Финансирование:. Это исследование была поддержана грантом-в-помощь по исследованию рака от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники Японии (д-ру Ono), а 3-й срок комплексных исследований по контролю за рака Министерства здравоохранения, труда и социального обеспечения Японии (доктор Kuwano). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение Животные модели, которые отражают характеристики раковой перитонита и метастазами в брюшину играют важную роль в понимании развития злокачественной прогрессии от рака желудка. Yanagihara и др. Сравнение клеточного роста, морфологии клеток, роста опухоли, распространение и экспрессии генов Профили между высокой метастатической рака желудка клеточных линий и их низкая метастатического Enhanced NDRG1 экспрессии генов в высокой метастатической рака желудка клеточных линий NDRG1 Нокдаун Индуцирует повышающую регуляцию Е-кадгерина и подавлением виментин и Snail в сильно метастатических клеток различных факторов транскрипции, которые подавляют экспрессия Е-кадгерина включая Snail, Slug, кручение, Tcf4 и SIP1 [20], экспрессия Snail был специально модулируется NDRG1 в желудочном раковых клеток. Мы исследовали, является ли экспрессия Е-кадгерина и /или виментину может регулироваться с помощью Улитка в клетках HSC-58. Переходный лечение Snail миРНК привело к увеличению экспрессии Е-кадгерина, но не то, что из виментину и NDRG1, в зависимости от времени (рис 5А). Был лишь незначительное, если любое увеличение экспрессии β-катенина по Snail нокдаун. Кроме того, Е-кадгерин активность люциферазы промотора приводом была значительно подавлена путем трансфекции Snail комплементарной ДНК в двух раковых клеточных линиях тестируемых (рис 5б). Следующий Мы сравнили активность промотора E-кадгерина между AS1 /Mock3 и его NDRG1 притихли клеточных линий. Как видно на рисунке 5С, было отмечено значительное (* р Обсуждение Материалы и клеточные линии изображения <р> ГСК-58 был создан из скиррозных желудочных карцином человека и 58As1 и 58As9 были независимо друг от друга путем повторных ортотопической имплантации HSC-58 клеток в желудочную стенку бестимусных мышей, как описано ранее [5], [6]. As1 /Sic50 и AS1 /Sic54 клетки были установлены стабильной трансфекции NDRG1 shRNA в клетки 58As1. Все клеточные линии поддерживали в среде RPMI-1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). BxPC-3, человека панкреатические линии раковых клеток, была получена из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA). Анти-NDRG1 антитело получали, как описано ранее [34]. Другие антитела были приобретены следующим образом: анти-β-актин антитела и анти-улитка антител из Abcam; анти β-катенина антитела, анти-β-катенин (Ser 33/37), анти-β-катенин (Ser 552), анти-Wnt, анти-Ki-67, анти-ГСК-3β антитело, анти-ЭФРР антитела, анти-GAPDH-антитело, анти-п-GSK-3β антитело, анти-ERK1 /2 антитела анти-п-ERK1 /2 антитела, анти-АКТ антитело, анти-п-АКТ антител от Cell Signaling Technology; анти-виментин антитело из Calbiochem; анти-Е-кадгерин антител был из BD. CT99021 был приобретен у Axon Medchem BV (Нидерланды). конструкт NDRG1 shRNA и создание NDRG1 Нокдаун клеточных линий люциферазы Анализ
<р> рак желудка является одним из наиболее распространенных злокачественных опухолей в Японии и других азиатских странах. Прогноз пациент скиррозных рака желудка особенно бедных. Скиррозных рак желудка часто сопровождается перитонеального распространения и метастазами в лимфатические узлы и печень, которые являются серьезными проблемами, которые необходимо контролировать. профиль экспрессии генов выявили ген усилений K-Сэмом и с-Met в 30-40% скиррозных рака желудка, а также о том, что избыточная экспрессия различных факторов роста, таких как трансформирующий фактор роста-бета (TGF-бета), тромбоцитарный роста фактор (PDGF), инсулиноподобный фактор роста (ИФР) и фактор роста фибробластов-2 (FGF-2) [1]. Недавно проведенный анализ ДНК микрочипов продемонстрировали специфическую активацию нескольких генов, включая SPARC
, RGEIII
, S100A10
и коллаген типа I [2] - [4].
[5] впервые установили линию клеток HSC-58 от скиррозных рака желудка человека, а затем были созданы две сублиниях, 58As1 и 58As9, с высоким потенциалом для перитонеального распространения и метастазов в лимфатических узлах при повторном ортотопическая инокуляция HSC-58 клеток в желудочную стенку бестимусных мышей [6], [7]. Эти сублиний часто вызывают накопление асцитической жидкости после ортотопической имплантации и показывают повышенную экспрессию генов, кодирующих протеаз и белков, участвующих в клеточной адгезии, подвижности клеток, пролиферации и ангиогенеза [6]. Они также растут выборочно в подслизистой желудка, и проникают в более глубокий слой, чтобы достичь серозную плоскости желудка [7]. Тем не менее, остается неясным, почему они приобрели такой высокий потенциал для метастазирования в процессе выбора.
<Р> В нашем настоящем исследовании мы использовали эти высоко метастатических клеточных линий, чтобы исследовать, как человеческие клетки рака желудка может приобрести метастатический потенциал. первый Мы сравнили профили экспрессии генов между высокой и низкой метастатических метастатических линии родительских клеток с помощью анализа микрочипов. Мы сосредоточились на одном гене под названием N-Myc вниз по течению регулируемый ген 1 (NDRG1), потому что было установлено, что заметно усиливает свою активность в высокой метастатической активностью желудка линии раковых клеток по сравнению с их аналогичными клетками. Кроме того, было ранее сообщалось, что экспрессия NDRG1 была предикативный маркером злокачественной прогрессии и плохим прогнозом у пациентов желудка [8]. В соответствии с этим исследования, мы наблюдали, что экспрессия высокой NDRG1 значимо коррелировали с опухолевый ангиогенез и злокачественной прогрессии вместе с плохим прогнозом при раке желудка [9]. Мы также сообщали, что NDRG1 нокдаун индуцирует снижение производства мощных факторов ангиогенеза и опухолевого ангиогенеза клеток рака легких, а также, что NDRG1 является прогностическим маркером для ангиогенеза опухоли и неблагоприятным прогнозом у больных с не-мелкоклеточного рака легких [10]. NDRG1, один из четырех генов семьи NDRG, таким образом, показывает различные функции [11] и функции NDRG1 либо как метастаз глушителем или как онкогенных и злокачественного промотор, в зависимости от типов опухолей [11], [12]. Более того, экспрессия гена NDRG1 тесно контролируется N-Myc и родственных белков семейства Myc [13] и избыточная экспрессия с-Мус индуцированной эпителиальной мезенхимальной перехода (EMT) в эпителиальных клеток молочных желез [14]. Важная роль EMT часто упоминается в тесном контексте развития и прогрессирования опухоли, включая ракового метастазирования [15], [16]. Однако в этих исследованиях, не была изучена регулирующая роль NDRG1. В нашем настоящем исследовании мы исследовали метастатического потенциала клеток рака желудка путем его корреляции с ЕМТ на основе роли NDRG1.
Результаты
<р> в соответствии с предыдущими исследованиями [6], [7], высоко метастатических раковых клеток линии 58As1 и 58As9 показали более высокие темпы роста, чем их родителей двойник, ГСК-58, с удвоением времена 23-26 ч по сравнению с 30 ч для родительских клеток (Рис. 1А) 58As1 клетки легко отсоединяется и показал рост суспензионного типа клеток с круглой морфологии, в то время как HSC-58 и 58As9 клетки были прикреплены и показал слоистую рост клеток с фибробластического морфологии (рис 1B). Оба 58As1 и 58As9 клетки показали значительно более высокие темпы роста опухоли в модели подкожного ксенотрансплантата по сравнению с родительскими клетками HSC-58 (рис 1C). Предыдущие исследования показали, что ортотопической трансплантации клеток 58As1 индуцированный гораздо выше перитонеальный распространение и асцит скопление, чем у клеток ГСК-58 [6], [7]. Кроме того, мы подтвердили перитонеальный распространение клеток путем их имплантации в брюшную полость мышей. Мыши с имплантированным клетками 58As1 показал появление в среднем 8 ± 3 видимых узелков в брыжейки каждой мыши и накопления асцита (в пределах от 0,7-2,5 мл /мышь) (рис 1D, E). В противоположность этому, у мышей имплантировали родительских клеток ГСК-58 показала образование мало, если вообще крошечных узелков, а также без видимых на накопление асцитической жидкости.
<Р> Затем мы сравнивали профили экспрессии генов между клетками 58As1 и их родительских коллегой HSC- 58, с помощью анализа ДНК микрочипов. Из 41000 РНК-транскриптов и вариантов, мы определили 3691 дифференцированно экспрессируемых генов, которые были позитивно регулируется в 2 раза, и 3536 генов, которые были подавлена до 0,5 раза или менее в клетках 58As1 по сравнению с клетками, ГСК-58. Рисунок 1F представлены гены, которые были дифференцированно выражены в 58As1 клетках по сравнению с HSC-58 клеток, ограничены теми, принадлежащих к семейству NDRG, и гены, связанные с метастазированием, в том числе матричных металлопротеиназ (ММР) /катепсинов, адгезии и эпителиально-мезенхимального-перехода ( EMT). Из четырех генов в семействе NDRG [17], выражение NDRG1 и NDRG4 был повышающей регуляции в высокой метастатической клеточной линии (58As1) по сравнению с исходной клеточной линии (HSC-58). Выражение EMT-родственных генов в клетках 58As1 был особенно пострадали от приобретения высоким метастатическим потенциалом. Экспрессия эпителии специфических генов, в том числе E-кадгерина ( CDH1
), P-кадгерин ( CDH3
) и β-катенин ( CTNNB1
), была подавлена , В противоположность этому, только ММР1 ( MMP1
) выражение заметно усиливает свою активность; выражение катепсина L ( CTSL1
) была увеличена, но катепсина B ( CTSB
) не было. Экспрессия мезенхимового специфических генов, виментин ( ВИМ
) и улитка ( SNAI1
), ключевым фактором транскрипции для подавления экспрессии E-кадгерина, была позитивной регуляции.
<р> Кроме того, мы сравнили экспрессию белка нескольких генов в ГСК-58, 58As1 и 58As9 клеток (рис 2А). Выражение NDRG1 была заметно увеличена, и что из виментину, улитка, п-ERK1 /2, п-Akt и п-GSK-3β была также увеличена, в обоих 58As1 и клетках 58As9 по сравнению с клетками, ГСК-58. Там не было явного выражения Wnt3a и Wnt5a в этих клеточных линий (данные не показаны). В отличие от этого, мы наблюдали снижение экспрессии Е-кадгерина и бета-катенина в 58As1 и 58As9 клеток по сравнению с клетками HSC-58 (рис 2А). было обнаружено, что фосфорилирование -катенина Ser33 /37 и Ser552 быть намного меньше в 58As1 и 58As9 чем HSC58. В соответствии с уровнями экспрессии белка, уровни экспрессии мРНК NDRG1, виментину, улитка и ММР-1 были выше в обеих высокой метастатической активностью клеточных линий, чем их родительский аналог (Фигура 2В). Там было гораздо меньше экспрессии мРНК Е-кадгерина и бета-катенина в обоих 58As1 и 58As9, чем HSC-58.
<Р> Иммуноцитохимическая анализ показал, что локализация E-кадгерина как в цитоплазме и мембране, а также бета-катенина было в основном локализованы в цитоплазме в обоих ГСК-58 и клеток 58As9 (рис 2С). Иммуноцитохимическая анализ 58As1 не может быть выполнена, как 58As1 растет в суспензии. Кроме того, экспрессия -катенина была относительно более выраженной в цитоплазме и ядре, но что улиток было обнаружено, что значительно выше, в ядре 58As1 и 58As9 чем HSC-58 (рис 2D). Мы также исследовали активность промотора E-кадгерина (рис 2E) и β-катенина индуцируется активность репортера по TopFlash репортер анализа (рис 2F) и обнаружили, что было отмечено значительное снижение активности люциферазы управляется E-кадгерина промотора, а также бета-катенина в обоих 58As1 и 58As9 по сравнению с ГСК-58, в соответствии с уровнями мРНК обоих генов.
<р> Далее мы исследовали, могут ли конкретно затронуты NDRG1 нокдаун экспрессию EMT-родственных генов в высоко метастатической клеточной линии, 58As1. Мы установили два стабильных NDRG1 нокдаун клеточных клонов, As1 /Sic50 и AS1 /Sic54 трансфекцией NDRG1 shRNA в клетки 58As1. Оба As1 /Sic50 и AS1 /Sic54 клетки показали аналогичные темпы роста друг с другом и их родителей коллегой AS1 /Mock3, с удвоением времена 25-27 часов в культуре (рисунок 3а). Оба NDRG1 притихли клеточные линии показали тесную адгезию клеток к культуре блюдо и фибробластической морфологии, в то время как AS1 /Mock3 клетки показали рост клеток суспензионного типа с круглым морфологии клеток (фиг.3В). Далее мы исследовали влияние NDRG1 глушителей на онкогенного активности клеток 58As1 с использованием анализа роста креплении-независимыми. Оба NDRG1 притихли клеточные линии показали значительное снижение их анкерного-независимого роста, как обозначено номером колоний в мягком агаре ( * <ЕМ> P ≪
0,01). (Фиг.3С)
<р> Тогда мы сравнили профили экспрессии генов между AS1 /Mock3 и AS1 /Sic50 клеток с использованием анализа ДНК микрочипов (рис 4а). NDRG1 нокдаун привело к увеличению экспрессии Е-кадгерина ( CDH1
) и Р-кадгерина ( CDH3
), но уменьшение экспрессии виментину ( ВИМ
) и улитка ( SNAI1
). Затем мы проводили вестерн-блот и QRT-RCR анализы для нескольких молекул, которые были модулированных NDRG1 нокдауна в микрочипов анализа (фиг.4В, С). Эти две клеточные линии показали гораздо более низкую экспрессию как мРНК NDRG1 и белка по сравнению с клетками AS1 /Mock3. Усиленную экспрессию Е-кадгерина последовательно наблюдалась в AS1 /Sic50 и клеток AS1 /Sic54 по сравнению с клетками AS1 /Mock3 с помощью Вестерн-блот-анализа. В AS1 /Sic50 и AS1 /Sic54 клеток, как вестерн-блот и QRT-PCR анализ подтвердил снижение экспрессии виментину и улитка, не затрагивая экспрессию р-ERK1 /2, ERK1 /2, п-Akt, Akt, п-GSK-3 &beta и GSK-3β (4В, с).
<р> с другой стороны, NDRG1 хорошо известно для подавления метастазирования и пролиферации клеток предстательной железы и рака толстой кишки. Недавние исследования показали, что NDRG1 модулирует Wnt-β-катенина сигнального пути с повышенной экспрессии Е-кадгерина в простате человека и клетки рака толстой кишки [18], [19]. Тем не менее, NDRG1 нокдаун в клетках 58As1 не влияет на экспрессию β-катенина как на белок и уровне мРНК (рис 4B, C). А также β-катенин управляемый активность промотора репортер анализа TopFlash выявили никакой разницы в активности промотора между AS1 /Мок и NDRG1 не замолчали клеточных линий. Таким образом, выражение β-катенин не была затронута NDRG1 нокдаун. NDRG1 нокдаун, таким образом, последовательно повышенную экспрессию Е-кадгерина и снижение экспрессии Snail и виментин в высоко метастатической клеточной линии. Тем не менее, не было никаких видимых изменений в экспрессии -катенина по NDRG1 нокдаун.
Enhanced E-кадгерина Promoter активность по NDRG1 нокдаун через Улитка в желудочном раковых клеток
&л; 0,05) повышение Е-кадгерина активности промотора по NDRG1 нокдаун
<р> GSK-3β является ключевым ферментом для активации ЕМТ. путь [20], [21], а также для фосфорилирования NDRG1 [22], [23]. Экспрессия р-GSK-3 &beta была увеличена в высокой метастатической клеточной линии, 58As1 (рис 2А). Мы исследовали, был ли GSK-3β участвует в NDRG1 индуцированной измененной экспрессии Е-кадгерина и виментину. Лечение с ингибитором (CT99021) из GSK-3 &beta привело к снижению экспрессии р-NDRG1 и п-GSK-3 β, а также повышенная экспрессия Е-кадгерина и бета-катенина в клетках 58As1 (рис 5D). Как показано на рисунке 5E, β-катенин нокдаун не влияет на экспрессию Е-кадгерина, виментину и улитка.
NDRG1 Нокдаун Индуцирует Mesenchymal Эпителиальное Переход и Подавляет метастазирование к брюшине высококвалифицированным клеток Метастатическим рака желудка
<р> Сравнивая темпы роста опухолевого AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 и клеток As1 /Sic54 в модели ксенотрансплантата выявлено более медленные темпы роста опухоли обоих AS1 /Sic50 и AS1 /Sic54 по NDRG1 нокдауна (6А, Б). NDRG1 нокдаун подавлено местное вторжение опухолевых клеток As1 /Mock3 в окружающую строму и прилегающей жировой ткани и /или мышечной ткани, и инкапсулированного роста опухоли (рис 6в). Высокая экспрессия Е-кадгерина наблюдалась в AS1 /Sic50 и AS1 /опухолей Sic54, а высокая экспрессия виментину наблюдалась в раковых клетках As1 /Mock3 опухолей (рис 6D). В противоположность этому, не было почти никаких изменений в экспрессии бета-катенина в AS1 /Sic50 и опухолей As1 /Sic54 по сравнению с опухолью As1 /Mock3.
<Р> Чтобы проверить, может ли NDRG1 нокдаун повлиять на метастазирование к брюшине и накопления асцита, мы сравнили метастатического потенциала As1 /Sic50 и AS1 /Mock3 клеток после ортотопической трансплантации. На фиг.7А показаны репрезентативные изображения увеличенной брюшной полости и наличием раковых узелков в брюшине. После того, как ортотопической инокуляции клеток As1 /Sic50, число узелков, входящих в брюшине составляла около 30% меньше, чем те, в результате чего из клеток As1 /Mock3, но это снижение не было статистически значимым ( р
= 0,21) (7В). Однако узелки в результате чего из клеток As1 /Sic50 показали гораздо меньшие размеры, чем те, из клеток As1 /Mock3 (7А). Накопление асцитической жидкости клетками AS1 /Sic50 значительно (* р ≪ 0,01) снизилась, примерно до 10% от индуцированной клетками AS1 /Mock3 (фиг.7С). Кроме того, существует значительная (* р
&л; 0,01) увеличение выживаемости мышей, привитых с клетками As1 /Sic50 (51 ± 16 дней) по сравнению с 35 ± 14 дней для мышей, привитых AS1 /Mock3 клетки, указывающие, что NDRG1 нокдаун увеличивает продолжительность жизни (рис 7D).
<р> ранее мы уже сообщали, что NDRG1 тесно коррелирует с опухолевый ангиогенез и плохой выживаемости у пациентов с раком желудка, предполагая, что NDRG1 является прогностическим биомаркером злокачественного прогрессирования рака желудка [9]. Из нашего исследования, мы наблюдали следующие свойства, лежащие в основе приобретения высокой метастатического потенциала рака желудка: микрочипа, вестерн-блоттинга и ОТ-ПЦР анализы вместе показали положительную регуляцию NDRG1 в высокоразвитых метастатических клеточных линиях, 58As1 и 58As9, по сравнению с их низким метастатическим родителей аналог, ГСК-58; выше выражение виментину, улитка, и ММР-1, а более низкая экспрессия Е-кадгерина и -катенина были очевидны в высокоразвитых метастатических клеточных линиях по сравнению с их родительским аналога; генов подавляются в высоко метастатической клеточной линии, NDRG1 нокдаун привело к повышающей регуляции E-кадгерина и понижающей виментина и улитка, но почти не влияет на экспрессию бета-катенина; Активность промотора E-кадгерин был значительно дополнен NDRG1 нокдаун; NDRG1 нокдаун также подавляются перитонеальный распространение и накопление асцит, и вторжение в высоко метастатических клеток в окружающие нормальные ткани.
<Р> В настоящем исследовании, NDRG1 нокдаун привело к подавлению метастазирования высокотоксичными метастатических клеток рака желудка (рис 6 , 7), предполагая, что NDRG1 может быть ген метастазирование промотора, а не ген-супрессор метастаза при раке желудка. Наше настоящее исследование решительно поддерживает идею о том, что ли способствует NDRG1 или подавляет злокачественное прогрессирование рака у человека зависит от типов опухолей и /или состояния дифференцировки [11], [12]. Тем не менее, остается неясным, почему NDRG1 функционирует как подавитель опухоли или промотора в зависимости от типов опухолей или гистологических типов. Наше предыдущее исследование показало, что NDRG1 подавляет рост опухоли и ангиогенез рака поджелудочной железы через NDRG1 ведомой ослабление NF-кВ пути [24] сигнализации, [25]. Недавнее исследование сообщило, что экспрессия гена супрессора метастаза, KAI1
ген, участвует в NDRG1 опосредованного подавления метастазирования рака предстательной железы с помощью ATF3-NF-kB пути [26]. Требуется дальнейшее изучение, чтобы понять, какой регулирующий механизм конкретно отвечает за NDRG1 ведомой продвижение злокачественной прогрессии через желудочный раковых клеток.
<Р> EMT Недавнее событием, которые могут быть тесно связаны с раком злокачественной прогрессии включая овладению высоко метастатического потенциала [15], [16]. В нашем настоящем исследовании, NDRG1 нокдаун усиливал экспрессию Е-кадгерина и подавляли экспрессию виментину и в пробирке
и В естественных условиях
. NDRG1 может играть ключевую роль в переходе от поляризованной эпителиального фенотипа к весьма мотильных мезенхимальных фенотипа. Частичная или полная потеря Е-кадгерина часто наблюдается во время прогрессии по отношению к злокачественности в многочисленных опухолей, включая рак желудка [27], [28]. Оливейра и др. [29] сообщили о тесной связи между потерей E-кадгерина и высоким метастатическим потенциалом при раке желудка. Чан и др. [30] также сообщили, растворимый Е-кадгерина в качестве биомаркера для длительного выживания больных раком желудка. NDRG1 нокдаун привело к относительно более высокой экспрессии E-кадгерина в AS1 /Sic50 опухолей, чем в опухолях As1 /Mock3, предполагая, что NDRG1 может конкретно управлять EMT возможно через фактор транскрипции Улитка на клеток рака желудка (рис 7E).
<Р> Wnt сигнализации имеет центральную роль в злокачественной прогрессии и метастазирования путем легкого и клеток рака молочной железы [31], [32], и передача сигналов Wnt также индуцирует EMT, который включает метастатического прогрессирования эпителиального рака [31], [33]. NDRG1 известен как ген-супрессор метастаза в простаты и колоректального рака клетки [11], [12]. Лю и др [18] сообщил, что NDRG1 подавляет метастазирование через Wnt /β-катенина сигнального пути в клетках рака простаты. Соответствующее исследование Чен и др [19] также показали, что NDRG1 модулирует TGF-бета-индуцированный EMT через измененную экспрессию -катенина и Е-кадгерина в колоректального раковых клеток. Наше нынешнее исследование показало снижение экспрессии бета-катенина в обоих высоко метастатических клеточных линиях по сравнению с родительским коллегой, ГСК-58. Тем не менее, как вестерн-блот и QRT-ПЦР не анализ показал, не заметные изменения уровней экспрессии бета-катенина, а также β-катенин ведомой промоторной активности между высоко метастатических клеток 58As1 и двух NDRG1 молчащих клеточных линий. Кажется, менее вероятно, что β-катенин играет решающую роль в подавлении метастаз путем NDRG1 нокдаун в высокой метастатической активностью раковых клеток.
<Р> С другой стороны, GSK-3β также известно, играет роль в контроле EMT [20], [21], и GSK-3β является одним из важнейших ферментов для фосфорилирования NDRG1, отличный подсосто GSK-3 &beta [22], [23]. Выражение п-GSK3β была относительно выше, в высокой метастатической активностью клеточных линий, чем их исходной клеточной линии (Фигура 2В). Лечение с сильным ингибитором GSK-3 &beta приводит к подавленной экспрессии р-NDRG1, в сопровождении повышающей регуляцией Е-кадгерина и бета-катенина (рис 5D). Тем не менее, не было почти никакой разницы в экспрессии GSK-3 &beta и п-GSK-3 &beta по NDRG1 нокдаун в высокой метастатической активностью клеток (рис 4б), предполагая, что GSK-3β не может играть главную роль в индукции EMT через NDRG1 в желудочном раковых клеток.
<р> Улитка является представителем фактор транскрипции, который контролирует экспрессию Е-кадгерина [20]. Различных регуляторных факторов, которые контролируют транскрипционно Е-кадгерина, экспрессия Snail специфически модулированных NDRG1 в желудочном линий раковых клеток, используемых в данном исследовании. Улитка нокдаун индуцированной повышающей регуляцией Е-кадгерина (рис 5А) и экзогенной tarnsfection улиток кДНК подавлено E-кадгерина активность промотора (рис 5б).
<Р> В сильно метастатических желудочных линий раковых клеток, экспрессия Snail была в повышающей регуляции по сравнению с их низкой метастатического, ГСК-58 (рис 2А, в). Оба NDRG1 бесшумное клеточные линии, As1 /Sic50 и AS1 /Sic54, показавшие снижение экспрессии Snail по сравнению с их высокой метастатической коллегой AS1 /Mock3 (рис 4B, C). Кроме того, активность промотора Е-кадгерин был значительно стимулировал в обоих NDRG1 притихли клеточные линии, по сравнению с их высоко метастатического (5С).
<Р> В заключение NDRG1 нокдаун индуцирует повышающую регуляцию Е-кадгерина и понижающей регуляции виментину и улитка, и подавлено вторжения, метастазирование и накопление асцит высококвалифицированным метастатических клеток рака желудка. Это NDRG1 обеспечиваемая регуляция Е-кадгерина и /или экспрессии виментин затрагиваемой эпителиальной мезенхимальной перехода из клеток рака желудка. Это NDRG1 индуцированная модификация EMT, как представляется, по крайней мере, частично связаны с транскрипционной фактора Snail. NDRG1, работая в тесном контексте с ЕМТ-родственных генов, могли бы участвовать в приобретении высокой метастатического потенциала прогрессивными клеток рака желудка.
Материалы и методы
экспрессии генов Microarrays
<р> комплементарной РНК амплифицировали, маркировались и гибридизуют с 44K Agilent 60-меров oligomicroarray в соответствии с инструкциями изготовителя (Agilent технологии). Все гибридизировали микрочипов слайды были отсканированы с помощью сканера компании Agilent. Относительные интенсивности гибридизации и фоновые значения гибридизации были рассчитаны с использованием Agilent Feature Extraction программного обеспечения. Для того, чтобы определить вверх или вниз-регулируемых генов, мы вычислили коэффициенты (без входа масштабируется Наклоняемый изменения) из нормированных интенсивностей сигнала каждого зонда для сравнения между контрольными и экспериментальными образцами. Затем мы установили критерии для регулируемых генов: вверх-регулируемых генов, соотношение ≥2 раза; понижающей регуляции генов, соотношение ≤0.5.
<р> Чтобы получить человеческий вектор U6 миРНК на основе pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA), промотор U6 человек (содержащий Hind III и
<ЕМ> Bam HI
сайты клонирования) амплифицировали из геномной ДНК человека с парой праймеров 5'-AGATCTGAATTCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGC и 5'-AGATCTAAGCTTCTCGAGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAG, и лигируют в Bgl II
сайт pcDNA3. Частичные ДНК-фрагменты ДНК NDRG1 человека были химически синтезированы и клонировали в pcDNA3-hU6siRNA расщепляют с помощью Hind III
и Bam HI
производить pcDNA3shNDRG1. Синтезированные ДНК для pcDNA3shNDRG1 были: 5'-GATCCGCGTGAACCCTTGTGCGGAATTCAAGAGATTCCGCACAAGGGTTCACGTTTTTTGGAAA и 5'-AGCTTTTCCAAAAAACGTGAACCCTTGTGCGGAATCTCTTGAATTCCGCACAAGGGTTCACGCG. Улитки кДНК получали, как описано ранее [35]. Улитки кДНК лигируют в pcDNA3 (pcDNA3-улитка). Клетки трансфицировали pcDNA3shNDRG1 или pcDNA3-улитка с использованием Липофектамина 2000 (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Стабильные трансфицированные клоны были созданы с помощью выбора G418.
Трансфекция малых интерферирующих РНК
<р> миРНК, соответствующие нуклеотидные последовательности Улитка и бета-катенина были приобретены у Invitrogen (Карлсбад, Калифорния), соответственно, миРНК дуплексы были tranfected использованием Липофектамин RNAiMAX и Opti-MEM среду (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя.
<р> чтобы получить E-кадгерина-Luc вектор, E-cadhein промотор (-262 +120) амплифицировали с помощью ПЦР с использованием следующих пар праймеров: 5'- AGATCTTAGTGAGCCACCGGCGGGGC-3 'и 5'- AAGCTTGGCCGGGGACGCCGAGCGAGGG-3'. Подчеркивает указывают на сайты рестрикции фермента расщепления. Амплифицированный фрагмент лигируют в вектор легкой pGEM-T (Promega) и передается на pGL3 основного вектора (Promega) в сайтах BglII и Hind III. Е-кадгерин-Luc и pcDNA3-улитка трансфицировали с использованием Липофектамин LTX и Opti-MEM среду (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. Через 24 часа активность люциферазы измеряли в соответствии с инструкциями изготовителя (Promega). Кроме того, мы также исследовали активность люциферазы, приводимый -катенина с использованием репортер вектор TopFlash, как описано ранее [18].
Мягкая Агар колониеобразующих Анализ
<р> 4 × 10 3 клетки высевали в 1 мл культуральной среды, содержащей 0,36% (вес /объем) верхнего агара наслаивали на базальном слое 0,72% (вес /объем) агаре в 6-луночные планшеты и культивировали в течение 3-4 недель. Колонии были сфотографированы и подсчитывали в десять случайных полей зрения при 50-кратном увеличении с помощью световой микроскопии. Каждый эксперимент был проведен в трех экземплярах.
Вестерн-блоттинга и фракционирование ядра и цитоплазмы
<р> Клетки лизируют в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, 350 мМ NaCl, 0,1% NP40, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaF, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 10 мкг /мл апротинина, 10 мкг /мл лейпептина и 1 мМ Na3VO4. Всего клеточные лизаты подвергали SDS-PAGE и переносили на мембраны Immobilon (Millipore Corp., Bedford, MA), как описано ранее [24], [25]. Для подготовки цитозоль и ядерной фракции, клетки лизируют в bufferA (10 мМ Hepes, рН 7,9, 10 мМ KCl, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0,4% Igepal и ингибиторы протеазы) и инкубируют в течение 20 мин на льду. После центрифугирования (3 мин, 5000 оборотов в минуту), супернатант использовали в качестве цитоплазматической фракции. Полученные гранулы вновь суспендируют в bufferB (20 мМ HEPES, рН 7,9, 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5% глицерин, 1 мМ ДТТ и ингибиторы протеазы) и инкубировали в течение 2 ч при непрерывном перемешивании при температуре 4 ° С. После центрифугирования (5 мин, 15000 оборотов в минуту), супернатант использовали в качестве ядерной фракции.
Болезнь Паркинсона можно предотвратить с помощью кишечных микробов
Модуляция микробиоты и восстановление эубиоза могут помочь обуздать осложнения COVID-19
Ученые извлекли полный геном человека из «жевательной резинки» возрастом тысячи лет.
Панкреатит
Веганская диета может увеличить количество кишечных микробов, которые способствуют снижению веса
Пересадка кала от одних доноров лучше, чем от других
Раковые химические вещества из кишечного микроба
Многие обычные кишечные бактерии несут мутации, вызывающие рак, говорится в новом исследовании, опубликованном в журнале Природа 27 февраля 2020 г. Фон В теле человека и на нем живут триллионы б
Могут ли противовирусные соединения, полученные из микроводорослей, бороться с SARS-CoV-2 и другими вирусами?
С появлением продолжающейся пандемии коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), вызванный тяжелым острым респираторным синдромом коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), Начались лихорадочные поиски эффективны
Веганская диета может увеличить количество кишечных микробов, которые способствуют снижению веса
Переход на веганскую диету может помочь людям сбросить почти один фунт веса каждую неделю и значительно снизить риск диабета. согласно исследованию, недавно представленному на Ежегодном собрании Европ