PLoS One: N-myc Downstream Szabályozott Gene 1 (NDRG1) Elősegíti metasztázis Emberi Scirrhous gyomorkarcinóma sejtek révén Epithelialis mesenchymalis Transition

absztrakt katalógusa

A friss tanulmány kimutatta, hogy a magasabb kifejezése N-myc gén downregulált 1 ( NDRG1) szorosan összefügg a rossz prognózissal gyomorrákos betegek. Ebben a vizsgálatban, kértük, hogy NDRG1 van döntő szerepük malignus progresszió beleértve metasztázis a gyomor rákos sejteket. Génexpressziós microarray kifejezése NDRG1 mutatta a magasabb növekedés között összesen 3691-ig szabályozott gének erősen metasztatizáló gyomorrák sejtvonal (58As1), mint a szülői alacsony metasztatikus megfelelője (HSC-58). A nagyon metasztázisos sejtvonalak mutatott csökkent expressziója az E-cadherin, együtt fokozott expressziójának vimentin és Csiga. Ez csökkent expressziója E-cadherin visszaállította csiga kiütése az erősen szóródó sejtvonalak. Mi következő létre stabil NDRG1 knockdown sejtvonalak (As1 /Sic50 és As1 /Sic54) ebből a nagyon metasztázisos sejt vonal, és mindkét sejtvonal mutatott fokozott expresszióját az E-cadherin és csökkent expressziója vimentin és Csiga. És azt is, az E-cadherin promoter által meghajtott, luciferáz aktivitást találtunk növelni kell NDRG1 knockdown a nagyon metasztázisos sejtvonalban. NDRG1 kiütése a gyomorrák sejt mutatott elfojtott invázió ráksejtek térhatású szövetek elnyomta áttét a hashártya és a csökkent ascites felhalmozási egerekben szignifikánsan javította a túlélési arány. Ez az első tanulmány bizonyította, hogy NDRG1 játszik a döntő szerepet a malignus progresszió gyomorrák keresztül epithelialis mesenchymalis átmenet. Katalógusa

Citation: Ureshino H Murakami Y, Watari K, Izumi H Kawahara A, Kage M , et al. (2012) N-myc Downstream Szabályozott Gene 1 (NDRG1) Elősegíti metasztázis Emberi Scirrhous gyomorkarcinóma sejtek révén Epithelialis mesenchymalis Transition. PLoS ONE 7 (7): e41312. doi: 10,1371 /journal.pone.0041312 katalógusa

Szerkesztő: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: december 8, 2011; Elfogadva: június 22, 2012; Megjelent: július 23, 2012 katalógusa

Copyright: © 2012 Ureshino et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány támogatott a támogatási-in-támogatás Cancer Research Minisztérium Oktatási, Kulturális, Sport, Tudományos és Technológiai Japán (Dr. Ono), valamint a 3. Term átfogó ellenőrzési Research for Cancer a egészségügyi Minisztérium, munkaügyi és Népjóléti Japán (Dr. Kuwano). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák egyik leggyakoribb rosszindulatú daganatok Japánban és más ázsiai országokban. A beteg prognózisa scirrhous gyomorrák különösen rossz. Scirrhous gyomor karcinóma gyakran kíséri peritoneális terjesztés és metasztázis, hogy a nyirokcsomók és a máj, ami komoly problémákat, amelyeket meg kell ellenőrizni. Génexpressziós profil feltárta gén amplifikáció K-SAM és a c-Met 30-40% scirrhous gyomor rák, és hogy a túlzott mértékű expressziója a különböző növekedési faktorok, mint például a transzformáló növekedési faktor-β (TGF-β), a vérlemezke-eredetű növekedési faktor (PDGF), inzulin-szerű növekedési faktor (IGF) és a fibroblaszt növekedési faktor-2 (FGF-2) [1]. Újabb DNS microarray kifejezték túlszabályzását több gén köztük SPARC katalógusa, RGEIII katalógusa, S100A10 katalógusa, és I. típusú kollagén [2] - [4]. Katalógusa

az állatkísérletek, amelyek tükrözik a jellemzői rákos hashártyagyulladás és áttét a hashártya fontos, hogy megértsék a malignus progresszió gyomorrák. Yanagihara et al.
[5] először az HSC-58 sejtvonal humán scirrhous gyomorrák, majd két, alvonalainál, 58As1 és 58As9, és nagy a valószínűsége a peritoneális terjesztés és nyirokcsomó áttétek ismételt ortotopikus beoltása HSC-58 sejtek a gyomor falán, csecsemőmirigy nélküli egerekbe [6], [7]. Ezek altermékvonal gyakran okoz felhalmozódását ascites után ortotopikus beültetés és mutatják gének fokozott expressziója kódoló proteázok és fehérjék részt vesznek a sejtadhézióban, a sejtek motilitását, proliferációját és az angiogenezis [6]. Azt is nőnek szelektíven a gyomor nyálkahártya alatti, és behatolnak a mélyebb rétegben, hogy elérjük a serosa sík a gyomor [7]. Ennek ellenére továbbra is világos, hogy miért tettek szert ilyen nagy a valószínűsége az áttétek a kiválasztás során. Katalógusa

A mi jelen tanulmányban azt használják ezeket a nagyon metasztatizáló sejtvonalak, hogy vizsgálja meg az emberi gyomorrák sejtek szert metasztatikus potenciállal. Először képest génexpressziós profilok között erősen szóródó és alacsony metasztatikus szülői sejtvonalak microarray. Igyekeztünk az egyik gén neve N-myc downstream szabályozott gén 1 (NDRG1), mert azt találták, hogy jelentősen fokozódik a nagyon metasztázisos gyomor rákos sejtvonalak összehasonlítva a megfelelője sejteket. Azt már korábban is beszámolt arról, hogy NDRG1 kifejezés volt predikatív marker malignus progresszió és a rossz prognózissal gyomor betegnél [8]. Összhangban a tanulmány azt tapasztaltuk, hogy a magas NDRG1 expresszió szignifikánsan korrelált a tumor angiogenezis és a malignus progresszió együtt rossz prognózisú gyomorrákban [9]. Azt is jelentette, hogy NDRG1 knockdown indukál csökkent termelése potens angiogén faktorok és tumor angiogenezis által tüdőrák-sejtek, és azt is, hogy NDRG1 egy prediktív marker a tumor angiogenezis és rossz prognózissal betegeknél nem-kissejtes tüdőrák [10]. NDRG1, az egyik a négy NDRG családi gének, így azt mutatja, különböző funkciók, [11] és NDRG1 funkciók akár metasztázisszuppresszor- vagy az onkogén és malignus promoter, attól függően, tumortípus [11], [12]. Továbbá expressziója NDRG1 gén szorosan vezérli az N-myc-cel és a kapcsolódó Myc család fehérjék [13] és overexpressziója c-Myc indukált epithelialis mesenchymalis átmenet (EMT) Az emlő epiteliális sejtekben [14]. A fontos szerepét EMT gyakran nevezik annak közvetlen összefüggésben a fejlesztési és a tumor progresszióját, beleértve a rák áttétet [15], [16]. Azonban ezekben a vizsgálatokban, a szabályozó szerepét NDRG1 nem vizsgálták. A mi jelen tanulmányban azt vizsgáltuk a metasztatikus potenciálját gyomorrák sejtek által korrelációt EMT-építő szerepét NDRG1. Katalógusa

Eredmények katalógusa

összehasonlítása Cell Growth, Sejtmorfológiai, daganat növekedés, terjesztése és génexpressziós profilokat között erősen metasztatikus gyomor rákos sejtvonalak és alacsony metasztatikus ellentételezése katalógusa

összhangban a korábbi tanulmányok [6], [7], a nagyon metasztatizáló rákos sejtvonalak 58As1 és 58As9 a növekedési ütem, mint a szülői megfelelője, HSC-58, kétszeresére a 23-26 óra képest 30 órán szülői sejtek (1A). 58As1 sejteket könnyen levehető, és megmutatta felfüggesztés-típusú sejtek növekedését kerek morfológia, míg HSC-58 és 58As9 sejtek elérték, és megmutatta réteges sejtnövekedést a fibroblaszt morfológia (1B). Mindkét 58As1 és 58As9 sejtek esetében sokkal nagyobb a tumor növekedési ráta szubkután xenograftmodellben képest szülői HSC-58 sejtek (1C). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a ortotopikus transzplantációja 58As1 indukált sejtek sokkal magasabb peritoneális terjesztés és ascites felhalmozódása, mint a HSC-58 sejtek [6], [7]. Mi tovább megerősítette a peritoneális terjesztése a sejtek beültetésével őket a hasüregbe az egerek. Implantált egerekben 58As1 sejtek mutattak a megjelenése átlagosan 8 ± 3 látható csomók a mesenterium mindegyik egér és felhalmozódása az ascites (kezdve 0,7-2,5 ml /egér) (1D ábra, E). Ezzel szemben implantált egerekben szülői HSC-58 sejtek mutattak kialakulását néhány, ha minden apró csomók és nyilvánvaló akkumuláció ascites. Katalógusa

A következőkben képest génexpressziós profilok között 58As1 sejtek és a szülői megfelelője, HSC- 58, a DNS-microarray. A 41.000 RNS átiratok és variánsokat azonosítottunk 3691 differenciálisán expresszált gének, amelyek arra serkentett, hogy 2-szeres, és a 3536-gének, amelyek downregulált 0,5-szeres vagy ennél kisebb 58As1 sejtekben, mint a HSC-58 sejtekben. Ábra az 1F bemutatott géneket, amelyek differenciáltan kifejezett 58As1 sejtekben, mint a HSC-58-sejtek, korlátozódnak azokra tartozó NDRG család, és a gének kapcsolódó metasztázis, beleértve a mátrix metalloproteinázok (MMP-k) /katepszin, tapadás és epithelialis-mesenchymalis-átmenet ( EMT). A négy gén a NDRG család [17], a kifejezés a NDRG1 és NDRG4 ben fokozódik a nagyon metasztázisos sejtvonal (58As1), mint a szülői sejtvonalban (HSC-58). A kifejezés a EMT kapcsolatos gének 58As1 sejtek különösen erősen sújtja a megszerzése nagy metasztatikus potenciállal. A kifejezés a hám-specifikus gének, beleértve az E-cadherin ( Cdh1 katalógusa), P-kadherin ( CDH3 katalógusa) és β-catenin ( CTNNB1 katalógusa), volt downregulált . Ezzel szemben csak MMP1 ( MMP1 katalógusa) kifejezés láthatóan megnövekedett; kifejezése katepszin L ( CTSL1 katalógusa) emelték, hanem a katepszin B ( CTSB katalógusa) nem volt. A kifejezés a mezenhimasejtek-specifikus gének, vimentin ( VIM katalógusa) Csiga ( SNAI1 katalógusa), kulcsfontosságú transzkripciós faktor elnyomására E-cadherin volt serkentett. Katalógusa

Továbbfejlesztett NDRG1 Gene Expression erősen metasztatikus gyomor rákos sejtvonalak

további képest a protein expresszióját számos gének HSC-58, 58As1 és 58As9 sejtek (2A ábra). A kifejezés a NDRG1 volt jelentősen fokozta, és hogy a vimentin, csiga, p-ERK1 /2, p-Akt, és a p-GSK-3β-ben is növekedett, mind 58As1 és 58As9 sejtek összehasonlítva HSC-58 sejtekben. Nem volt nyilvánvaló kifejezése Wnt3a és Wnt5a ezekben a sejtvonalakban (adatokat nem mutatjuk). Ezzel ellentétben, mi megfigyelt csökkent expressziója az E-cadherin és β-catenin a 58As1 és 58As9 sejtek összehasonlítva HSC-58 sejtek (2A ábra). Foszforilációja β-catenin Ser33 /37 és Ser552 azt találtuk, hogy sokkal kisebb a 58As1 és 58As9 mint HSC58. Összhangban a fehérje expressziós szintjét, mRNS expressziós szintek NDRG1, vimentin, Csiga és az MMP-1 magasabb volt mindkét nagyon metasztázisos sejtvonalak, mint a szülői megfelelője (2b ábra). Ott sokkal kevésbé volt mRNS expresszióját az E-cadherin és β-catenin mind 58As1 és 58As9 mint HSC-58.

immuncitokémiai elemzése feltárta, hogy a lokalizáció az E-cadherin mind a citoplazmában, és a membrán, és a β-catenin volt többnyire helyi citoplazmában mind HSC-58 és 58As9 sejtek (2C ábra). Immunhisztokémiai analízis 58As1 nem lehetett végrehajtani, mint 58As1 növekszik felfüggesztését. Továbbá expresszióját β-catenin viszonylag kisebb volt mindkét citoplazmában és a sejtmagban, de ez csiga találtuk, hogy sokkal magasabb a nucleus 58As1 és 58As9 mint HSC-58 (2D, ábra). Megvizsgáltuk azt is, az E-cadherin promoter aktivitását (ábra 2E) és β-catenin indukált riporter aktivitás által TopFlash riporter vizsgálattal (ábra 2F), és megállapította, hogy nem volt szignifikáns csökkenés a luciferáz aktivitás által vezérelt E-cadherin promoter és által is β-catenin mindkét 58As1 és 58As9 képest HSC-58, összhangban mRNS-szintje mindkét gén. katalógusa

NDRG1 Knockdown indukálja felülszabályozása az E-cadherin és a downregulációját vimentin és csiga erősen szóródó sejtekben katalógusa

Mi a következő megvizsgálták NDRG1 kiütése kifejezetten érintett kifejezése EMT kapcsolatos gének nagyon metasztatizáló sejtvonal 58As1. Megállapítottuk két stabil NDRG1 knockdown sejt klónok, As1 /Sic50 és As1 /Sic54 transzferálásával NDRG1 shRNS be 58As1 sejteket. Mindkét As1 /Sic50 és As1 /Sic54 sejtek esetében hasonló növekedési rátát egymással és a szülői megfelelője As1 /Mock3, kétszeresére 25-27 óra tenyészetben (3A). Mindkét NDRG1 elhallgattatta sejtvonal megmutatta feszes tapadását sejtek a tenyésztő edénybe, és fibroblaszt morfológia, míg As1 /Mock3 sejtek mutatott felfüggesztés-típusú sejtek növekedését, kerek sejtek morfológiája (3B). Mi a következő hatását vizsgálták NDRG1 hangtompító a tumorigenikus aktivitása 58As1 sejtek felhasználásával kötött növekedés vizsgálattal. Mindkét NDRG1 elhallgattatta sejtvonal mutatott szignifikáns csökkenése a rögzítéstől független növekedését, amint azt a kolónia száma a lágy agar ( ^{* P <
0,01) (3C, ábra).}

Ezután összehasonlítottuk a génexpressziós profilok között As1 /Mock3 és As1 /Sic50 sejtek DNS felhasználásával microarray (4a ábra). NDRG1 akciós eredményezett megnövekedett expressziója az E-cadherin ( Cdh1 katalógusa) és P-kadherin ( CDH3 katalógusa), de csökkent kifejeződése vimentint ( VIM katalógusa) Csiga ( SNAI1 katalógusa). Mi következő végzett Western blot és qRT-RCR elemzések számos molekula, amelyek által modulált NDRG1 knockdown a microarray analízis (4B ábra, C). Ez a két sejtvonal mutatta, sokkal alacsonyabb expressziója mindkét NDRG1 mRNS és fehérje mint a As1 /Mock3 sejtekben. Továbbfejlesztett expresszióját az E-cadherin következetesen megfigyelhető As1 /Sic50 és As1 /Sic54 sejtek összehasonlítva As1 /Mock3 sejtek Western-blot-analízis. A As1 /Sic50 és As1 /Sic54 sejtek, mind Western blot és QRT-PCR analízisek megerősítették csökkent expressziója vimentin és Csiga befolyásolása nélkül expresszióját p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-Akt, Akt, a p-GSK-3β és a GSK-3β (4b ábra, C).

Másrészről, NDRG1 jól ismert, hogy elnyomják metasztázis és a sejt proliferáció által prosztata és a vastagbél rákos sejteket. A legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy a NDRG1 modulálja Wnt-β-catenin jelátviteli fokozott expressziója az E-cadherin humán prosztata és a vastagbél rákos sejt [18], [19]. Azonban NDRG1 kiütése a 58As1 sejtekben nem volt hatással a β-catenin expressziója mind fehérje és mRNS szinten (4b ábra, C). És szintén β-catenin vezérelt promotor aktivitásra TopFlash riporter assay nem mutatott különbséget a promoter aktivitását között As1 /vak és NDRG1 elhallgattatta sejtvonalakban. Ezért β-catenin expresszió nem érintette NDRG1 knockdown. NDRG1 knockdown így következetesen fokozott expresszióját az E-cadherin és csökkent expressziója Csiga és vimentin a nagyon metasztázisos sejtvonalban. Azonban nem volt nyilvánvaló változás kifejezése β-catenin által NDRG1 kiütése. Katalógusa

Fejlett E-cadherin promóter aktivitás által NDRG1 Knockdown keresztül csiga gyomorrákban Cells katalógusa

a különböző transzkripciós faktorok, amelyek elnyomják kifejezése E-cadherin beleértve csiga, csiga, Twist, TCF4 és SIP1 [20], kifejezése csiga kifejezetten modulált NDRG1 gyomorrákban sejtekben. Megvizsgáltuk, hogy kifejezése E-cadherin és /vagy vimentinre lehetne szabályozni csiga HSC-58 sejtekben. Tranziens kezelés csiga siRNS eredményezett fokozott expresszióját az E-cadherin, de nem a vimentin és NDRG1, a időfüggő módon (5A ábra). Már csak egy kis esetleges növekedése β-catenin expresszió Csiga leütést. Továbbá, E-cadherin promoter által meghajtott, luciferáz aktivitás szignifikánsan elnyomja transzfekció csiga komplementer DNS két vizsgált rákos sejtvonalak (5B, ábra). Mi a következő míg az E-cadherin promoter aktivitása között As1 /Mock3 és NDRG1 elhallgattatta sejtvonalak. Amint az 5C, nem volt szignifikáns (* p
< 0,05) erősítése az E-cadherin promotor aktivitásra NDRG1 knockdown.

GSK-3β kulcsfontosságú enzim aktiválására EMT útvonal [20], [21], valamint a foszforiláció NDRG1 [22], [23]. Expression of p-GSK-3β növelte a nagyon metasztázisos sejtvonal, 58As1 (lásd 2A ábra). Megvizsgáltuk, hogy a GSK-3β részt NDRG1 kiváltott megváltozott expressziója E-cadherin és vimentin. Inhibitor kezelést (CT99021) a GSK-3β eredményezte csökkent expressziója p-NDRG1 és p-GSK-3β, valamint fokozott expressziója az E-cadherin és β-catenin a 58As1 sejtekben (5D ábra). Amint az 5E ábra, β-catenin knockdown nem befolyásolta expresszióját az E-cadherin, vimentin és Csiga.

NDRG1 Knockdown indukál mesenchymalis Epithelialis átmeneti és elnyomja metasztázis a hashártya magasan metasztatikus gyomor Cancer Cells katalógusa

összehasonlítva tumor növekedési ráta As1 /Mock3, As1 /Sic50 és As1 /Sic54 sejtek xenograftmodellben kiderült lassabb tumor növekedési rátája egyaránt As1 /Sic50 és As1 /Sic54 által NDRG1 kiütése (6A ábra, B). NDRG1 knockdown elnyomta a helyi invázió As1 /Mock3 tumorsejtek a környező stroma és a szomszédos zsírszövetben és /vagy az izomszövet, és kapszulázott tumornövekedést (ábra a 6C). Magas expresszióját az E-cadherin volt megfigyelhető As1 /Sic50 és As1 /Sic54 tumorok, míg a magas expressziója vimentin volt megfigyelhető a rákos sejtekben az As1 /Mock3 daganatok (ábra 6D). Ezzel szemben nem volt szinte semmilyen változás kifejezése β-catenin a As1 /Sic50 és As1 /Sic54 daganatok képest As1 /Mock3 tumor. Katalógusa

Annak vizsgálatára, hogy NDRG1 kiütése befolyásolhatja áttét a hashártya és a felhalmozási ascites, összehasonlítottuk a metasztatikus potenciálját As1 /Sic50 és As1 /Mock3 sejteken ortotopikus transzplantáció. A 7A mutat be reprezentatív képek a kibővített hasüreg és a rák jelenlétét csomók a hashártya. Miután ortotopikus beoltása As1 /Sic50 sejtek száma a csomók megjelenő hashártya volt mintegy 30% -kal kevesebb, mint az eredő As1 /Mock3 sejtek, de ez a csökkenés nem volt statisztikailag szignifikáns ( p
= 0,21) (7B). Azonban csomók eredő As1 /Sic50 sejtek esetében sokkal kisebb méretű, mint az ettől As1 /Mock3 sejtek (7A). A felhalmozódás ascites által As1 /Sic50 sejtek szignifikánsan (* p < 0,01) csökkent, körülbelül 10% -a, amely által indukált As1 /Mock3 sejtek (ábra 7C). Továbbá, nem volt szignifikáns (* p
< 0,01) nőtt a túlélési arány inokulált egerek As1 /Sic50 sejteket (51 ± 16 nap), mint a 35 ± 14 nap oltott egerek As1 /Mock3 sejtek, jelezve, hogy NDRG1 knockdown meghosszabbítja a túlélést (ábra 7D).

Discussion

Mi már korábban beszámolt arról NDRG1 szorosan korrelál a tumor angiogenezis és a szegény betegek túlélésének gyomorrák, ami arra utal, hogy a NDRG1 egy prediktív biomarker malignus előrehaladásának gyomorrák [9]. A mi jelen tanulmányban azt figyelték meg a következő tulajdonságokat szolgáló megszerzése nagy metasztatikus potenciál gyomorrák: microarray, western blot és RT-PCR analízis együtt feltárta túlszabályzását NDRG1 az erősen metasztatizáló sejtvonalak 58As1 és 58As9, míg azok alacsony metasztatikus szülői párja, HSC-58; magasabb expresszióját a vimentin, a csiga és az MMP-1, és alacsonyabb expressziót az E-cadherin és β-catenin nyilvánvalóak voltak a nagyon metasztázisos sejtvonalak összehasonlítva a szülői megfelelője; A gének downregulált a nagyon metasztázisos sejtvonal NDRG1 knockdown eredményezett túlszabályzását E-cadherin, és alulszabályozása vimentin és Csiga, de szinte nincs hatással a expresszióját β-catenin; E-cadherin promoter aktivitása szignifikánsan fokozta NDRG1 akciós; NDRG1 kiütése is elnyomta peritoneális terjesztése és felhalmozása ascites és invázió erősen szóródó sejtekben a környező ép szövetek. Katalógusa

A jelen tanulmányban NDRG1 akciós eredményezte elnyomása áttét által erősen szóródó gyomorrák sejtek (6. ábra , 7), ami arra utal, hogy a NDRG1 lehet egy metasztázis promoter gén helyett metasztázisszuppresszor- gén gyomorrák. Jelen tanulmány határozottan támogatja azt az elképzelést, hogy akár NDRG1 elősegíti vagy gátolja a rosszindulatú progresszióját humán rákos függ a daganat típusa és /vagy differenciálódási állapotát [11], [12]. Ugyanakkor nem világos, hogy miért NDRG1 funkcionál tumor szupresszor vagy promóter függően tumor-típusok vagy szövettani típusok. A mi korábbi tanulmány kimutatta, hogy NDRG1 visszaszorítja a tumor növekedését és az angiogenezist a hasnyálmirigyrák keresztül NDRG1 hajtott csillapítás az NF-kB jelátviteli útvonal [24], [25]. A legújabb tanulmány arról számolt be, hogy a kifejezés metasztázisszuppresszor- gén, KAI1 katalógusa gén vesz részt NDRG1 közvetített metasztázis elnyomása prosztatarák keresztül ATF3-NF-kB útvonal [26]. További vizsgálatok szükségesek, hogy mely szabályozási mechanizmus feladata kifejezetten NDRG1 hajtott előmozdítása malignus progresszió gyomor rákos sejteket. Katalógusa

EMT egy újabb csúcspontja, amely szoros kapcsolatot tart a rák rosszindulatú progresszió beleértve elsajátítása erősen metasztatizáló potenciál [15], [16]. Jelen vizsgálatunkban, NDRG1 akciós fokozott expresszióját E-cadherin és elnyomta a kifejezés vimentint mind in vitro katalógusa és in vivo katalógusa. NDRG1 játszhat fontos szerepet a kapcsoló egy polarizált epitheliális fenotípus egy nagyon mozgékony mesenchymalis fenotípus. Részleges vagy teljes elvesztése az E-cadherin gyakran alatt megfigyelt malignizálodás számos tumorok, beleértve a gyomorrák [27], [28]. Oliveira és mtsai. [29] számolt közötti szoros kapcsolatot E-cadherin veszteség és a magas metasztatikus potenciállal gyomorrákban. Chan és munkatársai. [30] is beszámolt, oldható E-cadherin mint biomarker túléléséhez gyomorrákos betegek. NDRG1 akciós eredményezett viszonylag magasabb E-cadherin expresszió As1 /Sic50 daganatok, mint As1 /Mock3 daganatok, ami arra utal, hogy NDRG1 specifikusan ellenőrizzék az EMT lehetőleg az transzkripciós faktor csiga által gyomorrák sejtek (7E ábra). Katalógusa

Wnt jelátvitel döntő szerepet a malignus progresszió és metasztázis által tüdő- és emlőrák-sejtek [31], [32], és a Wnt jelátvitel is indukál EMT, amely magában foglalja a metasztatikus progresszió epiteliális rák [31], [33]. NDRG1 ismert, mint egy metasztázisszuppresszor- gén prosztata- és végbélrák sejt [11], [12]. Liu és munkatársai [18] arról számolt be, hogy NDRG1 elnyomja áttét keresztül Wnt /β-catenin jelátviteli prosztata rákos sejteket. Vonatkozó tanulmány a Chen és munkatársai [19] is kimutatták, hogy a NDRG1 modulálja a TGF-β-indukált EMT keresztül megváltozott expressziója β-catenin és E-cadherin colorectalis rákos sejtben. A jelen tanulmány kimutatta, csökkent expressziója β-catenin mindkét nagyon metasztázisos sejtvonalak, mint a szülői megfelelője, HSC-58. Azonban mind Western blot és QRT-PCR analízisek nem mutattak jelentős változást expressziós szintjét β-catenin és szintén β-catenin hajtott promotor aktivitás között nagyon metasztázisos 58As1 sejtek és annak két NDRG1 elhallgattatta sejtvonalakban. Úgy tűnik, kevésbé valószínű, hogy a β-catenin játszik döntő szerepet elnyomása metasztázis által NDRG1 kiütése az erősen metasztázisos rákos sejtekben.

Másrészt, a GSK-3β is ismert, hogy szerepet játszik a kontroll a EMT [20], [21], és a GSK-3β alapvető enzim foszforilezésének NDRG1, a kiváló alállapotba a GSK-3β [22], [23]. A kifejezés a p-GSK3p viszonylag magasabb volt a nagyon metasztázisos sejtvonalak, mint a szülői sejtvonalban (2b ábra). Kezelés hatásos inhibitora a GSK-3β eredményezett elnyomott kifejezés p-NDRG1 kíséretében fokozza a E-kadherin és β-catenin (5D ábra). Azonban nem volt szinte nincs különbség a kifejezés a GSK-3β és p-GSK-3β által NDRG1 kiütése az erősen metasztázisos sejtek (4b ábra), ami arra utal, hogy a GSK-3β nem játszanak jelentős szerepet a indukciójában EMT keresztül NDRG1 a gyomor rákos sejtekben.

csiga egy reprezentatív transzkripciós faktor, amely szabályozza expresszióját az E-cadherin [20]. A különböző szabályozási tényezők, amelyek a transzkripció vezérlésére E-cadherin, kifejezés csiga specifikusan modulálja NDRG1 gyomorkarcinómában használt sejtvonalak ebben a vizsgálatban. Csiga kiütése indukált túlszabályzását E-cadherin (5A ábra), és exogén tarnsfection csiga cDNS elnyomott E-kadherin-promoter aktivitását (5B ábra).

nagyon metasztázisos gyomor rákos sejtvonalak, kifejezés csiga volt felülszabályozott mint ahhoz képest, hogy az alacsony metasztatikus megfelelője, HSC-58 (2A ábra, B). Mindkét NDRG1 elhallgattatta sejtvonalak As1 /Sic50 és As1 /Sic54 mutatott csökkent expressziója Csiga képest azok a nagyon metasztázisos megfelelője, As1 /Mock3 (4b ábra, C). Továbbá, E-cadherin promoter aktivitása jelentősen ösztönözte mindkét NDRG1 elhallgattatta sejtvonalak, mint azok erősen szóródó megfelelője (5C). Katalógusa

Végeredményben NDRG1 akciós indukálta túlszabályzását E-cadherin és downregulációját vimentint csiga, és elnyomta az invázió, áttét és felhalmozása ascites a magasan metasztatikus gyomor rákos sejteket. Ez NDRG1 mediált szabályozása E-cadherin és /vagy vimentin expressziót érintett epithelialis mesenchymalis átmenet a gyomor rákos sejteket. Ez NDRG1 indukált módosítását EMT úgy tűnik, hogy legalább részben tulajdonítható a transzkripciós faktor Csiga. NDRG1, annak közvetlen összefüggésben az EMT kapcsolatos gének, részt vehetnek a megszerzése nagy metasztatikus potenciállal progresszív gyomor rákos sejteket. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Anyagok és sejtvonalak

HSC-58 jött létre a humán scirrhous gastricus karcinómák és 58As1 és 58As9 voltak egymástól függetlenül létre ismételt ortotopikus beültetése HSC-58 sejtek a gyomor fala csecsemőmirigy nélküli egerekben a korábban leírtak szerint [5], [6]. As1 /Sic50 és As1 /Sic54 sejteket által létrehozott stabil transzfekciójával NDRG1 shRNS be 58As1 sejteket. Az összes sejtvonalat RPMI-1640 tápközegben, amelyet 10% magzati borjúszérummal (FBS). BxPC-3, egy humán hasnyálmirigyrák-sejtvonalak, kaptuk az American Type Culture Collection (Manassas, VA). Anti-NDRG1 ellenanyag keletkezett a korábban leírt [34]. Más antitestek a következő helyekről vásároltuk: anti-β-aktin antitest és anti-Csiga ellenanyag voltak ABCAM; anti β-catenin antitest, anti-β-catenin (Ser 33/37), anti-β-catenin (Ser 552), anti-Wnt, anti-Ki-67, anti-GSK-3β antitest, anti-EGFR-ellenanyagot, anti-GAPDH antitest, anti-p-GSK-3β antitest, anti-ERK1 /2 antitest anti-p-ERK1 /2 antitest, anti-Akt antitest, anti-p-Akt ellenanyag volt a Cell Signaling Technology; anti-vimentin antitest a Calbiochemtől volt; anti-E-cadherin antitest a Bd. CT99021 került beszerzésre Axon Medchem BV (Hollandia). Katalógusa

génexpressziós microarray katalógusa

További RNS erősített, címkézni, és hibridizáltuk 44K Agilent 60-mer oligomicroarray a gyártó utasításai szerint (Agilent Technologies). Minden hibridizált microarray diák vizsgáltak át Agilent szkennert. Relatív hibridizáció intenzitások és a háttér hibridizáció értékeket számoltunk Agilent Feature Extraction Software. Azonosításához felfelé vagy lefelé-szabályozott gének, kiszámítottuk arányok (nem-log pikkelyes szeres-változások) a normalizált jel intenzitást minden egyes szonda közötti összehasonlítást kontroll és a kísérleti mintákban. Ezután kritériumokat állapított gének: up által szabályozott gének aránya ≥2-szeres; le-gének, aránya ≤0.5. katalógusa

Construct a NDRG1 shRNS és létrehozása NDRG1 Knockdown sejtvonalak

Ahhoz, hogy a humán a U6 siRNS alapú vektor pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA), a humán U6 promoter (amely Hind
III és a Bam
HI klónozási helyek) amplifikáltuk humán genomi DNS és az primer pár 5'-AGATCTGAATTCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGC és az 5'-AGATCTAAGCTTCTCGAGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAG, és beligáltuk a Sg katalógusa II hely pcDNA3. A részleges DNS-fragmentumokat a humán NDRG1 DNS kémiailag szintetizált és klónozva pcDNA3- hU6siRNA hasítjuk Hind katalógusa III és Bam
HI termelni pcDNA3shNDRG1. A szintetizált DNS-for pcDNA3shNDRG1 voltak: 5'-GATCCGCGTGAACCCTTGTGCGGAATTCAAGAGATTCCGCACAAGGGTTCACGTTTTTTGGAAA és 5'-AGCTTTTCCAAAAAACGTGAACCCTTGTGCGGAATCTCTTGAATTCCGCACAAGGGTTCACGCG. A csiga cDNS-t készítünk a korábban leírtak szerint [35]. Csiga cDNS-t ligáljuk a pcDNA3 (pcDNA3-Csiga). A sejteket transzfektáltuk pcDNA3shNDRG1 vagy pcDNA3-Csiga Lipofectamine 2000 (Invitrogen) a gyártó utasításai szerint. Stabil transzfektált klónokat felhasználásával létrehozott G418 szelekció.

transzfektálása kis interferáló RNS

siRNS megfelelő nukleotidszekvenciák Csiga és β-catenin cégtől vásároltuk Invitrogen (Carlsbad, CA), illetve siRNS duplexeket transzfektált Lipofectamine RNAiMAX és Opti-MEM közegben (Invitrogen) szerint a gyártó ajánlása szerint.

Luciferase Assay

Ahhoz, hogy az E-cadherin-Luc vektor, E-cadhein promoter (-262 +120) PCR-rel amplifikáltuk a következő primer párokat: 5'AGATCTTAGTGAGCCACCGGCGGGGC-3 'és 5'-AAGCTTGGCCGGGGACGCCGAGCGAGGG-3'. Hangsúlyozza azt jelzik, restrikciós enzim hasítási helyek. Az amplifikált fragmenst beligáltuk az pGEM-T Easy vektorba (Promega), és átvittük a pGL3-basic vektor (Promega) a BglII és HindIII helyek. E-cadherin-Luc és pcDNA3-Csiga transzfektáltunk Lipofectamine LTX és Opti-MEM közegben (Invitrogen) szerint a gyártó ajánlása szerint. 24 óra múlva a luciferáz aktivitás szerint mértük a gyártó utasításai (Promega). Továbbá azt is megvizsgálták a luciferázaktivitást hajtott β-catenin segítségével TopFlash riporter vektor korábban leírtak szerint [18]. Katalógusa

Lágy agar kolóniaképzése Analitika katalógusa

4 × 10 ^{3 sejteket 1 ml táptalajt tartalmazó 0,36% -os (tömeg /térfogat) felső agar rétegeztük a bazális réteg 0,72% (w /v) agar 6 lyukú lemezekre, és hagyjuk növekedni 3-4 hét. A telepeket fényképezett és a számlálást tíz véletlenszerűen látómezőben 50-szeres nagyításban fénymikroszkóppal. Mindegyik kísérletet három párhuzamossal végzünk.}

Western blot analízissel és frakcionálása sejtmagban és a citoplazmában

A sejteket lizáljuk pufferben, amely 50 mM Tris-HCl, 350 mM NaCl, 0,1% NP40-et, 5 mmól EDTA-t, 50 mM NaF, 1 mM fenil-metil-fluorid, 10 ug /ml aprotinin, 10 ng /ml leupeptin és 1 mM Na3VO4. Teljes sejt lizátumokat SDS-PAGE és blottoltuk Immobilon membránokra (Millipore Corp., Bedford, MA) a korábban leírtak szerint [24], [25]. Hogy előkészítse citoszolban és a nukleáris frakciót, a sejteket lizáltuk pufferrel (10 mM HEPES, pH = 7,9, 10 mM KCI, 10 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,4% IGEPAL és proteáz inhibitorok), és inkubáljuk 20 percig jégen. Centrifugálás után (3 perc, 5000 rpm), a felülúszót használjuk citoplazmás frakció. A kapott üledéket újraszuszpendáljuk bufferB (20 mM HEPES, pH = 7,9, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glicerin, 1 mM DTT-t és proteáz-inhibitorok), és inkubáltuk 2 órán folyamatos keverés közben 4 ° C hőmérsékleten. Centrifugálás után (5 perc, 15000 rpm), a felülúszót használtuk a nukleáris frakciót.

• PLoS One: expressziós profil Stem Cell-rokon gének neoadjuváns kezelt gyomorrák: Egy NOTCH2, GSK3b és β-catenin Gene Signature jósolja Survival
• PLoS One: szerepe a vascularis endothelialis növekedési faktor (VEGF) és a VEGF-R Genotipizálás irányadó a metasztatikus folyamat pT4a kimetszett gyomorrákos betegek