proteína por si só, nem para competir com o oligonucleótido de tipo selvagem, quando adicionado em excesso como uma sonda fria (Figura 6D, pista 5 e 6, respectivamente). Resultados semelhantes foram obtidos quando a segunda sonda de TBE-Mut2 frio foi utilizado como um competidor (Figura 6D, pista 7). No seu conjunto, estes resultados demonstram que a nova TBE O sítio II no promotor COX2 está envolvida na activação da transcrição do gene COX2 recrutando o mecanismo responsável pela transdução de Wnt /β-catenina sinalização (Figura 6E).

Discussão

estudos anteriores sugeriram um papel para a sinalização de Wnt /β-catenina durante o aparecimento e /ou ao desenvolvimento de vários tipos de cancro através da modulação da expressão do gene COX2 [25]. Neste trabalho nós apresentamos forte evidência apoiando um papel direto para a sinalização de Wnt /β-catenina no controle da expressão de COX2 em células GC. Primeiro, demonstrámos que há uma forte correlação entre a expressão de COX2 e o conteúdo nuclear de β-catenina, o que parece ser independente de qualquer malignidade ou estado de transformação de células de CG. Em segundo lugar, o aumento tempo e dose-dependente da expressão de COX2 foi observado logo após a indução (2 h) com ou compostos farmacológicos que imitam a sinalização de Wnt /β-catenina. Em terceiro lugar, os ensaios de gene repórter que avaliam a actividade do promotor da COX2 em resposta a gain- e perda de função experiências, incluindo uma proteína β-catenina constitutivamente activa e o factor de transcrição TCF4 negativo dominante, demonstram que os componentes /β-catenina Wnt estão envolvidos na a regulação da transcrição do gene COX2

também mostrámos aqui que, dentro de 2 Kpb a montante do promotor COX2 humano existem quatro locais putativos TBE. (núcleo: CTTTG), um dos quais foi previamente estudadas por Araki e cols [21], [28]. Através de ensaios de gene repórter com diferentes construções pCOX2 supressão mostramos que pCOX2-0.8 apresentou a maior atividade transcricional basal nas células GC MKN45 e AGS. Curiosamente, pCOX2-0.8 manteve a TBE Site-II (-689 /-684) integridade indicando o seu contributo essencial para a regulação da actividade de transcrição do gene COX2. Notavelmente, a completa pCOX2 TBE O sítio II assinatura (isto é, 5'-WWCAAAGS-3 '; S = C /G; W = A /T), assemelha-se ao site de TCF óptima descrito por Van de Wetering e cols. [52], que foi posteriormente usado para identificar alvos Wnt-transcricional genuínos no Drosophila
genes NKD
e CG6234
[53].

funcionalidade desta TBE site II também foi confirmada por nossos estudos de mutagénese. Assim, quando a sequência mutada TBE-assinatura para o construto pCOX2-0.8 (MpCOX2-0.8), verificou-se que a actividade do promotor basal COX2 foi significativamente afectada em células MKN45. Além disso nosso chip e EMSA análises confirmaram que β-catenina é preferencialmente recrutados para a região promotora da COX2 -689 /-684 GC em células, a um nível semelhante ao encontrado no promotor c-myc [38]. Tal interacção ocorre preferencialmente nesta região do promotor do gene COX2 como não β-catenina é encontrado para se ligar à região promotora proximal do gene COX2. Em conjunto estes resultados indicam que o TBE O sítio II é um elemento de resposta de Wnt /β-catenina funcional dentro do promotor humano da COX2. Nossos dados, no entanto, não exclui a contribuição de outras regiões genômicas no gene COX2 humana [21]. Em vez disso, propõe-se que, em células GC uma complexa teia de interações está presente onde a TBE site II coopera com outros elementos de resposta para regular a expressão COX2.

Como os nossos resultados em células de GC estão de acordo com aqueles relatados para as células do cancro do cólon, é tentador especular que a sinalização de Wnt /β-catenina pode ser semelhante envolvida na regulação de COX2 em outros tumores [21], [28]. Com efeito, níveis moderados a fortes proteína de β-catenina pode ser observado em ca. 72% de todos os cancros analisados ​​na base de dados de proteína de tecido Atlas humano [54]. Da mesma forma, forte a moderada coloração citoplasmática e COX2 membranosa reactividade ocasional é observada em 50% de todos os cancros, incluindo o colorrectal, da próstata, do colo do útero, do endométrio, urotelial, pâncreas, fígado e nas células glandulares de tecido de tumor gástrico.

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