PLOS ONE: N-myc gen abajo Regulado 1 (NDRG1) promueve la metástasis de las células escirrosos cáncer gástrico humano a través del epitelio mesenquimales transición

Extracto

Nuestro estudio reciente demostró que el aumento de expresión de N-myc 1 downregulated (NDRG1) está estrechamente correlacionado con mal pronóstico en pacientes con cáncer gástrico. En este estudio, hemos preguntado si NDRG1 tiene un papel fundamental en la progresión maligna incluyendo metástasis de células de cáncer gástrico. Por la expresión génica análisis de microarrays de expresión de NDRG1 mostró el mayor incremento entre un total de 3691 genes regulados hasta en una línea altamente metastásico de células de cáncer gástrico (58As1) que sus padres bajo contraparte metastásico (HSC-58). Las líneas de células altamente metastásicas mostraron una disminución de la expresión de E-cadherina, junto con una mayor expresión de vimentina y Caracol. Esta disminución de la expresión de E-cadherina fue restaurada por Caracol caída en las líneas de células altamente metastásicas. Seguidamente, establecimos líneas estables de células NDRG1 desmontables (de AS1 /Sic50 y de AS1 /Sic54) de la línea celular altamente metastásica, y ambas de estas líneas celulares mostraron una mayor expresión de E-cadherina y disminución de la expresión de vimentina y Caracol. Y también, se encontró que la actividad de luciferasa promotor impulsado por E-cadherina que aumentar en NDRG1 caída en la línea celular altamente metastásica. caída en NDRG1 celular de cáncer gástrico mostró suprime la invasión de las células cancerosas en los tejidos envolventes, suprimida metástasis en el peritoneo y la disminución de la acumulación de ascitis en ratones con mejores tasas de supervivencia significativamente. Este es el primer estudio que demuestra que NDRG1 desempeña su papel fundamental en la progresión maligna del cáncer gástrico a través transición epitelio mesénquima

Visto:. Ureshino H, Murakami Y, K Watari, Izumi H, Kawahara A, M Kage , et al. (2012) N-myc Aguas abajo regulado Gen 1 (NDRG1) promueve la metástasis de las células escirrosos cáncer gástrico humano a través epitelial mesenquimal transición. PLoS ONE 7 (7): e41312. doi: 10.1371 /journal.pone.0041312

Editor: Rakesh K. Srivastava, de la Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América

Recibido: 8 de Diciembre, 2011; Aceptado: 22 Junio ​​2012; Publicado: 23 de julio 2012

Derechos de Autor © 2012 Ureshino et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio fue apoyado por una subvención-en-ayudas a la Investigación del cáncer del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (con el Dr. Ono), y por el control de Investigación 3er término amplio para el cáncer del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón (Dr. Kuwano). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico es una de las neoplasias más comunes en Japón y otros países asiáticos. El pronóstico de los pacientes de carcinoma gástrico escirrosa es particularmente pobre. carcinoma gástrico escirrosa suele ir acompañada de diseminación peritoneal y metástasis a los ganglios linfáticos y el hígado, que son problemas graves que tienen que ser controlados. La expresión de genes perfil reveló amplificaciones de genes de K-Sam y c-Met en el 30-40% de los cánceres gástricos escirrosos, y que la sobreexpresión de diversos factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento transformante-β (TGF-β), el crecimiento derivado de plaquetas factor de (PDGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) y factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2) [1]. Recientes análisis de microarrays de ADN demostró la regulación positiva de varios genes específicos incluidos SPARC
, RGEIII
, S100A10
, y el colágeno tipo I [2] - [4].

los modelos animales que reflejan las características de la peritonitis y la metástasis cancerosa al peritoneo son importantes para entender el desarrollo de la progresión maligna de cáncer gástrico. Yanagihara et al.
[5] estableció por primera vez la línea de células HSC-58 de cáncer gástrico escirrosa humana, y luego estableció dos sublíneas, 58As1 y 58As9, con un alto potencial de diseminación peritoneal y metástasis de ganglios linfáticos por repetida inoculación ortotópico de células HSC-58 en la pared gástrica de los ratones atímicos [6], [7]. Estas sublíneas a menudo causan acumulación de ascitis después de la implantación ortotópica y muestran aumento de la expresión de genes que codifican proteasas y proteínas implicados en la adhesión celular, la motilidad celular, la proliferación y la angiogénesis [6]. También crecen selectivamente en la submucosa gástrica, e invaden la capa más profunda para alcanzar el plano serosa del estómago [7]. Sin embargo, no queda claro por qué han adquirido un alto potencial para la metástasis tales durante la selección.

En nuestro estudio, hemos utilizado estas líneas celulares altamente metastásicas para investigar la forma humana células de cáncer gástrico podrían adquirir potencial metastásico. En primer lugar, compararon los perfiles de expresión génica entre las líneas celulares parentales altamente metastásico metastásico y baja por el análisis de microarrays. Nos centramos en un gen llamado N-myc gen regulado aguas abajo 1 (NDRG1), ya que se encontró que estaba marcadamente aumentada en las líneas celulares de cáncer gástrico altamente metastásicas en comparación con sus células de contrapartida. También se informó anteriormente que la expresión NDRG1 era un marcador que predicen una progresión maligna y mal pronóstico en pacientes gástricos [8]. En consonancia con este estudio, se observó que la expresión de alto NDRG1 se correlacionó significativamente con la angiogénesis tumoral y la progresión maligna junto con mal pronóstico en cáncer gástrico [9]. También se informó de que NDRG1 desmontables induce la disminución de la producción de factores angiogénicos y potentes de la angiogénesis tumoral por las células de cáncer de pulmón, y también que NDRG1 es un marcador predictivo para la angiogénesis tumoral y mal pronóstico en pacientes con no poco el cáncer de pulmón de células [10]. NDRG1, uno de los cuatro genes de la familia NDRG, muestra por lo tanto diversas funciones [11], y las funciones NDRG1 ya sea como supresor de la metástasis o como promotor oncogénico y malignos, en función de los tipos de tumores [11], [12]. Además, la expresión del gen NDRG1 está estrechamente controlada por N-Myc y proteínas relacionadas de la familia Myc [13] y la sobreexpresión de c-Myc transición inducida epitelial mesenquimal (EMT) en células epiteliales mamarias [14]. El importante papel de la EMT a menudo se refiere en su contexto cierre del desarrollo y la progresión del tumor incluyendo la metástasis del cáncer [15], [16]. Sin embargo, en estos estudios, el papel regulador de NDRG1 no fue estudiado. En nuestro estudio, hemos investigado el potencial metastásico de células de cáncer gástrico por su correlación con la función basada en la EMT de NDRG1.

Resultados

Comparación del crecimiento celular, la célula de morfología, crecimiento tumoral, la difusión y perfiles de expresión génica entre las líneas celulares altamente metastásico cáncer gástrico y su baja Contrapartida metastásico

de acuerdo con estudios anteriores [6], [7], las líneas celulares de cáncer altamente metastásicas 58As1 y 58As9 mostraron tasas de crecimiento más altas que sus padres contraparte, HSC-58, con tiempos de 23-26 h en comparación con 30 horas para que las células parentales (Figura 1A) duplicar. 58As1 las células fueron separadas con facilidad y mostraron un crecimiento de células de tipo suspensión con morfología redonda, mientras que las células HSC-58 y 58As9 se adjuntan y mostraron un crecimiento de células en capas con una morfología fibroblástica (Figura 1B). Tanto las células 58As1 y 58As9 mostraron tasas de crecimiento del tumor mucho más altos en un modelo de xenoinjerto subcutáneo en comparación con las células HSC-58 parentales (Figura 1C). Estudios anteriores demostraron que el trasplante ortotópico de células 58As1 inducida mucho mayor diseminación peritoneal y ascitis acumulación que la de células HSC-58 [6], [7]. Se confirmó aún más la diseminación peritoneal de las células mediante la implantación de ellos en la cavidad peritoneal de ratones. Los ratones implantados con células 58As1 mostraron la aparición de un promedio de 8 ± 3 nódulos visibles en el mesenterio de cada ratón y la acumulación de ascitis (que van desde 0,7-2,5 ml /ratón) (Figura 1D, E). Por el contrario, los ratones implantados con células parentales HSC-58 mostraron la formación de pocos o ningún diminutos nódulos, y sin acumulación aparente de la ascitis.

A continuación comparó perfiles de expresión génica entre células 58As1 y su homólogo de los padres, HSC- 58, mediante el análisis de microarrays de ADN. De los 41.000 transcripciones de ARN y variantes, se identificaron 3691 genes expresados ​​diferencialmente que se upregulated a 2 veces, y 3536 genes que fueron regulados a la baja a 0,5 veces o menos en las células 58As1 comparación con las células HSC-58. Figura 1F presenta genes que son expresados ​​diferencialmente en células 58As1 en comparación con HSC-58 células, limitados a los que pertenecen a la familia NDRG, y los genes relacionados con la metástasis, incluyendo metaloproteinasas de la matriz (MMPs) /catepsinas, adhesión y epitelio-mesenquimal transición ( EMT). De los cuatro genes en la familia NDRG [17], la expresión de NDRG1 y NDRG4 se reguló en la línea celular altamente metastásica (58As1) en comparación con la línea celular parental (HSC-58). La expresión de los genes relacionados con la EMT en las células 58As1 fue especialmente afectada por la adquisición de un alto potencial metastásico. La expresión de genes específicos del epitelio, incluyendo la E-cadherina ( CDH1
), P-cadherina (
CDH3) y β-catenina ( CTNNB1
), se downregulated . Por el contrario, sólo MMP1 ( MMP1
) expresión fue notablemente upregulated; la expresión de la catepsina L ( CTSL1
) se incrementó, pero el de la catepsina B ( CTSB
) no lo era. La expresión de genes específicos-mesénquima, vimentina ( VIM
) y Caracol ( Snai1
), un factor de transcripción clave para la represión de la expresión de E-cadherina, se reguló.

faciliten la expresión de genes en NDRG1 altamente líneas celulares de cáncer gástrico metastásico

Asimismo, comparó la expresión de proteínas de varios genes en las CEH-58, las células 58As1 y 58As9 (Figura 2A). La expresión de NDRG1 fue marcadamente aumentada, y el de la vimentina, Snail, p-ERK1 /2, p-Akt, y p-GSK-3β fue también aumentó, tanto en las células 58As9 58As1 y comparación con las células HSC-58. No había ninguna expresión aparente de Wnt3a y Wnt5a en estas líneas celulares (datos no mostrados). Por el contrario, se observó disminución de la expresión de E-cadherina y β-catenina en las células 58As1 y 58As9 en comparación con HSC-58 células (Figura 2A). Se encontró fosforilación de β-catenina Ser33 /37 y Ser552 a ser mucho menos en 58As1 y 58As9 de HSC58. En consonancia con los niveles de expresión de proteínas, los niveles de expresión de ARNm de NDRG1, vimentina, Caracol y MMP-1 fueron mayores en ambas líneas celulares altamente metastásicas que su contraparte parental (Figura 2B). Hubo mucho menos la expresión de ARNm de E-cadherina y β-catenina en tanto 58As1 y 58As9 de HSC-58.

Inmuno análisis reveló que la localización de E-cadherina, tanto en el citoplasma y membrana, y β-catenina fue mayormente localizada en el citoplasma de las células tanto 58As9 (Figura 2C) HSC-58 y. Inmuno análisis de 58As1 no pudo realizarse como 58As1 crece en suspensión. Además, la expresión de β-catenina fue relativamente menor en tanto citoplasma y el núcleo pero que de Snail se encontró que era mucho más alto en el núcleo de 58As1 y 58As9 de HSC-58 (Figura 2D). También se examinó la E-cadherina actividad promotora (Figura 2E) y la actividad de reportero inducido por β-catenina por el reportero de ensayo TopFlash (Figura 2F) y nos pareció que no había disminución significativa en la actividad de luciferasa dirigido por el promotor de la E-cadherina y también por β-catenina en tanto 58As1 y 58As9 en comparación con HSC-58, de acuerdo con los niveles de ARNm de ambos genes.

NDRG1 Derribo induce la regulación al alza de la e-cadherina y la regulación a la baja de vimentina y Snail en células altamente metastásicas

a continuación examinó si NDRG1 caída afectó específicamente la expresión de genes relacionados con la EMT en la línea celular altamente metastásica, 58As1. Establecimos dos clones de células estables NDRG1 desmontables, de AS1 /Sic50 y de AS1 /Sic54 por transfección en células NDRG1 shRNA 58As1. Tanto de AS1 /Sic50 y de AS1 /Sic54 células mostraron tasas de crecimiento similares entre sí, y su homólogo de los padres As1 /Mock3, con tiempos de 25-27 hr duplicar en cultivo (Figura 3A). Ambas líneas celulares mostraron NDRG1 silenciado apretado adhesión de las células a la placa de cultivo y la morfología fibroblástica, mientras que las células de AS1 /Mock3 mostraron un crecimiento de las células de tipo suspensión con morfología de células redondas (Figura 3B). A continuación examinó el efecto de silenciamiento NDRG1 sobre la actividad de las células tumorigénicas 58As1 usando un ensayo de crecimiento independiente de anclaje. Ambas líneas celulares NDRG1 silenciado mostraron una reducción significativa de su crecimiento independiente de anclaje, como se indica por el número de colonias en agar blando ( ^{* p < 0,01
). (Figura 3C)}

Entonces se compararon los perfiles de expresión génica entre células de AS1 /Mock3 y de AS1 /Sic50 utilizando el análisis de microarrays de ADN (Figura 4A). NDRG1 caída produjo un aumento de la expresión de la E-cadherina ( CDH1
) y P-cadherina ( CDH3
) pero disminuyó la expresión de vimentina ( VIM
) y Caracol ( Snai1
). A continuación realizó western blot y análisis QRT-RCR por varias moléculas que fueron modulados por NDRG1 caída en el análisis de microarrays (Figura 4B, C). Estas dos líneas celulares mostraron mucho más baja expresión de ambos ARNm NDRG1 y proteínas en comparación con las células de AS1 /Mock3. Aumento de expresión de E-cadherina se observó consistentemente en As1 /Sic50 y las células de AS1 /Sic54 comparación con las células de AS1 /Mock3 por Western blot. En las células de AS1 /Sic50 y de AS1 /Sic54, tanto western blot y análisis de QRT-PCR confirmó disminución de la expresión de vimentina y caracol sin afectar a la expresión de p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-Akt, Akt, p-GSK-3β y GSK-3β (Figura 4B, C).

por otro lado, NDRG1 es bien conocido para suprimir la metástasis y la proliferación celular por las células de cáncer de próstata y colon. Estudios recientes han demostrado que modula NDRG1 vía de señalización Wnt-β-catenina con una mayor expresión de E-cadherina en la próstata humana y de células de cáncer de colon [18], [19]. Sin embargo, NDRG1 caída en células 58As1 no afectó a la expresión de β-catenina, tanto a nivel de proteína y ARNm (Figura 4B, C). Y también impulsado β-catenina actividad promotora de ensayo indicador TopFlash reveló ninguna diferencia en la actividad del promotor entre As1 /Mock y NDRG1 silenciada líneas celulares. Por lo tanto, la expresión de β-catenina no fue afectada por NDRG1 caída. NDRG1 desmontables por lo tanto aumenta constantemente expresión de E-cadherina y disminución de la expresión de Snail y vimentina en la línea celular altamente metastásica. Sin embargo, no hubo ningún cambio aparente en la expresión de β-catenina por NDRG1 caída.

Enhanced E-cadherina la actividad del promotor por NDRG1 Derribo través de Snail en células de cáncer gástrico

de diversos factores de transcripción que suprimen expresión de e-cadherina incluyendo Snail, Slug, Twist, TCF4 y SIP1 [20], la expresión de Snail se modula específicamente por NDRG1 en células de cáncer gástrico. Hemos examinado si la expresión de E-cadherina y /o vimentina podría ser regulada por Snail en células HSC-58. tratamiento transitoria con Caracol siRNA dado lugar a una mayor expresión de E-cadherina, pero no el de vimentina y NDRG1, en forma dependiente del tiempo (Figura 5A). Sólo hubo un ligero aumento en su caso en la expresión de β-catenina por Caracol caída. Además, la actividad de luciferasa promotor impulsado E-cadherina se suprimió significativamente mediante transfección de ADN complementario Snail en dos líneas celulares de cáncer analizadas (Figura 5B). A continuación comparó la actividad del promotor de cadherina E entre As1 /Mock3 y sus líneas celulares NDRG1 silenciada. Como se ve en la figura 5C, no fue significativa (* p Hotel < 0,05) la mejora de la E-cadherina actividad promotora por NDRG1 caída

GSK-3β es una enzima clave para la activación de la EMT. vía [20], [21], y también para la fosforilación de NDRG1 [22], [23]. La expresión de p-GSK-3β se incrementó en la línea celular altamente metastásica, 58As1 (véase la Figura 2A). Hemos examinado si la GSK-3β participó en NDRG1 inducida por alteraciones en la expresión de E-cadherina y vimentina. El tratamiento con un inhibidor (CT99021) de GSK-3β generado una disminución en la expresión de p-NDRG1 y p-GSK-3β, y también aumentó la expresión de E-cadherina y β-catenina en las células 58As1 (Figura 5D). Como se muestra en la Figura 5E, desmontables β-catenina no afectó la expresión de E-cadherina, vimentina y Caracol.

NDRG1 Derribo Induce epitelio mesenquimales transición y suprime la metástasis en el peritoneo por altas células metastásicas del cáncer gástrico

la comparación de las tasas de crecimiento del tumor de As1 /Mock3, de AS1 /Sic50 y las células de AS1 /Sic54 en un modelo de xenoinjerto reveló más lentas tasas de crecimiento del tumor de ambos de AS1 /Sic50 y As1 /Sic54 por NDRG1 desmontables (Figura 6A, B). knockdown NDRG1 suprime la invasión local de las células tumorales de AS1 /Mock3 en el estroma circundante y adiposo adyacente y /o el tejido muscular, y el crecimiento del tumor encapsulado (Figura 6C). Alta expresión de E-cadherina se observó en As1 /Sic50 y tumores de AS1 /Sic54, mientras que se observó una elevada expresión de vimentina en células de cáncer de tumores de AS1 /Mock3 (Figura 6D). Por el contrario, casi no hubo cambio en la expresión de β-catenina en As1 /Sic50 y los tumores de AS1 /Sic54 en comparación con el tumor de AS1 /Mock3.

Para examinar si la caída NDRG1 podría afectar metástasis en el peritoneo y la acumulación de la ascitis, se comparó el potencial metastásico de células de AS1 /Sic50 y de AS1 /Mock3 después del trasplante ortotópico. La Figura 7A muestra imágenes representativas de la cavidad abdominal ampliada y la presencia de nódulos de cáncer en el peritoneo. Después de la inoculación de las células ortotópico de AS1 /Sic50, el número de los nódulos que aparecen en el peritoneo fue de aproximadamente 30% menor que las que resultan de las células de AS1 /Mock3, pero esta disminución no fue estadísticamente significativa ( p = 0,21
) (Figura 7B). Sin embargo nódulos resultante de las células de AS1 /Sic50 mostraron tamaños mucho más pequeños que los de las células de AS1 /Mock3 (Figura 7A). La acumulación de ascitis por las células de AS1 /Sic50 fue significativamente (* p < 0,01) se redujeron, a aproximadamente 10% de la inducida por las células de AS1 /Mock3 (Figura 7C). Además, hubo una disminución significativa (* p Hotel < 0,01) aumento en la tasa de supervivencia de los ratones inoculados con células de AS1 /Sic50 (51 ± 16 días) en comparación con 35 ± 14 días para los ratones inoculados con de AS1 /Mock3 células, lo que indica que la caída NDRG1 prolonga la supervivencia (Figura 7D).

Discusión

Hemos informado anteriormente de que NDRG1 está estrechamente relacionada con la angiogénesis tumoral y la supervivencia de los pobres en pacientes con cáncer gástrico, lo que sugiere que NDRG1 es un biomarcador predictivo de la progresión maligna del cáncer gástrico [9]. De nuestro estudio, observamos las siguientes propiedades que subyacen a la adquisición de un alto potencial metastásico en el cáncer gástrico: microarrays, western blot y RT-PCR análisis conjunto reveló la regulación positiva de NDRG1 en las líneas celulares altamente metastásicas, 58As1 y 58As9, en comparación con su bajo homólogo paterno metastásico, HSC-58; mayor expresión de vimentina, caracol, y MMP-1, y una menor expresión de E-cadherina y β-catenina fueron evidentes en las líneas de células altamente metastásicas en comparación con sus homólogos de los padres; de los genes regulados negativamente en la línea celular altamente metastásica, NDRG1 caída resultó en la regulación positiva de la E-cadherina, y la regulación a la baja de vimentina y caracol, pero casi ningún efecto sobre la expresión de β-catenina; la actividad del promotor de E-cadherina fue aumentada significativamente por NDRG1 desmontables; desmontables NDRG1 también suprimió diseminación peritoneal y la acumulación de ascitis, y la invasión de células altamente metastásicas en los tejidos circundantes normales.

En el presente estudio, NDRG1 caída dio lugar a la supresión de la metástasis de células de cáncer gástrico altamente metastásico (Figura 6 , 7), lo que sugiere que NDRG1 puede ser un gen promotor de la metástasis en lugar de un gen supresor de la metástasis en el cáncer gástrico. Nuestro presente estudio apoya firmemente la idea de que si NDRG1 promueve o inhibe la progresión maligna del cáncer humano depende de los tipos de tumores y /o el estado de diferenciación [11], [12]. Sin embargo, no queda claro qué funciones NDRG1 como supresor de tumores o promotor dependiendo de los tipos de tumores o tipos histológicos. Nuestro estudio anterior demostró que NDRG1 suprime el crecimiento del tumor y la angiogénesis del cáncer de páncreas a través NDRG1 atenuación impulsado de NF-kB vía [24] de señalización, [25]. estudio reciente ha informado de que la expresión del gen supresor de la metástasis, KAI1
gen, está implicada en la metástasis de supresión mediada NDRG1 de cáncer de próstata a través de ATF3-NF-kB vía [26]. Se requieren más estudios para entender qué mecanismo de regulación es específicamente responsable de la promoción de NDRG1 impulsado la progresión maligna de células de cáncer gástrico.

EMT es un punto culminante reciente que podría estar estrechamente asociado con el cáncer progresión maligna incluyendo adquisición de potencial altamente metastásico [15], [16]. En nuestro estudio, NDRG1 caída aumentó la expresión de E-cadherina y suprimió la expresión de vimentina tanto in vitro
y in vivo
. NDRG1 puede jugar un papel clave en el cambio de un fenotipo epitelial polarizada a un fenotipo mesenquimal muy móviles. La pérdida parcial o completa de E-cadherina se observa a menudo durante la progresión hacia la malignidad en numerosos tumores, incluyendo el cáncer gástrico [27], [28]. Oliveira et al. [29] informó de una estrecha relación entre la pérdida de E-cadherina y alto potencial metastásico en el cáncer gástrico. Chan et al. [30] también informó soluble E-cadherina como un biomarcador para la supervivencia prolongada de los pacientes con cáncer gástrico. NDRG1 caída dio lugar relativamente más alta expresión de E-cadherina en As1 /Sic50 tumores que en los tumores de AS1 /Mock3, lo que sugiere que NDRG1 puede controlar específicamente la EMT posiblemente a través del factor de transcripción Snail por células de cáncer gástrico (Figura 7E).

señalización de Wnt tiene un papel fundamental en la progresión maligna y metástasis de pulmón y de mama células del cáncer [31], [32], y la señalización de Wnt también induce la EMT, que consiste en la progresión metastásica del cáncer epitelial [31], [33]. NDRG1 se conoce como un gen supresor de metástasis en la próstata y de células de cáncer de colon [11], [12]. Liu et al [18] ha informado de que NDRG1 suprime la metástasis a través de la vía de señalización de Wnt /β-catenina en las células del cáncer de próstata. Un estudio pertinente por Chen et al [19] también ha demostrado que modula NDRG1 EMT TGF-β inducida a través de la expresión alterada de β-catenina y E-cadherina en células de cáncer colorrectal. Nuestro presente estudio mostró disminución de la expresión de β-catenina en ambas líneas celulares altamente metastásicas en comparación con la contraparte de los padres, HSC-58. Sin embargo, tanto western blot y QRT-PCR análisis mostraron ningún cambio significativo en los niveles de expresión de la actividad del promotor β-catenina también impulsado entre las células 58As1 altamente metastásicas y sus dos líneas de células silenciadas NDRG1 β-catenina y. Parece menos probable que β-catenina desempeña un papel fundamental en la supresión de la metástasis por NDRG1 desmontables en las células cancerosas altamente metastásicas.

Por otro lado, GSK-3β también se sabe que juega un papel en el control de EMT [20], [21], y GSK-3β es una enzima esencial para la fosforilación de NDRG1, una excelente subestado de GSK-3β [22], [23]. La expresión de p-GSK3 era relativamente más alto en las líneas celulares altamente metastásicas que su línea celular parental (Figura 2B). El tratamiento con un potente inhibidor de GSK-3β resultó en una expresión reprimida p-NDRG1, acompañada por la regulación positiva de E-cadherina y β-catenina (Figura 5D). Sin embargo, casi no hubo diferencia en la expresión de GSK-3β y p-GSK-3β por NDRG1 caída en las células altamente metastásicas (Figura 4B), lo que sugiere que la GSK-3β no puede jugar un papel importante en la inducción de la EMT a través NDRG1 en células de cáncer gástrico.

Snail es un factor de transcripción representativo que controla la expresión de E-cadherina [20]. De diversos factores reguladores que controlan transcriptionally E-cadherina, la expresión de Snail se modula específicamente por NDRG1 en líneas celulares de cáncer gástrico utilizadas en este estudio. Caracol regulación positiva inducida desmontables de E-cadherina (Figura 5A), y tarnsfection exógena de cDNA de Snail suprime la E-cadherina actividad promotora (Figura 5B)

En líneas celulares de cáncer gástrico altamente metastásicas, la expresión de Snail se reguló como. en comparación con su homólogo de bajo metastásico, HSC-58 (Figura 2A, B). Ambas líneas celulares NDRG1 silenciados, de AS1 /Sic50 y de AS1 /Sic54, mostraron una disminución de la expresión de Snail en comparación con su contraparte altamente metastásico, de AS1 /Mock3 (Figura 4B, C). Por otra parte, la actividad del promotor de E-cadherina se estimuló significativamente tanto en NDRG1 silenciada líneas celulares en comparación con su contraparte altamente metastásico (Figura 5C).

En conclusión, NDRG1 caída indujo la regulación al alza de E-cadherina y regulación a la baja de la vimentina y el caracol, y suprime la invasión, metástasis y la acumulación de ascitis por las células de cáncer gástrico altamente metastásicas. Esta regulación mediada NDRG1 de E-cadherina y /o expresión de vimentina afectados transición epitelio mesénquima de células de cáncer gástrico. Esta modificación inducida NDRG1 de EMT parece ser al menos en parte atribuible al factor de caracol de la transcripción. NDRG1, en su contexto cercano con genes relacionados con la EMT, podría participar en la adquisición de un alto potencial metastásico de células de cáncer gástrico progresivos.

Materiales y Métodos

Materiales y líneas celulares

HSC-58 se estableció a partir de los carcinomas gástricos escirrosos humanos y 58As1 y 58As9 se establecieron de forma independiente por una nueva implantación de ortotópico de células HSC-58 en la pared gástrica de los ratones atímicos como se describe anteriormente [5], [6]. as1 células /Sic50 y AS1 /Sic54 fueron establecidos por la transfección estable de NDRG1 shRNA en células 58As1. Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). BxPC-3, un humano líneas celulares de cáncer de páncreas, se obtuvo de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). anticuerpo anti-NDRG1 se generó como se describe anteriormente [34]. Otros anticuerpos se compraron como sigue: anticuerpo anti-β-actina y el anticuerpo anti-Snail eran de Abcam; anticuerpo anti β-catenina, anti-β-catenina (ser 33/37), anti-β-catenina (ser 552), anti-Wnt, anti-Ki-67, anticuerpos anti-GSK-3β, anticuerpo anti-EGFR, anti-GAPDH, anticuerpo anti-p-GSK-3β, anticuerpo anti-p-ERK1 anticuerpo anti-ERK1 /2 de anticuerpos /2, anticuerpo anti-AKT, anti-p-AKT anticuerpo eran de Señalización celular Tecnología; anticuerpo anti-vimentina era de Calbiochem; anticuerpo anti-E-cadherina fue de BD. CT99021 se adquirió de Axon MedChem BV (Países Bajos).

microarrays de expresión génica

ARN complementario se amplificó, etiquetado, y se hibrida a un 44K Agilent 60-mer oligomicroarray de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Agilent Technologies). Todas las diapositivas de microarrays hibridados fueron escaneados con un escáner de Agilent. hibridación intensidades relativas y los valores de hibridación de fondo se calcularon utilizando Agilent extracción de características de software. Para identificar relaciones hacia arriba o hacia abajo-genes regulados, se calculó (no ingrese a escala factores de cambio) de las intensidades de señal normalizadas de cada sonda para la comparación entre el control y las muestras experimentales. a continuación, hemos establecido criterios para genes regulados: hasta los genes regulados, relación ≥2 veces; abajo de los genes regulados, relación ≤0.5.

Construct de NDRG1 shRNA y el establecimiento de líneas celulares NDRG1 derribo

Para obtener un vector humana U6 siRNA basado en pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA), el promotor U6 humano (que contiene Hind III y
Bam HI sitios de clonación
) se amplificó a partir de ADN genómico humano con el par de cebadores 5 'y 5'-AGATCTGAATTCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGC AGATCTAAGCTTCTCGAGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAG, y se ligó en el Bgl II del sitio
pcDNA3. Los fragmentos de ADN parciales de ADN humano NDRG1 se sintetizaron químicamente y se clonó en pcDNA3-hU6siRNA escindido con Hind III y
Bam HI para producir
pcDNA3shNDRG1. Los ADN sintetizadas para pcDNA3shNDRG1 fueron: 5'-GATCCGCGTGAACCCTTGTGCGGAATTCAAGAGATTCCGCACAAGGGTTCACGTTTTTTGGAAA y: 5'-AGCTTTTCCAAAAAACGTGAACCCTTGTGCGGAATCTCTTGAATTCCGCACAAGGGTTCACGCG. El ADNc de caracol se preparó como se describe anteriormente [35]. Snail cDNA se ligó en el pcDNA3 (pcDNA3-caracol). Las células fueron transfectadas con pcDNA3shNDRG1 o pcDNA3-Snail usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. clones transfectados estables se establecieron utilizando la selección con G418.

La transfección de ARN interferente pequeño

correspondiente ARNsi a secuencias de nucleótidos de Caracol y β-catenina se compraron de Invitrogen (Carlsbad, CA), respectivamente, de siRNA dúplex se transfectaron usando Lipofectamine RNAiMAX y medio Opti-MEM (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

ensayo de luciferasa

para obtener la e-cadherina-Luc vector, promotor de la e-cadhein (-262 a 120) se amplificó por PCR utilizando los siguientes pares de cebadores: 5 'AGATCTTAGTGAGCCACCGGCGGGGC-3' y 5'-AAGCTTGGCCGGGGACGCCGAGCGAGGG-3 '. Subrayados indican los sitios de escisión de restricción enzimática. El fragmento amplificado se ligó en el vector pGEM-T fácil (Promega) y se transfiere al vector pGL3-basic (Promega) en los sitios BglII y HindIII. E-cadherina-luc y pcDNA3-Caracol fueron transfectadas utilizando Lipofectamine LTX y medio Opti-MEM (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Después de 24 h, la actividad de la luciferasa se midió de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). Por otra parte, también se examinó la actividad de luciferasa dirigido por β-catenina usando TopFlash vector informador tal como se describe anteriormente [18].

colonias en agar suave ensayo de formación de

4 × 10 ^{3 se sembraron células en 1 ml de medio de cultivo que contiene 0,36% (w /v) de agar superior en capas sobre una capa basal de 0,72% (w /v) de agar en placas de 6 pocillos y se dejaron crecer durante 3-4 semanas. Las colonias se fotografiaron y se contaron en diez campos aleatorios de vista 50X usando microscopía de luz. Cada experimento se realizó por triplicado.}

Análisis Western Blot y fraccionamiento de núcleo y el citoplasma

Las células se lisaron en tampón que contenía 50 mM Tris-HCl, NaCl 350 mM, 0,1% de NP40, 5 mM EDTA, NaF 50 mM, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 mg /ml de aprotinina, 10 mg /ml de leupeptina, y Na3VO4 1 mM. Total de lisados ​​de células se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas Immobilon (Millipore Corp., Bedford, MA) como se describe anteriormente [24], [25]. Para preparar citosol y la fracción nuclear, las células se lisaron en bufferA (inhibidores de HEPES 10 mM, pH 7,9, KCl 10 mM, EDTA 10 mM, DTT 1 mM, 0,4% de Igepal y de la proteasa) y se incuba durante 20 min en hielo. Después de la centrifugación (3 min, 5000 rpm), el sobrenadante se utilizó como fracción citoplásmica. Los sedimentos resultantes se resuspendieron en bufferB (inhibidores de HEPES 20 mM, pH 7,9, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, 5% de glicerol, DTT 1 mM y de la proteasa) y se incubaron durante 2 h con agitación continua a 4 ° C. Después de la centrifugación (5 min, 15.000 rpm), el sobrenadante se utilizó como fracción nuclear.

• PLOS ONE: perfiles de expresión de genes de células madre relacionados con el cáncer gástrico en neoadyuvante Teñidos: Un NOTCH2, GSK3B y β-catenina gen predice la firma Survival
• PLOS ONE: El papel de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y VEGF-R genotipificación para guiar el proceso de metástasis en el cáncer gástrico resecado pT4a Patients