Plos ONE: N-myc nadaljnjega urejeno Gene 1 (NDRG1) Spodbuja metastaze Human Scirrhous želodca raka celic preko epitelijskih mezenhimskih Transition

Povzetek

Naša nedavna študija je pokazala, da je višji izraz N-myc navzdol reguliranih gen 1 ( NDRG1) je tesno povezana s slabo prognozo pri bolnikih z rakom želodca. V tej študiji, smo vprašali, ali ima NDRG1 osrednje vloge v malignega napredovanje vključno metastaz želodca rakavih celic. Z gensko izražanje mikromrež analize izražanja NDRG1 pokazala med skupno 3691 višje povečanje up-reguliranih genov v zelo metastatskega želodčni rak celične linije (58As1) kot starševske nizko metastatskega kolegico (HSC-58). Celične linije visoko metastatskih pokazala zmanjšano ekspresijo E-kadherina, skupaj s povečano ekspresijo vimentina in Polž. Zmanjšana izraz E-kadherina je bila obnovljena po navadni rasklapanje v zelo metastatskih celičnih linijah. Naslednjič stabilne NDRG1 rasklapanje celičnih linij (AS1 /Sic50 in AS1 /Sic54) iz celične linije visoko metastatskega in oba celičnih linij pokazala izboljšano ekspresijo E-kadherina in zmanjšano ekspresijo vimentina in Polž. In prav tako je bilo ugotovljeno, E-kadherina aktivnost luciferaze, promotor poganja se poveča za NDRG1 rasklapanje v celični liniji zelo metastatskega. NDRG1 rasklapanje želodčnega rakave celice pokazala zatreti invazijo rakavih celic v prostorskih tkiva, zatajitev metastaze na potrebušnice in zmanjšal kopičenje ascitesa pri miših z bistveno izboljšano stopnjo preživetja. To je prva študija, ki dokazujejo, da ima NDRG1 svojo osrednjo vlogo v maligno napredovanje raka želodca preko epitelija mezenhimskega prehodu

Navedba. Ureshino H, Murakami Y, Watari K, Izumi H, Kawahara A, Kage M et al. (2012) N-myc nadaljnjega urejeno Gene 1 (NDRG1) Spodbuja metastaze Human Scirrhous želodca raka celic preko epitelijskih mezenhimskih tranziciji. PLoS ONE 7 (7): e41312. doi: 10,1371 /journal.pone.0041312

Urednik: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Združene države Amerike

Prejeto: 8. december, 2011; Sprejeto: 22. junij 2012; Objavljeno: 23. julij 2012

Copyright: © 2012 Ureshino et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija je bil podprt s donacija-in-pomoč za raziskave raka, ki ga je ministrstvo za izobraževanje, kulturo, šport, znanost in tehnologijo Japonske (dr Ono), ter za raziskave 3. Izraz celovit nadzor za raka, ki ga je Ministrstvo za zdravje, dela in dobro počutje na Japonskem (Dr. Kuwano). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je ena izmed najpogostejših malignih obolenj na Japonskem in drugih azijskih državah. Prognoza pacient scirrhous karcinom želodca je še posebej slabo. Scirrhous karcinom želodca pogosto spremlja peritonealno razširjanje in metastaz v bezgavkah in jetra, ki so resni problemi, ki jih je treba nadzorovati. Izražanje genov profil pokazala genskih ojačanji K-Sam in c-Met pri 30-40% scirrhous želodca raka, in da je prekomerno različnih rastnih faktorjev, kot je preoblikovanje rastni faktor-P (TGF-beta), rast iz trombocitov faktor (PDGF), inzulinu podobnega rastnega faktorja (IGF) in fibroblastni rastni faktor-2 (FGF-2) [1]. Nedavna analiza DNA mikromrež je pokazala posebno uravnavanjem več genov, vključno s SPARC
, RGEIII
, S100A10
in vrsto kolagen I [2] - [4].

Živalski modeli, ki odražajo značilnosti rakasto peritonitis in metastaz na potrebušnice so pomembni za razumevanje razvoja malignega napredovanja rak želodca. Yanagihara et al.
[5] najprej ugotovila celične linije iz scirrhous človeškega raka želodca za HSC-58, in nato oblikoval dve sublines, 58As1 in 58As9, z velikim potencialom za peritonealno razširjanje in bezgavkah metastaze ga ponovi orthotopic inokulacija 58 HSC celic v želodčni steni miši [6] [7]. Te sublines pogosto povzroča kopičenje ascitesa po orthotopic implantacijo in kažejo povečano izražanje genov, ki kodirajo proteaze in proteine, vpletene v celični adheziji, celično motiliteto, proliferacijo in angiogenezo [6]. Prav tako selektivno rast v želodčni submucosa in napadejo globlje plasti, da bi dosegli serozne ravnino želodcu [7]. Vendar pa še vedno ni jasno, zakaj so pridobili tako velik potencial za metastaze v času izbire.

V našem tej raziskavi smo uporabili te zelo metastaznih celičnih linij naj razišče, kako človek lahko želodca rakave celice pridobijo metastatskega potenciala. Najprej smo primerjali izražanje genov profilov med visoko metastatskih in nizke metastatskih linij starševskih celic, z analizo mikromrež. Osredotočili smo se na enem genu imenom N-myc navzdol urejeno gen 1 (NDRG1), ker je bilo ugotovljeno, da je izrazito povečana pri visoko metastatskih želodčnega raka celičnih linijah v primerjavi z njihovimi kolegi celic. Prav tako je bilo že poročali, da je bil NDRG1 izražanja predikativna marker za maligni napredovanje in slabo prognozo pri bolnikih, [8] želodca. V skladu s to študijo, smo ugotovili, da je bila visoka NDRG1 izraz bistveno povezana s tumorsko angiogenezo in malignega napredovanje skupaj s slabo prognozo raka želodca [9]. Prav tako smo poročali, da NDRG1 rasklapanje inducira zmanjšano produkcijo močnih angiogenskih faktorjev in tumorsko angiogenezo s pljučnim rakom celice, in da NDRG1 je napovedni marker za tumorsko angiogenezo in slabo prognozo pri bolnikih z ne-drobnoceličnim pljučnim rakom [10]. NDRG1, eden od štirih NDRG družinskih genih, tako kaže različne funkcije [11], in NDRG1 naloge, bodisi kot metastaz supresorski ali kot onkogenih in maligni promotor, odvisno od vrste tumorjev [11], [12]. Poleg tega je izražanje gena NDRG1 skrbno nadzorujejo N-myc in z njim povezanih myc družine proteinov [13] in prekomerno c-myc inducirane epitelija mezenhimskega prehodu (EMT) v mlečne epitelnih celic [14]. Pomembna vloga EMT se pogosto omenja v svojem tesnem okviru razvoja in napredovanja tumorja, vključno metastaz raka [15], [16]. Vendar v teh študijah je regulatorno vlogo NDRG1 ni bilo raziskano. V naši tej študiji smo raziskovali metastatskega potenciala želodčnih rakavih celic z njeno skladnost z vlogo, ki temelji na EMT za NDRG1.

Rezultati

Primerjava Cell rast, mobilni morfologijo, rast tumorja, razširjanje in Gene Expression profili med visoko metastatski želodca rakave celične linije in njihova nizka metastatskega Protipostavka

v skladu s prejšnjimi raziskavami [6], [7], zelo metastatskim rakave celične linije 58As1 in 58As9 pokazale višje stopnje rasti kot njihovi starševski kolega, HSC-58, s podvojitvijo časi 23-26 ur v primerjavi s 30 ur za starševske celice (Slika 1A). 58As1 celice zlahka ločijo in pokazala rast vzmetenje tipa celic z okroglim morfologijo, medtem ko so bile HSC-58 in 58As9 celice pritrjene in pokazala rast večplastna celic z fibroblastic morfologijo (slika 1B). Oba 58As1 in 58As9 celice so pokazali precej višje stopnje rasti tumorja v podkožnem modelu ksenotransplantskih primerjavi s starševskim HSC-58 celice (slika 1C). Prejšnje študije so pokazale, da je orthotopic presajanje 58As1 celic povzroča veliko večje kopičenje peritonealno razširjanje in ascitesa, kot je HSC-58 celic [6], [7]. nadalje smo potrdili peritonealno razširjanje celic in jih vsaditev v peritonealno votlino miši. Miši vsadi z 58As1 celic je pokazala videz povprečno 8 ± 3 vidnih vozlički v mezenterij vsake miši in kopičenje ascites (od 0.7-2.5 ml /miš) (Slika 1D, E). Nasprotno, miši vstavili starševskih HSC-58 celic je pokazala nastanek malo če sploh drobnih gomoljev, in nobenega očitnega kopičenja ascites.

bomo naslednjič v primerjavi z izrazom profili genov med 58As1 celic in njihovih staršev kolegom HSC- 58, s pomočjo analize DNK mikromrež. Od 41.000 RNA transkriptov in variant, smo ugotovili, 3691 diferencialno izraženih genov, ki so bili molekul do 2-krat in 3536 genov, ki so navzdol reguliranih za 0,5-krat ali manj 58As1 celicah v primerjavi z HSC-58 celic. Slika 1F predstavil gene, ki so različno izražene v 58As1 celicah v primerjavi z 58 HSC-celic, omejene na tiste, ki pripadajo družini NDRG in gene, povezane z metastazami, vključno metaloproteinaz matriksa (MMP) /katepsinov, oprijem in epitela-mezenhimskega-prehod ( EMT). Od štirih genov v družini NDRG [17], je izraz NDRG1 in NDRG4 povečana pri celični liniji visoko metastatskega (58As1) v primerjavi s celično linijo starševskega (HSC-58). Izraz, povezanih z EMT genov v 58As1 celicah je še posebej vplivala pridobitev visoke metastatskega potenciala. Izraz epitelija specifičnih genov, vključno z e-kadherina ( CDH1
), P-kadherina ( CDH3
) in β-catenin ( CTNNB1
), je navzdol reguliranih . Nasprotno, le MMP1 ( MMP1
) izraz je bil izrazito molekul; izražanje katepsina L ( CTSL1
) se je povečalo, vendar katepsina B ( CTSB
) ni bilo. Izraz mesenchyme specifičnih genov, vimentin ( VIM
) in polža ( SNAI1
), ki je ključna transkripcijski faktor za zatiranje E-kadherina izražanja, je molekul.

Okrepljeno NDRG1 Gene Expression v zelo metastatski želodca rakave celične linije

Nadaljevali smo primerjali izražanje proteinov več genov v HSC-58, 58As1 in 58As9 celic (slika 2A). Izraz NDRG1 je izrazito razširjena in da vimentina, polž, p-ERK1 /2, povečala tudi bil p-Akt in p-GSK-3β, tako 58As1 in 58As9 celic v primerjavi z HSC-58 celice. Ni razvidno izraz Wnt3a in Wnt5a v teh celičnih linijah (podatki niso prikazani). Nasprotno pa smo opazili zmanjšano ekspresijo E-kadherina in beta-catenin v 58As1 in 58As9 celic v primerjavi z HSC-58 celice (slika 2A). Fosforilacijo beta catenin Ser33 /37 in Ser552 je bilo ugotovljeno, da je veliko manj 58As1 in 58As9 kot HSC58. V skladu z ravnmi izražanja beljakovin, so nivoji mRNA izraz za NDRG1, vimentina, Polž in MMP-1 višji v obeh zelo metastatskih celičnih linij kot starševske kolegom (slika 2B). Tam je bilo veliko manj mRNA izraz E-kadherina in beta-catenin tako 58As1 in 58As9 kot HSC-58.

imunocitokemijski analiza je pokazala, da je lokalizacija E-kadherina tako v citoplazmi in membrane, in beta-catenin predvsem lokalizirana v citoplazmi v obeh HSC-58 in 58As9 celic (slika 2C). Imunocitokemijski analiza za 58As1 ni bilo mogoče izvesti, kot 58As1 raste v suspenziji. Poleg tega je izraz beta catenin tako v citoplazmi in jedra relativno nižji, Polž je bilo ugotovljeno, da je v jedru 58As1 in 58As9 precej višja kot HSC-58 (slika 2D). Prav tako preučila E-kadherina promotor aktivnost (slika 2E) in β-catenin povzroča novinar dejavnost po TopFlash reporterskega testa (slika 2F) in ugotovil, da se je znatno zmanjšalo luciferazni dejavnosti, ki ga E-kadherina promotor poganja in tudi z beta catenin tako 58As1 in 58As9 primerjavi z HSC-58, ki je skladen z mRNA obeh genov.

NDRG1 rasklapanje inducira uravnavanjem E-kadherina in downregulation vimentina in Polž v visoko metastatskih celic

Mi Naslednja preučila, ali NDRG1 rasklapanje posebej vplivala na izražanje povezanih EMT genov v celični liniji visoko metastatskega, 58As1. Ugotovili smo dve stabilni NDRG1 rasklapanje celičnih klonov, AS1 /Sic50 in AS1 /Sic54 s transfekcijo NDRG1 shRNA v 58As1 celice. Oba AS1 /Sic50 in AS1 /Sic54 celice so pokazale podobne stopnje rasti med seboj in starševske nasprotne AS1 /Mock3, s podvojitvijo čase 25-27 ur v kulturi (slika 3A). Oba NDRG1 utihnile celične linije je pokazala tesno adhezijo celic na posodo kulture in fibroblastic morfologijo, ker AS1 /Mock3 celice pokazala rast mobilnega vzmetenje tipa z morfologije okroglo celic (slika 3B). Mi poleg preučevala učinek NDRG1 utišanje na tumorogenega dejavnosti 58As1 celic, ki uporabljajo test za rast sidrišča neodvisen. Oba NDRG1 utihnile celične linije je pokazala znatno zmanjšanje njihove pritrditve neodvisen rasti, kot po številu kolonij je navedeno v mehkem agarju ( ^{* p <
0,01). (Slika 3C)}

Potem smo primerjali profilov izražanja genov med AS1 /Mock3 in AS1 /Sic50 celic s pomočjo analize DNK mikromrež (slika 4A). NDRG1 rasklapanje povzročilo povečano izražanje E-kadherina ( CDH1
) in P-kadherina ( CDH3
), vendar zmanjšano izražanje vimentina ( VIM
) in Polž ( SNAI1
). Naslednjič izvedli Western Blot in QRT-RCR analize za več molekul, ki so modulirane s NDRG1 rasklapanje v analizo mikromrež (slika 4B, C). Ti dve celične linije pokazala precej nižje izražanje tako NDRG1 mRNA in beljakovin v primerjavi s AS1 /Mock3 celic. Povečana ekspresija E-kadherina dosledno upoštevati pri AS1 /Sic50 in AS1 /Sic54 celic v primerjavi z AS1 /Mock3 celic z Western blot analizo. V AS1 /Sic50 in AS1 /Sic54 celic, tako western blot in QRT-PCR analize in potrdila zmanjšano ekspresijo vimentina in Polž brez vpliva na ekspresijo p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-Akt, Akt, p-GSK-3p in GSK-3β (slika 4B, C).

po drugi strani pa je NDRG1 dobro znano, da zatre metastaze in proliferacijo celic za prostati in raka debelega črevesa celic. Nedavne študije so pokazale, da NDRG1 modulira NT-β-catenin signalnih poti z izboljšano ekspresijo E-kadherina v humani prostati in raka debelega črevesa celico [18], [19]. Vendar NDRG1 razgradljiv v 58As1 celicah ni vplival ekspresije na β-catenin tako na proteina in stopnji mRNA (slika 4B, C). In tudi β-catenin poganja promotor dejavnost, ki jo TopFlash reporterskega testa pokazala nobene razlike v aktivnosti promotorja med AS1 /Mock in NDRG1 utišani celičnih linij. Zato, β-catenin izraz ni vplivala NDRG1 rasklapanje. NDRG1 rasklapanje torej stalno povečano ekspresijo E-kadherina in zmanjšano ekspresijo Polž in vimentina v celični liniji zelo metastatskega. Vendar pa ni jasno, spremembe v izražanju beta catenin s NDRG1 rasklapanje.

Izboljšana E-kadherina Promotor Aktivnost NDRG1 rasklapanje skozi Polž želodčnega raka celic

različnih transkripcijskih faktorjev, ki zavirajo izraz E-kadherina vključno polž, Slug, Twist, TCF4 in SIP1 [20], izraz polž je bil posebej prirediti NDRG1 v želodčnih rakavih celic. preučila smo, ali bi se izraz E-kadherina in /ali vimentina ureja Polž v HSC-58 celic. Prehodno zdravljenje z Polž siRNA povzročilo povečano ekspresijo E-kadherina, ne pa da vimentina in NDRG1, v odvisnosti od časa način (slika 5A). Prišlo je le malo, če vsako povečanje β-catenin izražanja Polž rasklapanje. Poleg tega je bila E-kadherina aktivnost luciferaze-promotor poganja močno zavirajo transfekcijo Polž komplementarne DNA v dveh raka celičnih linijah testiranih (slika 5b). Mi poleg primerjavi dejavnost E-kadherina promotor med AS1 /Mock3 in njenih NDRG1 utišani celičnih linijah. Kot je prikazano na sliki 5C, ni bilo pomembno (* p
< 0,05) povečanje E-kadherina aktivnost promotorja ga NDRG1 rasklapanje

GSK-3β je ključni encim za aktiviranje EMT. pot [20], [21], pa tudi za fosforilacijo NDRG1 [22], [23]. Izraz p-GSK-3p bilo v celični liniji visoko metastatskega povečala 58As1 (glej sliko 2A). preučiti smo, ali je bila GSK-3β vključeni v NDRG1 inducirane spremenjeno izražanje E-kadherina in vimentina. Zdravljenje z zaviralcem (CT99021) z GSK-3p povzročila zmanjšano ekspresijo p-NDRG1 in p-GSK-3p, in povečana tudi izražanje E-kadherina in beta-catenin v 58As1 celice (Slika 5D). Kot je prikazano na sliki 5E, β-catenin rasklapanje ni vplival na izražanje E-kadherina, vimentina in Polž.

NDRG1 rasklapanje povzroča mezenhimskih epitelijskih prehod in zavira Metastasis na potrebušnice, ki ga zelo metastatski želodca raka celic

Če primerjamo stopnje rasti tumorja pri AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 in AS1 /Sic54 celic v modelu ksenotransplantskih pokazala počasnejše rasti tumorja obeh AS1 /Sic50 in AS1 /Sic54 s NDRG1 rasklapanje (slika 6A, B). NDRG1 rasklapanje zatreti lokalno vdor AS1 /Mock3 tumorskih celic v okoliško strome in sosednjim maščobno in /ali mišičnega tkiva in kapsulah rast tumorja (slika 6C). Visoka izraz E-kadherina opazili v AS1 /Sic50 in AS1 /Sic54 tumorjev, medtem ko so opazili visoke izraz vimentina v rakavih celicah AS1 /Mock3 tumorjev (Slika 6d). Po drugi strani pa skoraj ni bilo sprememb v izražanju beta catenin v AS1 /Sic50 in AS1 /Sic54 tumorjev v primerjavi z AS1 /Mock3 tumorja.

Da bi preverili, ali bi NDRG1 rasklapanje vpliva metastaze na potrebušnice in kopičenje ascitesa, smo primerjali metastatskega potenciala AS1 /Sic50 in AS1 /Mock3 celic po orthotopic presaditvi. Slika 7A prikazuje reprezentativne slike razširjene trebušne votline in prisotnost raka gomoljev na peritonej. Po orthotopic inokulacijo AS1 /Sic50 celic, je število gomoljev, ki se pojavljajo v potrebušnice približno 30% manj od tistih, ki izhajajo iz AS1 /Mock3 celic, vendar to zmanjšanje ni bila statistično značilna ( p
= 0,21) (slika 7B). Vendar vozliči posledica AS1 /Sic50 celic je pokazala precej manjše velikosti kot tisti iz AS1 /Mock3 celic (slika 7A). Akumulacija ascitesa z AS1 /Sic50 celic signifikantno (* p < 0,01) zmanjšal na približno 10% tiste, ki jo AS1 /Mock3 celic (slika 7c) inducirane. Poleg tega je pomembno (* p
< 0,01) povečanje stopnje preživetja miši, cepljenih z AS1 /Sic50 celic (51 ± 16 dni), v primerjavi z 35 ± 14 dni za miši, cepljenih z AS1 /Mock3 celice, ki kažejo, da NDRG1 rasklapanje podaljša preživetje (Slika 7D).

Pogovor

smo že poročali, da je NDRG1 tesno povezana s tumorsko angiogenezo in slabe preživetje pri bolnikih z rakom želodca, kar kaže, da NDRG1 je napovedni biološki marker za maligni napredovanje raka želodca [9]. Iz naše tej študiji smo ugotovili naslednje lastnosti so podlaga za pridobitev visoke metastatskega potenciala pri raku želodca: mikromrež, Western Blot in RT-PCR analize skupaj razkrila uravnavanjem NDRG1 v zelo metastatskih celičnih linij, 58As1 in 58As9, v primerjavi z njihovimi nizka metastatskega starševski kolega, HSC-58; višja izraz vimentina, Polž ter MMP-1 in manjši izražanja E-kadherina in beta-catenin bilo očitno v vrsticah visoko metastaznimi celic v primerjavi s starševskim protiutež; genov navzdol reguliranih v celični liniji visoko metastatskega, NDRG1 rasklapanje povzročilo uravnavanjem E-kadherina, in downregulation za vimentina in Polž, vendar skoraj brez vpliva na izražanje beta-catenin; dejavnost E-kadherina promotor je precej razširjen s NDRG1 rasklapanje; NDRG1 rasklapanje zatreti tudi peritonealno razširjanje in zbiranje ascitesa in napad na visoko metastatskih celic v okoliških normalnih tkivih.

V tej študiji NDRG1 rasklapanje povzročila ukinitev metastaz ga zelo metastatskih želodčnih rakavih celic (Slika 6 , 7), kar kaže, da NDRG1 lahko metastaze promotor gena namesto metastaze supresor gena raka želodca. Naša ta študija močno podpira zamisel, da če NDRG1 spodbuja ali zavira maligni napredovanje človeškega raka je odvisna od vrste tumorjev in /ali stanje diferenciacije [11], [12]. Vendar pa še vedno ni jasno, zakaj NDRG1 deluje kot zaviralnih ali promotorja odvisno od vrste tumorjev ali histoloških tipov. Naša predhodna študija je pokazala, da NDRG1 zavira rast tumorjev in angiogenezo raka trebušne slinavke z NDRG1 poganja slabljenje NF-κB signalne poti [24], [25]. Nedavna študija je poročala, da izraz metastaze supresor gena, KAI1
gen, ki je vključen v NDRG1 posredovano metastaz preprečevanju raka na prostati s pomočjo ATF3-NF-κB poti [26]. Nadaljnja raziskava je potrebno razumeti, kateri regulativni mehanizem je posebej odgovoren za NDRG1 pogon spodbujanje malignega napredovanja s strani želodca rakavih celic.

EMT je nov vrhunec, ki se lahko tesno povezana z rakom malignim napredovanje vključno pridobitev visoko metastatskega potenciala [15] [16]. V naši tej študiji, NDRG1 rasklapanje okrepljeno izražanje E-kadherina in zatreti izražanje vimentina tako in vitro
in in vivo
. NDRG1 lahko igrajo ključno vlogo pri prehodu z polarizirano epitela fenotipa na zelo gibljivih mezenhimskega fenotip. Delna ali popolna izguba E-kadherina je pogosto opaziti pri napredovanju proti malignih bolezni v številnih tumorjev, vključno z rakom želodca [27], [28]. Oliveira et al. [29] poroča tesno povezavo med izgubo E-kadherina in visoko metastatskega potenciala pri raku želodca. Chan s sod. [30] poročajo tudi topni E-kadherina kot biomarkerja za daljšega preživetja bolnikov z rakom želodca. NDRG1 rasklapanje povzročilo relativno višje izražanje E-kadherina v AS1 /Sic50 tumorjih kot v AS1 /Mock3 tumorjev, kar pomeni, da lahko NDRG1 posebej nadzorovati EMT po možnosti z prepis faktor Polž s želodčnih rakave celice (Slika 7e).

NT signalizacija ima osrednje vloge v malignega napredovanja in metastaz jih pljuč in dojke rakavih celic [31], [32], in NT signalizacija povzroča tudi [33] EMT, ki vključuje metastatskega napredovanje raka epitelijskega [31],. NDRG1 je znan kot metastaz supresorski gen v prostati in kolorektalnega raka celic [11], [12]. Liu et al [18] je poročal, da NDRG1 zavira metastaze skozi NT /β-catenin signalne poti v rakavih celic prostate. Ustrezen študija Chen et al [19] je prav tako pokazala, da NDRG1 modulira TGF-beta-inducirane EMT s spremenjeno izražanje P-catenin in E-kadherina v debelem rakave celice. Naš sedanji študija je pokazala zmanjšano izražanje beta catenin tako zelo metastatskih celičnih linij, v primerjavi s starševskim kolegom HSC-58. Toda tako western blot in QRT-PCR analize niso pokazale znatne spremembe v stopnjah izražanja v beta-catenin in tudi β-catenin poganja promotor dejavnosti med visoko metastatskih 58As1 celice in njenih dveh NDRG1 utišani celičnih linijah. Zdi se manj verjetno, da ima β-catenin osrednjo vlogo pri preprečevanju metastaz po NDRG1 rasklapanje v visoko metastaznimi rakavih celic.

Po drugi strani pa je znano tudi GSK-3β da igrajo vlogo pri nadzoru EMT [20], [21], in GSK-3β je pomemben encim za fosforilacijo NDRG1, odlično substate z GSK-3P [22], [23]. Izraz p-GSK3P je v smeri visoko metastatskih celic od njihove celične linije starševskega (slika 2B) sorazmerno višji. Zdravljenje z močnim zaviralcem GSK-3p povzročilo zatreti izražanje p-NDRG1, skupaj z uravnavanjem E-kadherina in beta-catenin (Slika 5D). Vendar pa ni bilo skoraj nobene razlike v izražanju GSK-3P in p-GSK-3p s NDRG1 rasklapanje v zelo metastatskih celicah (slika 4b), kar kaže, da GSK-3β ne sme igrati pomembno vlogo pri indukcijo EMT skozi NDRG1 v želodčnih rakavih celic.

polž je predstavnik transkripcijski faktor, ki nadzira izražanje E-kadherina [20]. Različnih regulatornih faktorjev, ki transkripcijsko nadzira E-kadherina, je izraz Polž specifično modulirajo NDRG1 v želodčnih raka celičnih linijah, uporabljenih v tej študiji. Polž rasklapanje povzroča Povecanje E-kadherina (slika 5A), in eksogeno tarnsfection iz Polž cDNA zatreti E-kadherina promotor aktivnosti (slika 5B).

V zelo metastatskih želodčnega raka celičnih linijah, je izraz Polž molekul, kot je glede na njihovo nizko metastatskega protiutež, HSC-58 (slika 2A, B). Oba NDRG1 utihnile, celične linije, AS1 /Sic50 in AS1 /Sic54, pokazala zmanjšano izražanje Polž v primerjavi z njegovo visoko metastatskega kolegom, AS1 /Mock3 (slika 4B, C). Poleg tega je bila E-kadherina promotor dejavnost močno spodbudila tako NDRG1 utihnile celične linije v primerjavi z njegovo visoko metastatskega kolegom (slika 5C).

Na koncu NDRG1 rasklapanje povzroča uravnavanjem E-kadherina in downregulation vimentina in polž, in zatrl invazijo, metastaze in kopičenje ascitesa z visoko metastatskih želodca rakavih celic. Ta NDRG1 posredovano uravnavanje E-kadherina in /ali vimentin izraz prizadete epitelijske mezenhimskega prehoda želodca rakavih celic. Zdi se, da je vsaj delno posledica transkripcijskim faktorjem Polž to NDRG1 povzroča sprememba EMT. NDRG1, v njeni neposredni zvezi s povezanimi-EMT genov, lahko sodelujejo pri pridobitvi visoke metastatskega potenciala s progresivnimi želodca rakavih celic.

Materiali in metode

Materiali in celičnih linij

HSC-58 je bila ustanovljena iz človeških scirrhous želodčnih karcinomov in 58As1 in 58As9 so neodvisno določi ponavljajoče orthotopic implantacijo 58. HSC-celicah v želodčni steni miši, kot je prej opisano [5], [6]. AS1 /Sic50 in AS1 /Sic54 celice so bile določene s stabilno transfekcijo NDRG1 shRNA v 58As1 celice. Vse celične linije smo ohranjali in RPMI-1640 medij z dodatkom 10% fetalnega govejega seruma (FBS). BxPC-3, a človeški pankreatične rakave celične linije, dobimo iz American Type Culture Collection (Manassas, VA). Anti-NDRG1 protiteles je bila pripravljena kot je opisano predhodno [34]. Drugi protitelesa so bile kupljene na naslednji način: anti-β-aktina protitelesa in anti-polž protitelesa iz Abcam; anti β-catenin protitelo, anti-β-catenin (ser 33/37), anti-β-catenin (ser 552), anti-NT, anti-Ki-67, anti-GSK-3β protitelo, anti-EGFR protitelesca, anti-GAPDH protitelo, anti-p-GSK-3β protitelo, anti-ERK1 /2 protitelesa anti-p-ERK1 /2 protitelesa, anti-AKT protitelo, anti-p-AKT protitelesa iz signalizacijo med celicami tehnologijo; anti-vimentin protitelesa bil iz Calbiochem; anti-E-kadherina protiteles je bila od BD. CT99021 je bila kupljena od Axon Medchem BV (Nizozemska).

Gene Expression Mikromreže

Dodatni RNA smo pomnožili, označeni in hibridizirali na 44K Agilent 60-mer oligomicroarray v skladu z navodili proizvajalca (Agilent Technologies). Vse hibridizirana mikromrež diapozitivi so skenirani z Agilent skener. Relativni hibridizacije intenzivnosti in vrednosti hibridizacije ozadja so bile izračunane z Agilent za kopiranje programske opreme. Če želite ugotoviti, gor ali dol-regulirani geni smo izračunali razmerja (non-log pomanjšana raztegljiv spremembe) iz normiranih intenzitete signala vsake sonde za primerjavo med kontrolo in eksperimentalnih vzorcih. Nato smo ugotovili, merila za regulirane genov: do reguliranih genov, razmerje ≥2-krat; navzdol reguliranih genov, razmerje ≤0.5.

konstrukt NDRG1 shRNA in vzpostavitev NDRG1 rasklapanje Cell Lines

Za pridobitev humana U6 siRNA vektor, ki temelji na pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA), U6 promotor človeškega (ki vsebuje Hind
III in Bam
kloniranja HI mest) smo pomnožili iz humane genomske DNA s primarnim parom 5'-AGATCTGAATTCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGC in 5-AGATCTAAGCTTCTCGAGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAG, in vezan v Bgl
II mesto pcDNA3. Delna DNA fragmenti človeškega NDRG1 DNK so kemično sintetizirane in klonirali v pcDNA3-hU6siRNA razcepi Hind
III in Bam
HI za proizvodnjo pcDNA3shNDRG1. V sintetizirane DNA za pcDNA3shNDRG1 so: 5'-GATCCGCGTGAACCCTTGTGCGGAATTCAAGAGATTCCGCACAAGGGTTCACGTTTTTTGGAAA in: 5'-AGCTTTTCCAAAAAACGTGAACCCTTGTGCGGAATCTCTTGAATTCCGCACAAGGGTTCACGCG. CDNA polž smo pripravili kot smo že prej [35] opisano. Polž cDNA ligiramo v pcDNA3 (pcDNA3-Polž). Celice so transfekciji s pcDNA3shNDRG1 ali pcDNA3-polž uporabo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) po protokolu proizvajalca. Stabilno transfecirane kloni so bile določene s pomočjo izbor G418.

Transfekcija male interferenčne RNA

siRNA ustreza nukleotidnih zaporedij Polž in beta-catenin so bile kupljene od Invitrogen (Carlsbad, CA), v tem zaporedju, siRNA duplexes so tranfected uporabo Lipofectamine RNAiMAX in Opti-MEM medij (Invitrogen), v skladu s priporočili za izdelavo je.

luciferaza Vsebnost

za pridobitev E-kadherina-Luc vektor, E-cadhein promotor (-262 +120) smo pomnožili s PCR z uporabo naslednjih oligonukleotidov pare: 5'AGATCTTAGTGAGCCACCGGCGGGGC-3 'in 5'- AAGCTTGGCCGGGGACGCCGAGCGAGGG-3'. Poudarja kažejo restrikcijska encima cepitvenih mest. Pomnožene fragment je bil vezan v enostaven vektor pGEM-T (Promega) in prenese na pGL3-bazni vektor (Promega) v BglII in Hindlll straneh. E-kadherina-luc in pcDNA3-polž transfektiramo uporabo Lipofectamine LTX in Opti-MEM medij (Invitrogen), v skladu s priporočili za izdelavo je. Po 24 urah smo luciferazo aktivnost merjena v skladu z navodili proizvajalca (Promega). Poleg tega smo pregledali tudi luciferazno aktivnost ga beta catenin poganja s pomočjo TopFlash novinar vektor kot je opisano prej [18].

Mehka Agar preizkus tvorbe kolonij

4 × 10 ^{3 celice zasadimo v 1 ml gojišča, ki vsebuje 0,36% (m /v) zgornji agar zložen nad bazalni sloj 0,72% (m /v) agar v 6 vdolbinami in pustimo, da rastejo 3-4 tedne. Kolonije so fotografirali in šteje v desetih naključno izbranih področjih Glede na 50x povečavi s pomočjo svetlobnega mikroskopa. Vsak poskus smo izvedli v treh izvodih.}

Western Blot Analiza in frakcioniranjem jedrom in citoplazmo

Celice smo lizirali v pufru, ki vsebuje 50 mM Tris-HCl, 350 mM NaCI, 0,1% NP40 5 mm EDTA, 50 mM NaF, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid, 10 ug /ml aprotinina, 10 ug /ml leupeptina in 1 mM Na3VO4. Skupaj lizati celic so bili izpostavljeni SDS-PAGE in opral na Immobilon membran (Millipore Corp., Bedford, MA), kot prej opisanih [24], [25]. Priprava citosol in jedrske frakcijo smo celice lizirali v bufferA (10 mM Hepes, pH 7,9, 10 mM KCI, 10 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,4% IGEPAL in inhibitorji proteaz) in inkubiramo 20 minut na ledu. Po centrifugiranju (3 min 5000 rpm) smo supernatant uporabimo kot citoplazemski frakcije. Nastale pelete smo ponovno suspendirali v bufferB (20 mM Hepes, pH 7,9, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1 mM DTT in zaviralci proteaz) ter inkubirali na 2 uri s stalnim stresanjem pri 4 ° C. Po centrifugiranju (5 min 15.000 vrtljajev na minuto), je bil supernatant uporabimo kot jedrske frakcije. Jedra smo obarvali z DAPI.

• Plos ONE: Izražanje profiliranje izvornih celic Povezane genov v-neoadjuvantni Obdelan Rak želodca: A NOTCH2, GSK3B in β-catenin Gene Podpis napoveduje preživetje
• Plos ONE: Vloga žilnih endotelijskih rastnih faktorjev (VEGF) in VEGF-R genotipizacije v Usmerjanje vzorcu širjenja v pT4a odstranjenimi Rak želodca bolnikov