PLoS ONE: N-myc nizvodno regulirani Gene 1 (NDRG1) promiče metastazu ljudskih Scirrhous želudac stanica raka kroz epitelne mczcnhimnog Transition

Sažetak pregled

Naša nedavna studija pokazala je da veći izraz N-myc regulirani gen 1 ( NDRG1) usko je povezana s lošom prognozom u bolesnika s rakom želuca. U ovom istraživanju, pitali smo da li NDRG1 ima ključnu ulogu u malignim napredovanje uključujući metastaze želučanih stanica raka. Do genske ekspresije microarray izražavanja analiza od NDRG1 pokazali veći rast među ukupno 3691 up-reguliranih gena u vrlo metastatskim rakom želuca stanične linije (58As1) od roditeljskog niske metastatskim kolegom (HSC-58). Stanične linije vrlo metastatski pokazala smanjena ekspresija E-kadherina, zajedno s povećanom ekspresijom vimentin i puž. Ovaj smanjena ekspresija E-kadherina obnovio je puž obaranje u vrlo metastatskih staničnim linijama. Mi smo sljedeći uspostavljen stabilan NDRG1 obaranje stanične linije (AS1 /Sic50 i AS1 /Sic54) iz stanične linije visoko metastatskog, a obje ove stanične linije su pokazali pojačani izražaj E-kadherina i smanjena ekspresija vimentin i puž. A isto tako, utvrđeno je aktivnost luciferaze E-kadherina promotor-driven se uvećava za NDRG1 obaranje u staničnoj liniji visoko metastatskog. NDRG1 obaranje u želučanom stanici raka pokazali potisnut invaziju stanica raka u surround tkiva potisnut metastaza u peritoneum i smanjena nakupljanje ascitesa kod miševa s značajno poboljšanim preživljavanja. Ovo je prvo istraživanje koje pokazuje da NDRG1 igra svoju ključnu ulogu u malignim progresiju raka želuca kroz epitelne mczcnhimnog tranzicije pregled

Izvor:. Ureshino H, Murakami Y, Watari K, Izumi H, Kawahara A, Kage M et al. (2012) N-myc nizvodno regulirani Gene 1 (NDRG1) promiče metastazu ljudskih Scirrhous želudac stanica raka kroz epitelne mczcnhimnog tranziciji. PLoS ONE 7 (7): e41312. doi: 10,1371 /journal.pone.0041312 pregled

Urednik: Rakesh K. Srivastava, Sveučilište u Kansas Medical Center, Sjedinjene Američke Države Netlogu

Primljeno: 8. prosinca 2011; Prihvaćeno: 22. lipnja 2012; Objavljeno: 23. srpnja 2012 pregled

Copyright: © 2012 Ureshino et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ova studija bio podržan od grant-in-potpore za istraživanje raka iz Ministarstva obrazovanja, kulture, športa, znanosti i tehnologije Japana (dr Ono), a upravljački Research 3. Pojam sveobuhvatnoj za rak iz Ministarstva zdravstva, rada i socijalne skrbi Japana (Dr. Kuwano). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je jedan od najčešćih malignih bolesti u Japanu i drugim azijskim zemljama. Prognoza pacijent scirrhous želučanog karcinoma je posebno loša. Scirrhous karcinom želuca je često popraćena peritonejskom širenja i metastaze limfnih čvorova i jetre, koji su ozbiljni problemi koje treba kontrolirati. Ekspresije gena profil otkriva genske amplifikacije K-Sam i c-Met 30-40% scirrhous želučanog karcinoma, te da je prekomjerna ekspresija različitim faktorima rasta, kao što je transformirajući faktor rasta-B (TGF-P), rasta iz trombocita- faktor (PDGF), inzulinu-sličan faktor rasta (IGF) i faktor rasta fibroblasta 2 (FGF-2) [1]. Nedavna analiza DNK mikropostrojima pokazala specifičnu regulaciju na gore nekoliko gena, uključujući SPARC Netlogu, RGEIII pregled, S100A10 pregled i kolagen tipa I [2] - [4].

Životinjski modeli koji odražavaju karakteristike zloćudni peritonitisa i metastaze na peritoneum su važna u razumijevanju razvoja malignih progresija od raka želuca. Yanagihara i sur.
[5] Prvi je osnovala stanične linije HSC-58 iz ljudske scirrhous raka želuca, a zatim osnovala dvije sublini, 58As1 i 58As9, s visokim potencijalom za peritonejsku širenje i limfnih čvorova metastaze ponovljenim ortotropnih inokulacija HSC-58 stanica u želučanu stijenku atimičnih miševa [6], [7]. Ovi podlinije često uzrokuju nakupljanje ascitesa nakon ortotropnih implantacije i pokazuju povećanu ekspresiju gena koji kodiraju proteazu i proteina koji su uključeni u staničnu adheziju, staničnu pokretljivost, proliferacije i angiogeneze [6]. Oni također rastu selektivno u želučanoj submukozi i upasti u dublji sloj do serozne ravninu želuca [7]. Međutim, ostaje nejasno zašto su stekli takav visok potencijal za metastaziranje tijekom selekcije. Pregled

U ovoj studiji, koristili smo ove visoko metastatskih stanične linije istražiti kako ljudski želučane stanice raka mogu steći metastatski potencijal. Mi smo prvi u usporedbi profila genske ekspresije između visoko metastatskih i niske metastatskih roditeljske stanične linije microarray analize. Mi smo usmjereni na jedan gen nazvan N-myc nizvodno regulirani genski 1 (NDRG1), jer je utvrđeno da je znatno reguliran u visoko metastatskog staničnih linija raka želuca u odnosu na njihov sličnost stanice. Također je ranije izvijestio da NDRG1 izraz bio predikatska marker za maligne napredovanje i lošom prognozom u želučanih bolesnika [8]. U skladu s ovom istraživanju, primijetili smo da visoka NDRG1 ekspresija je značajno koreliraju s angiogeneze tumora i zloćudnih napredovanja zajedno s lošom prognozom kod raka želuca [9]. Mi također izvijestio da NDRG1 obaranje navede smanjena proizvodnja snažnih angiogenih faktora i tumorske angiogeneze stanice raka pluća, kao i to da NDRG1 je prediktivni marker za tumorske angiogeneze i lošom prognozom u bolesnika s ne-malih stanica raka pluća [10]. NDRG1, jedan od četiri obitelji NDRG gena, tako da pokazuju različite funkcije [11] i NDRG1 funkcije bilo kao metastaze odvodnika ili kao onkogene i malignih promotora, ovisno o vrsti tumora [11], [12]. Nadalje, izraz NDRG1 gena usko je pod kontrolom N-myc i srodnih obitelji proteina myc [13] i prekomjernu ekspresiju c-myc induciranih epitela mczcnhimnog tranziciji (EMT) u epitelnim stanicama sisavca [14]. Važna uloga EMT često spominju u neposrednoj kontekstu razvoja i napredovanja tumora uključujući metastaze raka [15], [16]. Međutim, u ovim studijama je regulacijska uloga NDRG1 nije analiziran. U ovoj studiji istraživali smo metastatski potencijal želučanih stanica raka po svojoj povezanosti s EMT-based uloge NDRG1. Pregled

Rezultati

Usporedba rasta stanica, stanične morfologije, rasta tumora, diseminacije i Gene Expression Profili između visoko metastatskim rakom želuca staničnih linija i njihove niske Metastatski hrvatske strane pregled

u skladu s prethodnim istraživanjima [6], [7], a visoko metastatskog karcinoma stanične linije 58As1 i 58As9 pokazala više stope rasta nego njihova roditeljska kolega, HSC-58, uz udvostručenje vremena 23-26 sati u usporedbi s 30 sata za roditeljskih stanica (Slika 1A). 58As1 stanice su lako odvojiti i prikazuju rast suspenzija tipa stanica s okruglim morfologiju, a HSC-58 i 58As9 stanice su vezani, te su pokazali slojevitu rasta stanica s fibroblastičnom morfologijom (Slika 1B). Oba 58As1 i 58As9 stanice pokazuju puno veće brzine rasta tumora u modelu ksenografta subkutanog odnosu na roditeljske HSC-58 stanice (Slika 1C). Prethodna istraživanja pokazala su da je ortotropnih transplantacija 58As1 stanica izazvana znatno veću akumulaciju peritonejsku diseminacija i ascitesom nego što HSC-58 stanica [6], [7]. Se dalje potvrdila peritonealnoj širenje stanica ih usađivanje u peritonealnu šupljinu miševa. Miševi kojima je usađen 58As1 stanica pokazuje pojavljivanje u prosjeku za 8 ± 3 vidljivih čvorića u mesenterium svakog miša i akumulacije ascitesa (u rasponu od 0.7-2.5 ml /miš) (Slika 1D, E). Nasuprot tome, miševi implantirani roditeljskim HSC-58 stanica pokazuje nastajanje malo, ako bilo sitnih čvorića i bez ikakvog nakupljanje ascitesa. Pregled

Mi smo sljedeći odnosu profila genske ekspresije između 58As1 stanica i njihove roditeljske kolegom HSC- 58, pomoću DNA microarray analize. Od 41.000 RNK transkripta i varijantama, identificirali smo 3691 diferencijalno eksprimirani geni koji su visoko regulirana kako 2-puta i 3536 gena koji su regulirani na 0,5-struko manje ili u 58As1 stanicama u odnosu na HSC-58 stanica. Slika 1F prikazani gene koji su različito izraženih u 58As1 stanicama u odnosu na HSC-58 stanica ograničene na one koje pripadaju obitelji NDRG i gena koji se odnose na metastaze, uključujući metaloproteinaza matriksa (MMP) /katepsina, adhezije i epitelnih-mezenhimalnog-prijelaza ( EMT). Od četiri gena u obitelji NDRG [17], je ekspresija NDRG1 i NDRG4 je reguliran u vrlo metastatskom stanične linije (58As1) u odnosu na staničnu liniju (HSC-58). Ekspresija EMT-vezanih gena u 58As1 stanica posebno je utjecalo stjecanje visoke metastaziranja. Ekspresija gena epitela specifičan, uključujući i E-kadherina ( CDH1 pregled), P-kadherina ( CDH3 pregled) i β-katenina ( CTNNB1 pregled), bio regulirani , Nasuprot tome, samo MMP1 ( MMP1 pregled) izraz je izrazito regulira prema gore; ekspresija katepsina L ( CTSL1 pregled) je povećan, ali da katepsina B ( CTSB
) nije bio. Ekspresija gena mezenhimu specifičan, vimentin ( VIM
) i puž ( SNAI1 pregled), ključni faktor transkripcije za suzbijanje ekspresije E-kadherina, bio regulira prema gore. Pregled

Poboljšana NDRG1 Gene Expression u Visoko metastatskim rakom želuca staničnim linijama

Mi dalje u odnosu na ekspresiju proteina nekoliko gena u HSC-58, 58As1 i 58As9 stanice (slika 2A). Ekspresija NDRG1 značajno je povećan, i da vimentin, puž, p-ERK1 /2, p-Akt i p-GSK-3β se također povećava, u oba 58As1 i 58As9 stanicama u usporedbi s HSC-58 stanica. Nije zamjećen izraz Wnt3a i Wnt5a u tim staničnim linijama (podaci nisu prikazani). S druge strane, gledali smo smanjena ekspresija E-kadherina i beta-katenina u 58As1 i 58As9 stanicama u usporedbi s HSC-58 stanice (Slika 2). Fosforilacija P-katenina Ser33 /37 i Ser552 je utvrđeno da je mnogo manje u 58As1 i 58As9 nego HSC58. U skladu s razinama ekspresije proteina, mRNA ekspresijskih razina NDRG1, vimentin, puževa i MMP-1 bila je veća u obje vrlo metastatskim stanicama od roditeljskog kolega (Slika 2B). Bilo je mnogo manje mRNA ekspresija E-kadherina i beta-katenina u oba 58As1 i 58As9 od HSC-58. Pregled

Imunocitokemijska analiza je pokazala da lokalizacija E-kadherina, kako u citoplazmi i membrane i beta-katenina je uglavnom lokaliziran u citoplazmi u oba HSC-58 i 58As9 stanica (Slika 2c). Imunocitokemijsku analiza za 58As1 ne može biti izvedena kao 58As1 raste u suspenziji. Nadalje, izraz P-katenina bio relativno manji u oba citoplazme i jezgre, ali onaj puž je utvrđeno da je mnogo veći u jezgri 58As1 i 58As9 od HSC-58 (Slika 2D). Također smo ispitali E-kadherina aktivnost promotora (Slika 2E) i β-katenina inducirana aktivnosti dobivene od strane TopFlash reporter testa (Slika 2F) i utvrdili da je značajan pad u aktivnosti luciferaze vozio promotora E-kadherina, a također i beta-katenina u oba 58As1 i 58As9 usporedbi s HSC-58, u skladu s razine mRNA oba gena. pregled

NDRG1 obaranje inducira u povećanju E-kadherina i silazni vimentin i puž u Visoko metastatskih stanica pregled

Dalje smo ispitali da li NDRG1 obaranje posebno utjecale na izražavanje EMT-vezanih gena u visoko metastatskog stanične linije, 58As1. Utvrdili smo dva stabilna NDRG1 obaranje staničnih klonova, AS1 /Sic50 i AS1 /Sic54 transfekcijom NDRG1 shRNA u 58As1 stanice. Oba AS1 /Sic50 i AS1 /Sic54 stanice pokazuju slične stope rasta jedni druge i njihove roditeljske kolegom AS1 /Mock3, uz udvostručenje vremena 25-27 sati u kulturi (Slika 3A). Oba NDRG1 silenced stanične linije pokazala čvrstu adhezije stanice na posudu za kulturu i fibroblastične morfologije, dok AS1 /Mock3 stanice pokazuju rast suspenzija tipa stanica s okruglim stanične morfologije (slika 3B). Potom smo ispitali učinak NDRG1 ušutkavanja na tumorskih aktivnosti 58As1 stanica korištenjem analize rasta sidrenje neovisan. Oba NDRG1 ušutkao stanične linije su pokazali značajno smanjenje njihovog sidrenja neovisan rast, kao što je označeno brojem kolonija u mekom agaru ( ^{* p < pregled, 0,01). (Slika 3C) pregled}

Tada usporedili smo profila genske ekspresije između AS1 /Mock3 i AS1 /Sic50 stanice pomoću DNA microarray analize (slika 4a). NDRG1 obaranje rezultiralo povećanjem ekspresije E-kadherina ( CDH1 pregled) i P-kadherina ( CDH3
), ali smanjenom ekspresijom vimentin ( VIM
) i puž ( SNAI1 pregled). Sljedeće smo izvodi western blot i QRT-RCR analiza za nekoliko molekula koje su modulirane NDRG1 obaranje u analizi mikropolja (Slika 4B, C). Navedene dvije stanične linije pokazao znatno manju ekspresiju i NDRG1 mRNA i proteina u odnosu na AS1 /Mock3 stanica. Poboljšana ekspresija E-kadherina dosljedno zabilježeno je u AS1 /Sic50 i AS1 /Sic54 stanica u odnosu na AS1 /Mock3 stanica Western blot analizom. U AS1 /Sic50 i AS1 /Sic54 stanica, i Western blot i QRT-PCR analiza potvrdila smanjena ekspresija vimentin i puž bez utjecaja na ekspresiju p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-Akt, Akt, p-GSK-3β i GSK-3β (Slika 4B, C). pregled

s druge strane, NDRG1 dobro poznato da suprimira metastaze i staničnu proliferaciju prostate i raka debelog crijeva. Novija istraživanja pokazala su da NDRG1 modulira Wnt-β-katenina signalni put povećanu ekspresiju E-kadherina u humanoj prostati i raka debelog crijeva stanica [18], [19]. Međutim, NDRG1 obaranje na 58As1 stanicama ne utječu na ekspresiju β-katenina i na razini proteina i mRNA razina (Slika 4B, C). I također β-katenina upravljan promotor aktivnost po TopFlash reporter testu pokazala nikakva razlika u promotorske aktivnosti između AS1 /Mock i NDRG1 ušutkan stanične linije. Prema tome, izraz β-katenina nije bio pod utjecajem NDRG1 obaranje. NDRG1 obaranje tako kontinuirano raste ekspresije E-kadherina i smanjena ekspresija puževa i vimentin u staničnoj liniji visoko metastatskog. Međutim, nije bilo očito promjena u izrazu P-katenina by NDRG1 obaranje. Pregled

Poboljšana E-kadherina Promotor Aktivnost po NDRG1 obaranje kroz puž u rak želuca stanicama pregled

raznih faktora transkripcije koji potiskuju ekspresija E-kadherina, uključujući puž, cjevčica, Twist, TCF4 i SIP1 [20], izraz puž je posebno modulirana NDRG1 u želučanim stanicama raka. Ispitali smo je li ekspresija E-kadherina i /ili vimentin može se regulirati puž u HSC-58 stanica. Prolazno liječenje puž siRNA rezultirala je povećanom ekspresijom E-kadherina, ali ne i onaj vimentin i NDRG1, u vremenski ovisan način (slika 5A). Postojao je samo neznatno ako je bilo povećanje β-katenina izražavanja puž obaranje. Nadalje, aktivnosti E-kadherina promotor-driven luciferaza značajno potisnuti transfekcijom puž komplementarne DNA u dvije stanične linije karcinoma ispitanih (Slika 5b). Potom smo u odnosu aktivnost promotora E-kadherina između AS1 /Mock3 i njegovih NDRG1 ušutkan staničnim linijama. Kao što se vidi na slici 5C, postojala je značajna (* p izvoznici < 0,05) povećanje E-kadherina promotorske aktivnosti po NDRG1 obaranje pregled

GSK-3β je ključni enzim za aktivaciju EMT. put [20], [21], te za fosforilaciju NDRG1 [22], [23]. Ekspresija p-GSK-3β povećan u liniji stanica vrlo metastatskog, 58As1 (vidi Sliku 2A). Ispitali smo je li GSK-3β je bio uključen u NDRG1 inducirane promijenjena ekspresija E-kadherina i vimentin. Liječenje s inhibitorom (CT99021) GSK-3β dovodi do smanjene ekspresije P-NDRG1 i p-GSK-3β, te povećana ekspresija E-kadherina i beta-katenina na 58As1 stanica (Slika 5D). Kao što je prikazano na slici 5E, β-katenina obaranje nije utjecao na izražavanje E-kadherina, vimentin i puž. Pregled

NDRG1 obaranje izaziva mczcnhimnog epitela u tranziciji i potiskuje metastaze na peritoneum visoko metastatskim rakom želuca stanica pregled

Ako usporedimo brzine rasta tumora u AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 i AS1 /Sic54 stanica u modelu ksenografta otkrila sporije brzine rasta tumora oba AS1 /Sic50 i AS1 /Sic54 by NDRG1 obaranje (Slika 6A, B). NDRG1 obaranje potisnut lokalnu invaziju AS1 /Mock3 tumorskih stanica u okolno strome i susjedne masnog tkiva i /ili mišićno tkivo, i inkapsulirani rast tumora (Slika 6c). Visoka ekspresija E-kadherina se promatra u AS1 /Sic50 i AS1 /Sic54 tumora, dok je visoka ekspresija vimentin opažena u stanicama karcinoma AS1 /Mock3 tumora (Slika 6D). Za razliku od toga, nije bilo gotovo nikakve promjene u ekspresiji beta-katenina u AS1 /Sic50 i AS1 /Sic54 tumora u usporedbi s AS1 /Mock3 tumora. Pregled

Kako bi ispitati da li NDRG1 obaranje može utjecati na metastaziranje na peritoneum i akumulacije ascitesa, usporedili smo metastatski potencijal AS1 /Sic50 i AS1 /Mock3 stanica nakon ortotropnih transplantacije. Slika 7A prikazuje reprezentativne slike povećanog trbušnoj šupljini i prisutnost grumena raka u peritoneum. Nakon ortotropnih inokulacije AS1 /Sic50 stanica, broj kvržica se pojavljuju u peritoneum bio je oko 30% manje od onih koji proizlaze iz AS1 /Mock3 stanica, ali to smanjenje nije bilo statistički značajno ( p pregled = 0.21) (Slika 7B). Međutim čvorići koji proizlaze iz AS1 /Sic50 stanicama pokazali mnogo manje veličine od one iz AS1 /Mock3 stanica (Slika 7A). Nakupljanje ascitesa po AS1 /Sic50 stanica bila je značajno (* p 0,01) smanjila na oko 10% od one koja je inducirana AS1 /Mock3 stanica (Slika 7c). Osim toga, došlo je do značajnog (* p izvoznici < 0,01) povećanje stope preživljavanja miševa kojima AS1 /Sic50 stanica (51 ± 16 dana) u usporedbi s 35 ± 14 dana miševa kojima AS1 /Mock3 stanice, što znači da NDRG1 obaranje produžuje život (Slika 7d). pregled

Rasprava pregled

Mi smo ranije izvijestili da NDRG1 je usko povezano s tumorske angiogeneze i slabe preživljavanje u bolesnika s karcinomom želuca, što ukazuje da NDRG1 je prediktivni biomarkera za maligne progresiju raka želuca [9]. Iz ovoj studiji, zapazili smo slijedeće osobine na kojima se temelji stjecanje visoke metastatskog potencijala u rak želuca: microarray, Western blot i RT-PCR analize zajedno otkrila reguliranje prema NDRG1 u vrlo metastatskim stanicama, 58As1 i 58As9, u usporedbi s njihovim niska metastatski roditeljska kolega HSC-58; viši izraz vimentin, puž, i MMP-1, i manje ekspresije E-kadherina i beta-katenina su očito u vrlo metastatskim stanicama u usporedbi s njihovom roditeljskom kolegom; gena regulirani u staničnoj liniji visoko metastatskog, NDRG1 obaranje rezultiralo ranijim koracima E-kadherina i silazni vimentin i puž, ali gotovo da nema učinka na ekspresiju P-katenina; Aktivnost E-kadherina promotor bio je značajno uvećan NDRG1 obaranje; NDRG1 obaranje također potisnut peritonealnoj širenje i nakupljanje ascitesa i invaziju vrlo metastatskih stanica u okolnim normalnog tkiva. Pregled

U ovom istraživanju, NDRG1 obaranje rezultiralo suzbijanje metastaza strane visoko metastatskih stanica karcinoma želuca (slika 6 , 7), što ukazuje da NDRG1 može biti metastaza promotor gena, a ne supresorski gen metastaza kod raka želuca. Naše je istraživanje snažno podupire ideju da li promovira NDRG1 ili potiskuje maligne napredovanje ljudskog raka ovisi o vrsti tumora i /ili diferencijacija status [11], [12]. Međutim, ostaje nejasno zašto NDRG1 djeluje kao supresor tumora ili promotora, ovisno o vrsti tumora ili histoloških tipova. Naša prethodna studija pokazala je da NDRG1 suprimira tumorski rast i angiogenezu raka gušterače putem NDRG1 pokretanog atenuacije NF-kB signalnog puta [24], [25]. Nedavna studija je izvijestio da je ekspresija metastaza supresorski gen, KAI1 pregled gena koji su uključeni u NDRG1 posredovane metastaza suzbijanja raka prostate kroz ATF3-NF-kB puta [26]. Daljnje istraživanje je potrebno razumjeti što regulatorni mehanizam je posebno odgovoran za NDRG1 pokreće promociju malignih progresija od strane želuca stanice raka. Pregled

EMT je nedavno vrhunac koji bi mogao biti usko povezan s rakom malignim progresijom, uključujući stjecanje visoko metastatskog potencijala [15], [16]. U ovoj studiji, NDRG1 obaranje pojačana ekspresija E-kadherina i potisnuti izražavanje vimentin i In vitro pregled i in vivo pregled. NDRG1 može igrati ključnu ulogu u kontakt s polariziranog epitela fenotipa do visoko pokretnih mczcnhimnog fenotipa. Djelomična ili potpuni gubitak E-kadherina često promatraju tijekom napredovanja prema malignosti u brojnim tumorima, uključujući rak želuca [27], [28]. Oliveira et al. [29] izvijestili usku povezanost između gubitka E-kadherina i visoke metastatskim potencijalom karcinoma želuca. Chan i sur. [30] Također je izvijestio topljivi E-kadherina kao biomarkera za produženo preživljavanje pacijenata s rakom želuca. NDRG1 obaranje rezultirala relativno visoku ekspresiju E-kadherina u AS1 /Sic50 tumorima nego u AS1 /Mock3 tumorima, što sugerira da NDRG1 mogu posebno kontrolirati EMT eventualno putem transkripcijskog faktora puža u želucu stanica raka (Slika 7e). Pregled

Wnt signalni ima ključnu ulogu u malignim napredovanje i metastaziranje pluća i dojke stanica raka [31], [32], a Wnt signalni također uzrokuje EMT koji uključuje metastatskog napredovanje epitelnog raka [31], [33]. NDRG1 poznat kao supresorskog gena metastaza kod prostate i rak debelog crijeva stanica [11], [12]. Liu et al [18] je izvijestio da NDRG1 potiskuje metastaza kroz Wnt /β-katenina signalnog puta u stanicama raka prostate. Relevantna studija Chen et al [19] Također je pokazano da NDRG1 modulira TGF-ß-inducirana EMT kroz promijenjena ekspresija P-katenina i E-kadherina u debelog stanici raka. Naše je istraživanje pokazalo je smanjena ekspresija P-katenina u oba vrlo metastatskim stanicama u odnosu na roditeljsku kolegom HSC-58. Međutim, i Western blot i QRT-PCR analiza nije pokazala značajne promjene u razinama ekspresije beta-katenina i također β-katenina pokreće promotorske aktivnosti između visoko metastatskih 58As1 stanica i njegovih dvoje NDRG1 prigušivačem staničnim linijama. Čini manje vjerojatnim da β-katenina igra ključnu ulogu u suzbijanju metastaziranje NDRG1 obaranje na visoko metastatskim stanicama raka. Pregled

S druge strane, GSK-3β je također poznato da imaju ulogu u kontroli EMT [20], [21], i GSK-3β je bitan enzim za fosforilaciju NDRG1, izvrstan substate GSK-3β [22], [23]. Ekspresija p-GSK3β je razmjerno veći u visoko metastatskim stanicama nego njihove parentalne stanične linije (Slika 2B). Liječenje s moćan inhibitor GSK-3β rezultirao potisnuti ekspresiju p-NDRG1 pratnji upregulation E-kadherina i beta-katenina (Slika 5D). Međutim, nije bilo gotovo nikakve razlike u ekspresiji GSK-3β i p-GSK-3β by NDRG1 obaranje u vrlo metastatskih stanica (slika 4b), što ukazuje da je GSK-3β ne može igrati važnu ulogu u indukciji EMT kroz NDRG1 u želučanim stanicama raka. pregled

puž je zastupnik transkripcijski faktor koji regulira ekspresiju E-kadherina [20]. Različitih regulatornih faktora koji kontroliraju transkripcijski E-kadherina, ekspresija puž posebno moduliran NDRG1 u želučanim tumorskih staničnih linija koje su korištene u ovoj studiji. Puž obaranje izazvana uzlazni E-kadherina (Slika 5a) i egzogene tarnsfection od puž cDNA potiskuje E-kadherina aktivnost promotora (Slika 5b). Pregled

U vrlo metastatskih staničnim linijama karcinoma želuca, izraz puž se regulira prema gore kao u odnosu na njihove niske metastatske pandan, HSC-58 (Slika 2A, B). Oba NDRG1 ušutkati stanične linije, AS1 /Sic50 i AS1 /Sic54, pokazalo je smanjena ekspresija puž u odnosu na njihovu visoko metastatskog kolegom AS1 /Mock3 (Slika 4B, C). Nadalje, aktivnosti E-kadherina promotor bio je značajno stimuliran u oba NDRG1 ušutkao stanične linije u odnosu na njihov vrlo metastatskim kolegom (Slika 5c). Pregled

U zaključku, NDRG1 obaranje izazvana je povećanje ekspresije E-kadherina i silazni vimentin i puž, i potisnuta invaziju, metastaze i nakupljanje ascitesa od strane visoko metastatskih stanica karcinoma želuca. Ova posredovane regulacija NDRG1 E-kadherina i /ili vimentin ekspresija utječe epitela mezenhimalnog prijelaza želučanih stanica raka. To je navelo modifikacija NDRG1 od EMT čini se da je barem dijelom pripisati transkripcijski faktor puž. NDRG1, u svojoj uskoj kontekstu sa EMT-vezanih gena, možda sudjelovati u stjecanju visokog metastatskim potencijalom progresivnim stanica raka želuca. Pregled

Materijali i metode

Materijali i Stanične linije

HSC-58 je uspostavljen od humanih scirrhous želučanog karcinoma i 58As1 i 58As9 neovisno su uspostavili ponovljenom ortotropnih implantacije HSC-58 stanica u želučanu stijenku atimičkih miševa, kako je prethodno opisano [5], [6]. AS1 /Sic50 i AS1 /Sic54 stanice su osnovana od strane stabilne transfekcije NDRG1 shRNA u 58As1 stanica. Sve stanične linije su održavane u RPMI-1640 mediju s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS). BxPC-3, humana stanične linije raka gušterače, dobivena je od American Type Culture Collection (Manassas, VA). Anti-NDRG1 antitijelo proizvodi se kao što je ranije opisano [34]. Druga antitijela su nabavljeni kao što slijedi: anti-β-aktin antitijelo i anti-puž protutijela su iz Abcam; anti β-katenina antitijelo, anti-β-katenina (ser 33/37), anti-β-katenina (ser 552), anti-Wnt, anti-Ki-67, anti-GSK-3β antitijelo, anti-EGFR protutijelo, anti-GAPDH antitijelo, anti-p-GSK-3β antitijelo, ERK1 /2 antitijela anti-p-ERK1 /2 antitijela, anti-AKT antitijelo, anti-p-AKT antitijela su dobivena od tvrtke Cell Signaling Technology, anti-vimentin antitijela Calbiochem; anti-E-kadherina antitijela od BD. CT99021 je kupljen od aksona Medchem BV (Nizozemska). Pregled

Gene Expression Microarrays pregled

Komplementarna RNA je pojačan, obilježeni i hibridizirani na 44K Agilent 60-mer oligomicroarray prema uputama proizvođača (Agilent tehnologije). Svi hibridizirani microarray stakalca su skenirani od strane Agilent skener. Relativna hibridizacije intenzitet i hibridizacije vrijednosti pozadine su izračunate pomoću Agilent određivanja značajki softvera. Za identifikaciju gore ili dolje regulirani geni, možemo izračunati omjeri (ne-log smanjenih sjedeća promjene) od normalizacije intenziteta signala svake probe za usporedbu između kontrolne i eksperimentalne uzorke. onda smo utvrdili kriterije za reguliranih gena: up-reguliranih gena, omjer ≥2 puta; gena dolje regulirano, omjer ≤0.5. pregled

konstrukt NDRG1 shRNA i Uspostava NDRG1 obaranje staničnim linijama

Da bi se dobila ljudski U6 siRNA vektor temelji na pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ljudski U6 promotor (koji sadrži Hind III i
Bam HI mjesta kloniranja pregled) je pojačan iz humane genomske DNA s par početnica 5'-AGATCTGAATTCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGC i 5'-AGATCTAAGCTTCTCGAGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAG, i povezan u Bgl pregled II mjesto pcDNA3. Parcijalne DNA fragmenti ljudskih NDRG1 DNA su kemijski sintetizirani i klonira u pcDNA3-hU6siRNA odcijepiti s Hind
III i Bam
HI proizvoditi pcDNA3shNDRG1. Sintetizirani DNA za pcDNA3shNDRG1 bili su: 5'-GATCCGCGTGAACCCTTGTGCGGAATTCAAGAGATTCCGCACAAGGGTTCACGTTTTTTGGAAA i 5'-AGCTTTTCCAAAAAACGTGAACCCTTGTGCGGAATCTCTTGAATTCCGCACAAGGGTTCACGCG. Puž cDNA je pripremljena kao što je ranije opisano [35]. Puž cDNA ligiran u pcDNA3 (pcDNA3-puž). Stanice su transficirane s pcDNA3shNDRG1 ili pcDNA3-puž pomoću Lipofectamine 2000 (Invitrogen) slijedeći protokol proizvođača. Stabilni Transfektirane klonovi su postavljene uporabom izbor G418. Pregled

Transformacija Mali ometa RNA pregled

siRNA odgovara nukleotidnih sljedova od puževa i beta-katenina su kupljeni od Invitrogen (Carlsbad, CA), odnosno, siRNA duplexes su transficirane korištenjem Lipofektamin RNAiMAX i Opti-MEM mediju (Invitrogen) prema preporuci proizvođača. pregled

Luciferaze pregled

za dobivanje E-kadherina-Luc vektor, E-cadhein promotor (-262 do + 120) povećan je pomoću PCR upotrebom sljedećih klica: 5'AGATCTTAGTGAGCCACCGGCGGGGC-3 'i 5'-AAGCTTGGCCGGGGACGCCGAGCGAGGG-3'. Podcrtani ukazuju restrikcijskih mjesta enzima razgradnje. Amplificirani fragment je ligatiran u pGEM-T vektor (Promega lako) i prebačen u pGL3-Basic vektor (Promega) u Bglll i Hindlll. E-kadherin-luc i pcDNA3-puž su transfektirane pomoću Lipofektamin LTX i Opti-MEM medija (Invitrogen) prema preporukama proizvođača. Nakon 24 sata, aktivnost luciferaze mjerena je prema uputama proizvođača (Promega). Nadalje, također ispituje aktivnosti luciferaze kojim upravlja beta-katenina pomoću TopFlash reporter vektor kao što je opisano [18]. Pregled

mekom agaru koloniziranja Test pregled

4 x 10 ^{3 stanice su bile stavljene u 1 ml medija za kulturu koji sadrži 0,36% (w /v) gornji agar slojevita preko bazalnog sloja 0,72% (w /v), agar u 6 jamica i ostavljene da rastu 3-4 tjedna. Kolonije su fotografirane i broje se u deset slučajnim područjima pogledom na 50x uvećanjem svjetlosnim mikroskopom. Svaki pokus rade po tri puta. Pregled}

Western blot analizi i frakcioniranje jezgre i citoplazma pregled

Stanice su lizirane u puferu koji sadrži 50 mM Tris-HCl, 350 mM NaCl, 0,1% NP40, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida, 10 ug /ml aprotinina, 10 ug /mL leupeptina i 1 mM Na3VO4. Ukupni stanični lizati su podvrgnuti SDS-PAGE i mrlja na imobilon membranama (Millipore Corp, Bedford, MA), kao što je prethodno opisano u [24], [25]. Pripremiti citosol nuklearne dio, stanice su lizirane u bufferA (10 mM HEPES, pH 7,9, 10 mM KCl, 10 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,4% Igepal i inhibitore proteaze) i inkubirati 20 minuta na ledu. Nakon centrifugiranja (3 min, 5.000 okretaja u minuti), supernatant je korišten kao citoplazmatskom frakcijom. Nastali peleti su ponovno suspendirani u bufferB (20 mM HEPES, pH 7,9, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glicerin, 1 mM DTT i inhibitore proteaze) i inkubira se na 2 sata uz stalno miješanje na 4 ° C. Nakon centrifugiranja (5 minuta, 15.000 okretaja u minuti), supernatant je korišten kao nuklearne frakcije.