PLOS ONE: N-myc aval Gene réglementée 1 (NDRG1) favorise la métastase des cellules Squirrheux Human Cancer gastrique par épithéliales mésenchymateuses Transition

Résumé

Notre étude récente a démontré que l'expression plus élevée de N-myc 1 (downregulated NDRG1) est étroitement corrélée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de cancer gastrique. Dans cette étude, nous avons demandé si NDRG1 a un rôle essentiel dans la progression maligne y compris la métastase des cellules de cancer gastrique. Par l'expression génique microarray analyse l'expression de NDRG1 a montré la plus forte augmentation parmi un total de 3691 gènes régulée à la hausse dans une ligne très métastatique gastrique des cellules cancéreuses (58As1) que leur faible contrepartie métastatique parentale (HSC-58). Les lignées cellulaires hautement métastatiques ont montré une diminution de l'expression de la E-cadhérine, conjointement avec l'expression accrue de la vimentine et d'escargot. Cette diminution de l'expression de la E-cadhérine a été restaurée par l'escargot effet de choc dans les lignées cellulaires hautement métastatiques. Nous avons ensuite établi des lignées stables de NDRG1 knockdown de cellules (AS1 /Sic50 et As1 /Sic54) à partir de la lignée cellulaire hautement métastatique, et ces deux lignées cellulaires ont montré une expression accrue de la E-cadhérine et une diminution de l'expression de la vimentine et Snail. Et aussi, l'activité de la luciférase promoteur axée sur la E-cadhérine a été trouvé pour être augmenté de NDRG1 effet de choc dans la lignée cellulaire hautement métastatique. NDRG1 effet de choc dans la cellule cancéreuse gastrique a montré supprime l'invasion des cellules cancéreuses dans les tissus surround, supprimé métastases au péritoine et une diminution de l'accumulation d'ascites chez les souris avec une amélioration significative des taux de survie. Cette étude est la première à démontrer que NDRG1 joue son rôle central dans la progression maligne de cancer gastrique par transition mésenchymateuses épithéliale

Citation:. Ureshino H, Y Murakami, Watari K, Izumi H, Kawahara A, Kage M et al. (2012) N-myc aval Gene réglementée 1 (NDRG1) favorise la métastase des cellules Squirrheux Human Cancer gastrique par épithéliales mésenchymateuses Transition. PLoS ONE 7 (7): e41312. doi: 10.1371 /journal.pone.0041312

Editeur: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Etats-Unis d'Amérique

reçues: 8 Décembre 2011; Accepté le 22 Juin 2012; Publié le 23 Juillet, 2012 |

Droit d'auteur: © 2012 Ureshino et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette étude a été soutenue par une subvention en aide à la recherche sur le cancer du ministère de l'Education, Culture, sports, science et technologie du Japon (au Dr Ono), et par la recherche pour la lutte 3ème complète terme pour le cancer du ministère de la Santé, du travail et du bien-être du Japon (Dr. Kuwano). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est l'une des tumeurs malignes les plus courantes au Japon et dans d'autres pays asiatiques. Le pronostic des patients de carcinome gastrique squirrheux est particulièrement pauvre. cancer de l'estomac squirrheux est souvent accompagnée par la diffusion péritonéale et des métastases dans les ganglions lymphatiques et le foie, qui sont des problèmes graves qui doivent être contrôlées. L'expression du gène profil a révélé des amplifications de gènes de K-sam et c-Met dans 30-40% des cancers de l'estomac squirrheux, et que la surexpression de divers facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance transformant β (TGF-β), la croissance dérivé des plaquettes factor (PDGF), le facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF) et facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF-2) [1]. Une analyse récente des puces à ADN a démontré surexpression spécifique de plusieurs gènes dont SPARC
, RGEIII
, S100A10
et de collagène de type I [2] - [4].

les modèles animaux qui reflètent les caractéristiques de la péritonite cancéreuse et les métastases au péritoine sont importantes pour comprendre le développement de la progression maligne du cancer gastrique. Yanagihara et al.
[5] d'abord établi la ligne du cancer gastrique squirrheux humaine cellule HSC-58, puis a créé deux lignées, 58As1 et 58As9, avec un fort potentiel de dissémination péritonéale et des métastases ganglionnaires répétée inoculation orthotopique de HSC-58 cellules dans la paroi gastrique de souris athymiques [6], [7]. Ces lignées provoquent souvent une accumulation d'ascite après l'implantation orthotopique, et présentent une expression accrue de gènes codant pour des protéases et des protéines impliquées dans l'adhésion cellulaire, la motilité cellulaire, la prolifération et angiogénèse [6]. Ils se développent également de manière sélective dans la sous-muqueuse gastrique, et envahissent la couche plus profonde pour atteindre le plan séreuse de l'estomac [7]. Cependant, on ne sait pas pourquoi ils ont acquis un tel potentiel élevé de métastases lors de la sélection.

Dans notre étude, nous avons utilisé ces lignées cellulaires hautement métastatiques pour étudier comment les cellules humaines de cancer gastrique pouvaient acquérir le potentiel métastatique. Nous avons d'abord comparé les profils d'expression génique entre métastatiques lignées cellulaires parentales hautement métastatiques et basse par analyse de puces à ADN. Nous nous sommes concentrés sur un gène nommé N-myc en aval régulé gène 1 (NDRG1) parce qu'elle a été jugée nettement régulée à la hausse dans les lignées cellulaires de cancer gastrique hautement métastatique des cellules par rapport à leurs homologues. Il a également été rapporté précédemment que l'expression de NDRG1 était un marqueur prédicative pour la progression maligne et de mauvais pronostic chez les patients gastriques [8]. Conformément à cette étude, nous avons observé que l'expression élevée de NDRG1 était significativement corrélée avec l'angiogenèse tumorale et la progression maligne avec un mauvais pronostic dans le cancer gastrique [9]. Nous avons également rapporté que NDRG1 knockdown induit une diminution de la production de facteurs angiogéniques et l'angiogénèse tumorale par les cellules du cancer du poumon, ainsi que NDRG1 est un marqueur prédictif de l'angiogenèse tumorale et un mauvais pronostic chez les patients atteints sans un cancer du poumon à petites cellules [10]. NDRG1, l'un des quatre gènes de la famille NDRG, montre donc diverses fonctions [11], et les fonctions de NDRG1 soit en tant que suppresseur de métastases ou en tant que promoteur oncogene et malignes, en fonction des types [11], [12] tumorales. En outre, l'expression du gène de NDRG1 est étroitement contrôlée par le N-myc et les protéines apparentées de la famille Myc [13] et la surexpression de c-Myc transition induite par épithéliale mésenchymateuses (EMT) dans les cellules épithéliales mammaires [14]. Le rôle important des EMT est souvent appelé dans son contexte proche du développement et de la progression tumorale, y compris le cancer métastatique [15], [16]. Cependant, dans ces études, le rôle régulateur de NDRG1 n'a pas été étudié. Dans notre étude, nous avons étudié le potentiel métastatique des cellules de cancer gastrique par sa corrélation avec le rôle de NDRG1 base-EMT.

Résultats Comparaison de la croissance cellulaire, Cell Morphologie, la croissance tumorale, de la diffusion et profils d'expression génétique entre hautement métastatique cancer gastrique lignées cellulaires et leur faible Homologue métastatiques

Conformément aux études précédentes [6], [7], les lignées de cellules cancéreuses hautement métastatiques 58As1 et 58As9 ont montré des taux de croissance plus élevés que leurs parents contrepartie, HSC-58, avec des temps de 23-26 heures contre 30 heures pour les cellules parentales (figure 1A) doubler. 58As1 cellules ont été facilement détachés et ont montré la croissance des cellules de type suspension avec la morphologie ronde, tandis que les cellules HSC-58 et 58As9 étaient attachés et ont montré la croissance des cellules en couches avec une morphologie fibroblastique (figure 1B). Les deux cellules 58As1 et 58As9 ont montré beaucoup plus élevés des taux de croissance de la tumeur dans un modèle de xénogreffe sous-cutanée par rapport aux parents HSC-58 cellules (figure 1C). Des études antérieures ont démontré que la transplantation orthotopique de cellules induite par la diffusion 58As1 péritonéale et l'accumulation d'ascite beaucoup plus élevée que celle des cellules HSC-58 [6], [7]. On a confirmé en outre la dissémination peritoneale des cellules en les implantant dans la cavité péritonéale de souris. Les souris implantées avec des cellules 58As1 a montré l'apparition d'une moyenne de 8 ± 3 nodules visibles dans le mésentère de chaque souris et l'accumulation d'ascite (allant de 0,7-2,5 ml /souris) (figure 1D, E). En revanche, les souris implantées avec des parents cellules HSC-58 ont montré la formation de quelques-uns si des nodules minuscules, et aucune accumulation apparente de l'ascite.

Nous avons ensuite les profils d'expression des gènes par rapport entre les cellules 58As1 et leur homologue parental, HSC- 58, en utilisant l'analyse des puces à ADN. Sur les 41.000 transcrits d'ARN et des variants, nous avons identifié 3691 gènes exprimés de manière différentielle qui sont régulés positivement à 2 fois, et de 3536 gènes qui étaient régulés à la baisse à 0,5 fois ou moins dans les cellules par rapport à 58As1 HSC-58 cellules. La figure 1E présente gènes qui étaient exprimés de manière différentielle dans les cellules 58As1 par rapport à l'HSC-58 cellules limitées à celles appartenant à la famille NDRG et les gènes liés à des métastases, y compris les métalloprotéinases de matrice (MMP) /cathepsines, l'adhésion et l'épithélium-mésenchyme transition ( EMT). Parmi les quatre gènes de la famille NDRG [17], l'expression de NDRG1 et NDRG4 a été régulée à la hausse dans la lignée cellulaire fortement métastatique (58As1) par rapport à la lignée cellulaire parentale (HSC-58). L'expression des gènes EMT liés dans les cellules 58As1 a été particulièrement affectée par l'acquisition d'un potentiel métastatique élevé. L'expression de gènes spécifiques de l'épithélium, y compris E-cadhérine ( CDH1
), P-cadhérine ( CDH3
) et β-caténine ( CTNNB1
), a été downregulated . En revanche, seulement MMP1 ( MMP1
) expression a été nettement régulée positivement; l'expression de la cathepsine L ( CTSL1
) a été augmentée, mais que la cathepsine B (
CTSB) n'a pas été. L'expression de gènes spécifiques mésenchymateuses, vimentine ( VIM
) et Snail ( SNAI1
), un facteur de transcription clé pour la suppression de l'expression E-cadhérine, a été régulée à la hausse.

Enhanced NDRG1 Gene expression dans des lignées cellulaires hautement métastatiques du cancer gastrique

Nous avons comparé en outre l'expression de la protéine de plusieurs gènes dans HSC-58, cellules 58As1 et 58As9 (figure 2A). L'expression de la NDRG1 a été nettement augmentée, et celle de la vimentine, escargots, p-ERK1 /2, le p-Akt et le p-GSK-3β a également augmenté dans les deux cellules et 58As1 58As9 par rapport aux cellules HSC-58. Il n'y avait pas d'expression apparente de Wnt3a et Wnt5a dans ces lignées cellulaires (données non présentées). En revanche, nous avons observé une baisse d'expression de la E-cadhérine et β-caténine dans les cellules 58As1 et 58As9 par rapport HSC-58 cellules (figure 2A). La phosphorylation de la β-caténine Ser33 /37 et Ser552 a été jugée beaucoup moins 58As1 et 58As9 que HSC58. En accord avec les niveaux d'expression de protéines, les niveaux de NDRG1, vimentine, escargots et MMP-1 expression de l'ARNm était plus élevée dans les deux lignées cellulaires hautement métastatiques que leurs homologues parentaux (figure 2B). Il y avait beaucoup moins l'expression d'ARNm de la E-cadhérine et β-caténine dans les deux 58As1 et 58As9 que HSC-58.

analyse immunocytochimique a révélé que la localisation de la E-cadhérine à la fois dans le cytoplasme et la membrane, et β-caténine était principalement localisées dans le cytoplasme à la fois HSC-58 et les cellules 58As9 (figure 2C). analyse immunocytochimique pour 58As1 ne peut être réalisée que 58As1 pousse en suspension. En outre, l'expression de β-caténine est relativement faible dans les deux cytoplasme et le noyau, mais celle de l'escargot a été jugée beaucoup plus élevée dans le noyau de 58As1 et 58As9 que HSC-58 (figure 2D). Nous avons également étudié la E-cadhérine activité de promoteur (figure 2E), et β-caténine activité du rapporteur induite par TopFlash reporteur essai (figure 2F) et on a trouvé qu'il y avait diminution significative de l'activité de luciférase entraînée par le promoteur E-cadhérine et par β-caténine dans les deux 58As1 et 58As9 par rapport HSC-58, compatible avec les niveaux d'ARNm des deux gènes.

NDRG1 Knockdown induit la régulation positive de la E-cadhérine et la régulation négative de vimentine et Snail dans des cellules très métastatiques

Nous avons ensuite examiné si NDRG1 knockdown affecté spécifiquement l'expression de gènes EMT liés dans la lignée cellulaire hautement métastatique, 58As1. Nous avons établi deux NDRG1 knockdown clones cellulaires stables, As1 /Sic50 et As1 /Sic54 par transfection NDRG1 shRNA dans des cellules 58As1. cellules deux As1 /Sic50 et As1 /Sic54 ont montré des taux de croissance semblables les uns aux autres et leur homologue parental As1 /Mock3, avec des temps de 25-27 h doubler dans la culture (figure 3A). Les deux lignées cellulaires de NDRG1 taire ont une adhérence serrée des cellules à la boîte de culture et de la morphologie fibroblastique, tandis que les cellules As1 /Mock3 ont montré une croissance cellulaire de type suspension avec tour la morphologie des cellules (figure 3B). Nous avons ensuite examiné l'effet de NDRG1 silence sur l'activité tumorigène des cellules 58As1 utilisant un dosage de croissance indépendante de l'ancrage. Les deux lignées cellulaires de NDRG1 taire ont montré une réduction significative de leur croissance indépendante de l'ancrage, comme indiqué par le nombre de colonies dans la gélose molle ( ^{* p <
0,01). (Figure 3C)}

Ensuite, nous avons comparé les profils d'expression génique entre As1 /Mock3 et As1 /Sic50 cellules en utilisant l'analyse des puces à ADN (figure 4A). NDRG1 knockdown a donné lieu à une expression accrue de la E-cadhérine ( CDH1
) et P-cadhérine ( CDH3
), mais diminution de l'expression de la vimentine ( VIM
) et Snail ( SNAI1
). On a ensuite effectué Western Blot et qRT-RCR analyses pour plusieurs molécules qui ont été modulées par NDRG1 effet de choc dans l'analyse de puces à ADN (figure 4B, C). Ces deux lignées cellulaires montraient une expression beaucoup plus faible des deux NDRG1 ARNm et la protéine par rapport aux cellules As1 /Mock3. Une expression accrue de la E-cadhérine a été constamment observée dans As1 /Sic50 et les cellules As1 /Sic54 par rapport aux cellules As1 /Mock3 par analyse par transfert de Western. Dans les cellules As1 /Sic50 et As1 /Sic54, à la fois western blot et qRT-PCR analyses confirmé diminution de l'expression de la vimentine et Snail sans affecter l'expression de p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-Akt, Akt, p-GSK-3β et GSK-3β (figure 4B, C).

d'autre part, NDRG1 est bien connue pour supprimer les métastases et de la prolifération cellulaire par les cellules de la prostate et le cancer du côlon. Des études récentes ont démontré que NDRG1 module voie de signalisation Wnt-β-caténine avec une expression accrue de la E-cadhérine dans la prostate humaine et de cellules de cancer du côlon [18], [19]. Cependant, dans les cellules knock-down NDRG1 58As1 n'a pas affecté l'expression de β-caténine, tant au niveau de l'ARNm et la protéine (figure 4B, C). Et également β-caténine entraînée par l'activité du promoteur TopFlash essai rapporteur n'a révélé aucune différence dans l'activité de promoteur entre As1 /simulés et NDRG1 réduit au silence des lignées cellulaires. Par conséquent, l'expression de β-caténine n'a pas été affectée par l'effet de choc NDRG1. NDRG1 knockdown donc constamment augmenté l'expression de la E-cadhérine et une diminution de l'expression de Snail et vimentine dans la lignée cellulaire hautement métastatique. Cependant, il n'y avait pas de changement apparent dans l'expression de la β-caténine par NDRG1 knockdown.

Enhanced E-cadhérine Promoteur Activité par NDRG1 Knockdown par Snail dans les cellules cancéreuses gastriques

De divers facteurs de transcription qui suppriment expression de la E-cadhérine y compris Snail, Slug, Twist, TCF4 et SIP1 [20], l'expression de Snail a été spécifiquement modulé par NDRG1 dans les cellules de cancer gastrique. Nous avons examiné si l'expression de la E-cadhérine et /ou vimentine pourrait être réglé par Snail dans HSC-58 cellules. Traitement transitoire avec l'escargot ARNsi entraîné une augmentation de l'expression de la E-cadhérine, mais pas celle de la vimentine et NDRG1, en fonction du temps de manière (figure 5A). Il y avait seulement une légère si une augmentation de l'expression β-caténine par Snail knockdown. En outre, l'activité luciférase-promoteur entraîné E-cadhérine a été significativement inhibée par la transfection de l'ADN complémentaire d'escargot dans deux lignées cellulaires cancéreuses testées (figure 5B). Nous avons ensuite comparé l'activité promotrice de la E-cadhérine entre As1 /Mock3 et ses lignées cellulaires de NDRG1 réduits au silence. Comme on le voit sur la figure 5C, il était significatif (* p
< 0,05) amélioration de la E-cadhérine activité de promoteur par NDRG1 knockdown

GSK-3β est une enzyme clé pour l'activation de l'EMT. voie [20], [21], ainsi que pour la phosphorylation de NDRG1 [22], [23]. L'expression de la p-GSK-3β a été augmentée dans la lignée cellulaire hautement métastatique, 58As1 (voir la figure 2A). Nous avons examiné si GSK-3β a été impliqué dans NDRG1 induit une expression altérée de la E-cadhérine et vimentine. Traitement avec un inhibiteur (CT99021) de la GSK-3β a donné lieu à une expression réduite de p-NDRG1 et p-GSK-3β et a également augmenté l'expression de la E-cadhérine et la β-caténine dans les cellules 58As1 (figure 5D). Comme le montre la figure 5E, β-caténine knockdown n'a pas d'incidence sur l'expression de la E-cadhérine, vimentine et Snail.

NDRG1 Knockdown Induit mésenchymateuses épithéliale Transition et Supprime Métastases du péritoine par hautement cellules métastatiques du cancer gastrique

Comparaison des taux de As1 /Mock3, As1 /Sic50 et les cellules As1 /Sic54 la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffe a révélé plus lent des taux des deux As1 /Sic50 et As1 /Sic54 croissance tumorale par NDRG1 effet de choc (figure 6A, B). NDRG1 effet de choc a supprimé l'invasion locale de cellules tumorales As1 /Mock3 dans le stroma environnant et le tissu adipeux adjacent et /ou le tissu musculaire, et la croissance tumorale encapsulé (figure 6C). Une expression élevée de la E-cadhérine a été observée dans As1 /Sic50 et /AS1 tumeurs Sic54, tandis que la forte expression de la vimentine a été observée dans les cellules cancéreuses de tumeurs As1 /Mock3 (figure 6D). En revanche, il n'y avait presque pas de changement dans l'expression de la β-caténine dans As1 /Sic50 et les tumeurs As1 /Sic54 par rapport à As1 /Mock3 tumeur.

Pour examiner si NDRG1 knockdown pourrait affecter les métastases au péritoine et de l'accumulation de l'ascite, nous avons comparé le potentiel métastatique des cellules As1 /Sic50 et As1 /Mock3 après la transplantation orthotopique. La figure 7A montre des images représentatives de la cavité abdominale, à plus grande échelle et la présence de nodules de cancer du péritoine. Après inoculation orthotopique de cellules As1 /Sic50, le nombre des nodules apparaissant dans le péritoine était d'environ 30% de moins que celles qui résultent de cellules As1 /Mock3, mais cette diminution n'a pas été statistiquement significative ( p
= 0,21) (figure 7b). Cependant les nodules des cellules résultant de As1 /Sic50 montré tailles beaucoup plus petites que celles des cellules As1 /Mock3 (figure 7A). L'accumulation d'ascites par des cellules As1 /Sic50 était significativement (* p < 0,01) a diminué pour atteindre environ 10% de celle induite par les cellules As1 /Mock3 (figure 7C). En outre, il y avait une augmentation significative (* p
< 0,01) augmentation du taux de souris inoculées avec des cellules As1 /Sic50 (51 ± 16 jours) par rapport à 35 ± 14 jours pour les souris inoculées avec As1 /de survie cellules Mock3, indiquant que NDRG1 knockdown prolonge la survie (Figure 7D).

Discussion

Nous avons précédemment rapporté que NDRG1 est étroitement corrélée à l'angiogenèse tumorale et une faible survie chez les patients atteints de cancer gastrique, ce qui suggère que NDRG1 est un biomarqueur prédictif de la progression maligne du cancer gastrique [9]. De notre étude, nous avons observé les propriétés suivantes sous-jacentes à l'acquisition d'un potentiel métastatique élevé dans le cancer gastrique: microarray, western blot et RT-PCR analyses ainsi révélé surexpression de NDRG1 dans les lignées cellulaires hautement métastatiques, 58As1 et 58As9, par rapport à leur faible homologue parental métastatique, HSC-58; une plus forte expression de la vimentine, escargots, et MMP-1 et une plus faible expression de la E-cadhérine et de β-caténine étaient évidents dans les lignées cellulaires hautement métastatiques par rapport à leurs homologues parentaux; des gènes régulés à la baisse dans la lignée cellulaire hautement métastatique, NDRG1 effet de choc a donné lieu à une régulation positive de la E-cadhérine, et la régulation négative de la vimentine et d'escargot, mais presque aucun effet sur l'expression de la β-caténine; l'activité du promoteur E-cadhérine a été significativement augmentée par NDRG1 knockdown; NDRG1 knockdown a également supprimé la diffusion péritonéale et de l'accumulation de l'ascite, et l'invasion des cellules très métastatiques dans les tissus normaux environnants.

Dans la présente étude, NDRG1 knockdown a abouti à la suppression de la métastase par les cellules cancéreuses gastriques hautement métastatiques (Figure 6 , 7), ce qui suggère que NDRG1 peut être un gène promoteur de métastases plutôt qu'un gène suppresseur de métastases dans le cancer gastrique. Notre étude présente soutient fermement l'idée que si NDRG1 favorise ou supprime la progression maligne du cancer humain dépend des types de tumeurs et /ou de l'état de différenciation [11], [12]. Cependant, on ne sait pas pourquoi les fonctions de NDRG1 comme suppresseur de tumeur ou d'un promoteur en fonction de types de tumeurs ou types histologiques. Notre étude précédente a démontré que NDRG1 supprime la croissance tumorale et l'angiogénèse du cancer du pancréas par l'intermédiaire NDRG1 entraîné une atténuation de la voie NF-kB [24] signalisation, [25]. Une étude récente a rapporté que l'expression du gène suppresseur métastase, gène KAI1 de, est impliqué dans la médiation NDRG1 suppression des métastases du cancer de la prostate par ATF3-NF-kB voie [26]. Une étude plus poussée est nécessaire pour comprendre quel mécanisme réglementaire est spécifiquement responsable de la promotion NDRG1 entraînée de la progression maligne par les cellules de cancer gastrique.

EMT est un point culminant récente qui pourrait être étroitement associée au cancer, y compris la progression maligne acquirement du potentiel hautement métastatique [15], [16]. Dans notre étude, NDRG1 knockdown amélioré l'expression de la E-cadhérine et supprimé l'expression de la vimentine fois in vitro
et in vivo
. NDRG1 peut jouer un rôle clé dans le passage d'un phénotype épithélial polarisé à un mésenchymateuses phénotype très mobiles. la perte partielle ou complète de la E-cadhérine est souvent observée au cours de la progression vers la malignité dans de nombreuses tumeurs, notamment le cancer gastrique [27], [28]. Oliveira et al. [29] ont rapporté un lien étroit entre la perte E-cadhérine et le potentiel métastatique élevé dans le cancer gastrique. Chan et al. [30] ont également rapporté soluble dans l'E-cadhérine en tant que biomarqueur pour la survie prolongée des patients atteints d'un cancer gastrique. NDRG1 effet de choc a entraîné relativement plus élevée E-cadhérine expression dans AS1 /Sic50 tumeurs que dans les tumeurs As1 /Mock3, ce qui suggère que NDRG1 peut en particulier commander l'EMT éventuellement par l'escargot facteur de transcription par les cellules cancéreuses gastriques (figure 7E).

Wnt a un rôle central dans la progression maligne et les métastases par les cellules cancéreuses du poumon et du sein [31], [32] et la signalisation Wnt provoque également EMT qui implique la progression métastatique du cancer épithélial [31], [33]. NDRG1 est connu comme un gène suppresseur de métastases de la prostate et des cellules du cancer colorectal [11], [12]. Liu et al [18] ont signalé que NDRG1 supprime les métastases par voie de signalisation Wnt /β-caténine dans les cellules cancéreuses de la prostate. Une étude pertinente par Chen et al [19] ont également démontré que NDRG1 modulant EMT TGF-β induite par l'expression altérée de β-caténine et E-cadhérine dans la cellule du cancer colorectal. Notre étude a montré présente une expression réduite de la β-caténine dans les deux lignées cellulaires hautement métastatiques par rapport à la contrepartie parentale, HSC-58. Cependant, à la fois Western Blot et qRT-PCR analyses ont montré aucun changement notable dans les niveaux de β-caténine et a également une activité de promoteur β-caténine entraîné entre les cellules fortement métastasiques 58As1 et ses lignées cellulaires réduits au silence de deux NDRG1 expression. Il semble moins probable que β-caténine joue un rôle central dans la suppression des métastases par NDRG1 knockdown dans les cellules cancéreuses hautement métastatiques.

D'autre part, GSK-3β est également connu pour jouer un rôle dans le contrôle de EMT [20], [21], et GSK-3β est une enzyme essentielle pour la phosphorylation de NDRG1, une excellente substate de GSK-3β [22], [23]. L'expression de la p-GSK3ß était relativement plus élevée dans les lignées cellulaires hautement métastatiques que leur lignée cellulaire parentale (figure 2B). Le traitement avec un inhibiteur de la GSK-3β a donné lieu à une expression supprimée p NDRG1, accompagné d'une régulation positive de la E-cadhérine et de β-caténine (figure 5D). Cependant, il n'y avait presque pas de différence dans l'expression de GSK-3β et de p-GSK-3β par NDRG1 effet de choc dans les cellules fortement métastasiques (figure 4B), ce qui suggère que la GSK-3β ne peut pas jouer un rôle majeur dans l'induction de l'EMT au travers NDRG1 dans les cellules cancéreuses gastriques.

Snail est un facteur de transcription qui contrôle l'expression représentative de la E-cadhérine [20]. De divers facteurs de régulation qui contrôlent la transcription E-cadhérine, l'expression de Snail a été spécifiquement modulée par NDRG1 gastriques dans des lignées de cellules cancéreuses utilisées dans cette étude. Snail knockdown surexpression induite par la E-cadhérine (figure 5A), et tarnsfection exogène de Snail ADNc supprimé E-cadhérine activité de promoteur (figure 5B).

Dans les lignées cellulaires de cancer gastrique hautement métastatiques, l'expression de Snail a été régulée à la hausse comme par rapport à leur faible homologue métastatique, HSC-58 (figure 2A, B). Les deux lignées cellulaires NDRG1 silencieux, As1 /Sic50 et As1 /Sic54, ont montré une diminution de l'expression Snail par rapport à leur homologue hautement métastatique, As1 /Mock3 (figure 4B, C). En outre, l'activité du promoteur E-cadhérine a été considérablement stimulée dans les deux NDRG1 taire des lignées cellulaires par rapport à leur homologue hautement métastatique (Figure 5C).

En conclusion, NDRG1 knockdown induit la surexpression de la E-cadhérine et la régulation négative de la vimentine et escargot, et supprime l'invasion, la métastase et l'accumulation d'ascite par les cellules cancéreuses gastriques hautement métastatiques. NDRG1 cette régulation à médiation par la E-cadhérine et /ou d'une transition épithéliale mésenchymateuses expression de la vimentine affectées des cellules cancéreuses gastriques. Cette NDRG1 modification induite des EMT semble être au moins en partie attribuable au facteur de transcription Snail. NDRG1, dans son contexte étroit avec les gènes EMT liés, pourrait participer à l'acquisition d'un potentiel métastatique élevé par les cellules cancéreuses gastriques progressives.

Matériaux et lignées cellulaires de Matériels et méthodes

HSC-58 a été établie à partir de carcinomes gastriques squirrheuses humaines et 58As1 et 58As9 ont été indépendamment établie par implantation orthotopique répétée de HSC-58 cellules dans la paroi gastrique des souris athymiques comme décrit précédemment [5], [6]. cellules As1 /Sic50 et As1 /Sic54 ont été établies par la transfection stable de NDRG1 shRNA dans les cellules 58As1. Toutes les lignées cellulaires ont été maintenues dans du milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS). BxPC-3, une des lignées cellulaires du cancer du pancréas humain, a été obtenu auprès de l'American Type Culture Collection (Manassas, VA). un anticorps anti-NDRG1 a été généré comme décrit précédemment [34]. D'autres anticorps ont été achetés comme suit: l'anticorps anti-β-actine et de l'anticorps anti-Snail provenaient Abcam; un anticorps anti β-caténine, anti-β-caténine (ser 33/37), anti-β-caténine (ser 552), anti-Wnt, anti-Ki-67, un anticorps anti-GSK-3β, anticorps anti-EGFR, anti-GAPDH anticorps, anti-p-GSK-3β anticorps, anticorps anti-ERK1 /2 contre p-ERK1-anticorps /2, un anticorps anti-AKT, anti-p-AKT anticorps étaient de Cell Signaling Technology; un anticorps anti-vimentine provenait de Calbiochem; anticorps anti-E-cadhérine était de BD. CT99021 a été acheté chez Axon Medchem BV (Pays-Bas).

Microarrays Gene Expression

ARN complémentaire a été amplifié, marqué et hybridé à un 44K Agilent 60-mer oligomicroarray selon les instructions du fabricant (Agilent Les technologies). Toutes les lames microarray hybridées ont été numérisés par un scanner Agilent. intensités d'hybridation relatives et les valeurs d'hybridation de fond ont été calculées à l'aide Agilent Feature Extraction Software. Pour identifier les rapports ou les gènes régulés à la baisse, nous avons calculé (non-log pliage changements mis à l'échelle) des intensités de signaux normalisés de chaque sonde pour la comparaison entre le contrôle et les échantillons expérimentaux. Nous avons ensuite établi des critères pour les gènes régulés: régulés à la hausse des gènes, le rapport ≥2 fois; régulé à la baisse des gènes, le ratio ≤0.5.

Construct de NDRG1 shRNA et l'établissement de NDRG1 Knockdown lignées cellulaires

Pour obtenir humain un vecteur U6 siRNA basé sur pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA), le promoteur U6 humain (contenant Hind III et
Bam HI
sites de clonage) a été amplifié à partir d'ADN génomique humain avec la paire d'amorces 5 'et 5' AGATCTGAATTCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGC AGATCTAAGCTTCTCGAGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAG, et ligaturé dans le Bgl
II site pcDNA3. Les fragments d'ADN partiels d'ADN NDRG1 humain ont été synthétisés chimiquement et clones dans pcDNA3-hU6siRNA clivé avec Hind III
et Bam
HI pour produire pcDNA3shNDRG1. Les ADN synthétisés pour pcDNA3shNDRG1 étaient: 5'-GATCCGCGTGAACCCTTGTGCGGAATTCAAGAGATTCCGCACAAGGGTTCACGTTTTTTGGAAA et: 5'-AGCTTTTCCAAAAAACGTGAACCCTTGTGCGGAATCTCTTGAATTCCGCACAAGGGTTCACGCG. L'escargot ADNc a été préparé comme décrit précédemment [35]. Escargot L'ADNc a été ligaturé dans pcDNA3 (pcDNA3-escargot). Les cellules ont été transfectées avec pcDNA3-pcDNA3shNDRG1 ou d'escargot utilisant de la Lipofectamine 2000 (Invitrogen) selon le protocole du fabricant. clones transfectées stables ont été établies en utilisant la sélection de G418.

Transfection des petits ARN interférents

ARNi correspondant aux séquences nucléotidiques de Snail et β-caténine ont été achetés chez Invitrogen (Carlsbad, CA), respectivement, siRNA duplex ont été transfectées en utilisant Lipofectamine RNAiMAX et moyennes Opti-MEM (Invitrogen) selon les recommandations du fabricant.

Luciferase Assay

pour obtenir la E-cadhérine-Luc vecteur, promoteur E-cadhein (-262 à 120) a été amplifié par PCR en utilisant les paires d'amorces suivantes: 5'- AGATCTTAGTGAGCCACCGGCGGGGC-3 'et 5' AAGCTTGGCCGGGGACGCCGAGCGAGGG-3 '. Soulignements indiquent les sites de restriction enzymatique de clivage. Le fragment amplifié a été ligaturé dans le vecteur pGEM-T facile (Promega) et transféré dans le vecteur pGL3-basic (Promega) dans les sites BglII et HindIII. E-cadhérine-Luc et pcDNA3-escargot ont été transfectées en utilisant la lipofectamine et LTX milieu Opti-MEM (Invitrogen) selon les recommandations du fabricant. Après 24 heures, l'activité luciférase a été mesurée en suivant les instructions du fabricant (Promega). En outre, nous avons également examiné l'activité luciférase entraînée par β-caténine en utilisant vecteur rapporteur TopFlash comme décrit précédemment [18].

Soft Agar Formant Colonie dosage

4 × 10 ^{3 cellules ont été étalées dans 1 ml de milieu de culture contenant 0,36% (p /v) de gélose en couches sur une couche basale de 0,72% (p /v) d'agar-agar dans des plaques à 6 puits et on laisse croître pendant 3-4 semaines. Les colonies ont été photographiées et comptées dans dix champs aléatoires de vue à grossissement 50X en utilisant la microscopie optique. Chaque expérience a été réalisée en trois exemplaires.}

Western Blot Analysis Fractionnement de noyau et du cytoplasme

Les cellules ont été lysées dans un tampon contenant 50 mM de Tris-HCl, 350 mM de NaCl, 0,1% de NP40, 5 mM EDTA, 50 mM de NaF, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 10 ug /ml d'aprotinine, 10 pg /ml de leupeptine et 1 mM Na3VO4. Des lysats totaux de cellules ont été soumises à une SDS-PAGE et transférés sur des membranes Immobilon (Millipore Corp., Bedford, MA) comme décrit précédemment [24], [25]. Pour préparer cytosol et de la fraction nucléaire, les cellules ont été lysées dans bufferA (inhibiteurs de HEPES 10 mM, pH 7,9, KCl 10 mM, EDTA 10 mM, DTT 1 mM, 0,4% d'IGEPAL et la protéase) et incuber pendant 20 minutes sur de la glace. Après centrifugation (3 min, 5000 rpm), le surnageant a été utilisé en tant que fraction cytoplasmique. Les culots résultants ont été remis en suspension dans bufferB (20 inhibiteurs de HEPES, pH 7,9, 200 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, 5% de glycerol, 1 mM de DTT et de la protéase) et incubées pendant 2 heures avec une agitation continue à 4 ° C. Après centrifugation (5 min, 15 000 rpm), le surnageant a été utilisé en tant que fraction nucléaire.

• PLOS ONE: Expression Profiling des souches cellulaires liées Gènes dans le cancer gastrique néoadjuvante-traité: A NOTCH2, GSK3B et β-caténine Gene Signature Prédit Survival
• PLOS ONE: Rôle du facteur de croissance endothéliale (VEGF) et le VEGF-R génotypage dans l'orientation du processus métastatique dans pT4a réséqué gastrique Cancer Patients