PLoS ONE: N-MYC Pasroviui Reguliuojamos Genų 1 (NDRG1) Skatina metastazes Žmogaus Tarpikliai Skrandžio vėžio ląsteles per epitelio mezenchiminių Transition

Abstract

Mūsų Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad didesnė raiška N-myc downregulated geną 1 (NDRG1) yra glaudžiai susijęs su blogos prognozės skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Šiame tyrime mes paprašėme, ar NDRG1 turi centriniai vaidmenis piktybinės ligos progresavimo įskaitant metastazių skrandžio vėžio ląsteles. Genų ekspresijos mikrogardeliq analizės išraiškos NDRG1 parodė išaugusį tarp daugelio 3691 iš viso iki reguliuojamų genų labai skrandžio vėžiui ląstelių linijos (58As1) nei jų tėvų mažo metastazavusiu kolega (HSC-58). Labai metastaziniai ląstelių linijas parodė sumažėjo išraišką E-cad, kartu su padidintu išraiška vimentin ir sraigė. Tai sumažėjo išraiška E-cad buvo atkurta sraigė triuškinantis į labai metastazavusiu ląstelių linijų. Mes šalia nustatė stabilią NDRG1 triuškinantis ląstelių linijas (AS1 /Sic50 ir AS1 /Sic54) iš labai metastazavusiu ląstelių linijos, ir abu iš šių ląstelių linijas parodė sustiprintas išraišką E-cad ir sumažėjo išraiška vimentin ir sraigė. Taip pat, buvo nustatyta El cad rengėjas varoma liuciferazė veikla būtų padidintas NDRG1 triuškinantis į labai metastazavusiu ląstelių linija. NDRG1 nokdaunas skrandžio vėžio ląstelių parodė slopino invazija vėžinių ląstelių į erdvinio audinių, slopino metastazių į pilvaplėvės ir sumažėjo ascitas kaupimąsi pelių žymiai pagerėjo išgyvenimo. Tai pirmasis tyrimas, siekiant įrodyti, kad NDRG1 atlieka savo pagrindinį vaidmenį piktybinės ligos progresavimo skrandžio vėžio per epitelio mezenchimos perėjimo

nurodomoji dalis:. Ureshino H Murakami Y Watari K Izumi H Kawahara A Kage M , ir kt., (2012) N-MYC Pasroviui Reguliuojamos Genų 1 (NDRG1) Skatina metastazių žmogaus Tarpikliai Skrandžio vėžio ląsteles per epitelio mezenchiminių perėjimą. PLoS vieną iš 7 (7): e41312. Doi: 10,1371 /journal.pone.0041312

redaktorius: Rakesh K. Srivastava, Kanzaso medicinos centro universitetas, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Gruodžio 8, 2011 m Priėmė: Gegužės 22, 2012 m Paskelbta: Lie 23, 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Ureshino et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė dotacija-in-pagalbos vėžio tyrimų iš švietimo, kultūros, sporto, mokslo ir technologijų Japonijos ministerijos (dr Ono), o iki 3. Terminas išsamią kontrolės tyrimų vėžio iš sveikatos apsaugos ministerijos, darbo ir socialinės apsaugos Japonijos (dr Kuwano). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra viena iš labiausiai paplitusių piktybinių navikų Japonijoje ir kitose Azijos šalyse. Pacientas prognozė Tarpikliai skrandžio karcinoma yra ypač prasta. Tarpikliai skrandžio karcinoma dažnai lydi peritoninės sklaidos ir metastazių į limfmazgius ir kepenų, kurios rimtos problemos, kurios turi būti kontroliuojami. Genų ekspresijos profilis atskleidė genų amplifikaoija K-sam ir c-met į 30-40% Tarpikliai skrandžio vėžio, ir, kad įvairių augimo faktorių, tokių kaip transformuojasi augimo faktoriaus-beta (TGF-) raiška, trombocitų kilmės augimo faktorius (PDGF), į insuliną panašaus augimo faktoriaus I (IGF) ir fibroblastų augimo faktoriaus-2 (FGF-2) [1]. Naujausi DNR Mikrogardelė analizė parodė konkrečią ląstelę keletą genų, įskaitant SPARC
RGEIII
S100A10
ir kolageno I tipo [2] - [4].

Gyvūnų modeliai, atspindintys vėžinių peritonitas ir metastazių savybes į pilvaplėvės yra svarbu suprasti, kad piktybinės ligos progresavimo plėtrą skrandžio vėžio. Yanagihara , et al.,
[5] pirmiausia nustatė SSK-58 ląstelių liniją nuo žmogaus Tarpikliai skrandžio vėžiu, tada nustatė du sublines, 58As1 ir 58As9, su dideliu potencialu peritoninės sklaidos ir limfmazgių metastazių pakartotinai orthotopic Sėjimas SAK-58 ląstelių į skrandžio sienelės athymic pelių [6], [7]. Šie sublines dažnai sukelia kaupimosi ascitas po orthotopic implantacijos ir parodyti didesnį genų, koduojančių proteazės ir dalyvaujančius baltymus ląstelių sukibimą, ląstelių judrumui, platinimo ir angiogenezę [6]. Jie taip pat auga pasirinktinai skrandžio submucosa ir įsiveržti į gilesnį sluoksnį pasiekti serosal lėktuvą skrandžio [7]. Tačiau lieka neaišku, kodėl jie įgijo tokį didelį potencialą metastazių atrankos metu.

Mūsų Šiame tyrime mes naudojome šiuos labai neišplitusios ląstelių linijas ištirti, kaip žmogaus skrandžio vėžio ląstelės gali įsigyti metastazavusiu potencialą. Mes pirmą kartą palyginti genų ekspresijos profilius tarp labai metastazavusiu ir žemos metastazavusiu tėvų ląstelių linijų mikrogardeliq analizė. Mes sutelktas į vieną geną, pavadintą N-MYC pasroviui reguliuoja genų 1 (NDRG1), nes buvo nustatyta, kad ji labai aktyvinama per labai skrandžio vėžiui ląstelių linijų, palyginti su jų analogiškų ląsteles. Taip pat buvo anksčiau pranešė, kad NDRG1 išraiška buvo Wypowiedzeniowy žymeklis piktybinės ligos progresavimo ir blogos prognozės skrandžio pacientų [8]. Laikantis šio tyrimo, mes nustatėme, kad aukštos NDRG1 išraiška reikšmingai koreliavo su naviko angiogenezę ir piktybinės ligos progresavimo kartu su prastos prognozės skrandžio [9] vėžiu. Mes taip pat pranešė, kad NDRG1 triuškinantis Skatina sumažėjo gamybos stiprių angiogeninių veiksnių ir naviko angiogenezę plaučių vėžio ląstelių, o taip pat, kad NDRG1 tai nuspėjamo žymeklis naviko angiogenezę ir blogos prognozės pacientams, kuriems nebuvo smulkiųjų ląstelių plaučių vėžio [10]. taip NDRG1, vienas iš keturių NDRG šeimos genai, rodo įvairių funkcijų [11], ir NDRG1 funkcijas arba kaip metastazių slopintuvas arba kaip onkogeninių ir piktybinės promotoriaus, priklausomai nuo naviko tipų [11], [12]. Be to, išraiška NDRG1 geno yra griežtai kontroliuojama N-Myc ir susijusių Myc šeimos baltymų [13] ir raiškos C-Myc sukeltas epitelio mezenchimos perėjimo (EMT) į pieno epitelio ląstelių [14]. Svarbus vaidmuo EMT dažnai vadinama jos glaudžiai kontekste plėtros ir naviko progresavimas įskaitant vėžio metastazių [15], [16]. Tačiau šiuose tyrimuose, reguliavimo vaidmuo NDRG1 buvo netirta. Mūsų Šiame tyrime mes tyrė metastazavusiu potencialą skrandžio vėžio ląstelių jo koreliacija su EMT įsikūrusio vaidmenį NDRG1.

Rezultatai

palyginimas ląstelių augimą, ląstelių morfologija, naviko augimą, sklaida ir genų ekspresijos profilius tarp labai skrandžio vėžiui ląstelių linijų ir jų Žemas metastazavęs Priešingos

Laikantis ankstesnių tyrimų [6], [7], su labai metastaziniai vėžio ląstelių linijas 58As1 ir 58As9 augimo tempai buvo spartesni nei jų tėvų kolega, SAK-58, su dvigubai laikus 23-26 val palyginti su 30 val tėvų ląstelių (1a pav.) 58As1 ląstelės buvo lengvai nuimami ir parodė pakaba tipo ląstelių augimą su apvalia morfologijos, o SAK-58 ir 58As9 ląstelės buvo pridėtas ir parodė sluoksnių ląstelių augimą su fibroblastų morfologijos (1b pav.) Abu 58As1 ir 58As9 ląstelės parodė žymiai didesnį naviko augimo tempus po oda ksenografiniuose modelį palyginti su tėvų SAK-58 ląstelių (1c pav.) Ankstesni tyrimai parodė, kad orthotopic transplantacija 58As1 ląstelių sukeltas daug didesnę pilvaplėvės sklaidos ir ascitu kaupimosi nei SAK-58 ląstelių [6], [7]. Mes dar kartą patvirtino pilvaplėvės sklaidą Po to ląstelės implantuoti juos į pilvaplėvės ertmę pelių. Pelės implantuojami su 58As1 ląstelių parodė AN 8 ± 3 matomų mazgelių vidutiniškai išvaizdą kiekvieno pele ir kaupimo ascitu (nuo 0.7-2.5 ml /pelė) (pav 1D, E) mesenterium. Priešingai, pelės implantuoti su tėvų SAK-58 ląstelių parodė Vargu, ar mažų mazgelių susidarymą ir neturi akivaizdaus kaupimosi ascitas.

Kitas palyginti genų ekspresijos profilius tarp 58As1 ląstelių ir jų tėvų kolega HSC- 58, naudojant DNR mikrogardeliq analizę. Iš 41000 RNR nuorašai ir variantų, mes nustatyti 3691 diferencijuotai išreikštus genus, kurie buvo aktyvinama 2 kartus, ir 3536 genus, kurie buvo downregulated iki 0,5 kartų arba mažiau 58As1 ląstelių, palyginti su SAK-58 ląstelių. 1F pav pateikti genus, kurie buvo skirtingai išreikštas 58As1 ląstelių, palyginti su SAK-58 ląstelių, riboja priklausanti NDRG šeimos, ir genus, susijusius su metastazėmis, įskaitant matricos metaloproteinazių (MMP) /katepsinų, sukibimo ir epitelio-mezenchimos-perėjimo ( EMT). Iš keturių genų į NDRG šeimos [17], iš NDRG1 ir NDRG4 išraiška buvo aktyvinama į labai metastazavusiu ląstelių linijos (58As1), palyginti su tėvų ląstelių linijos (SAK-58). Iš EMT susijusių genų 58As1 ląstelių išraiška buvo ypač paveikė aukšto metastazavusiu potencialo įsigijimo. Iš epitelio konkrečių genų, įskaitant E-cad išraiška ( CDH1
), P-cad ( CDH3
) ir β-kateninai ( CTNNB1
), buvo downregulated , Priešingai, tik MMP1 ( MMP1
) išraiška buvo ženkliai aktyvinama; iš katepsino L išraiška ( CTSL1
) buvo padidintas, bet kad katepsino B ( CTSB pervežimas) nebuvo. Iš mezenchima konkrečių genų, vimentin ( VIM
) ir sraigė ( SNAI1
), pagrindinis transkripcijos faktorius už E-cad raiškos slopinimo, išraiška buvo aktyvinama.

Glaudesnis NDRG1 genų raiška Labai skrandžio vėžiui ląstelių linijų

Mes taip pat palyginti baltymų ekspresiją kelių genų SSK-58, 58As1 ir 58As9 ląstelių (2a pav.) Iš NDRG1 išraiška buvo ženkliai padidėjo, ir kad vimentin, sraigė, p ERK1 /2, P-Akt, ir p-GSK-3β taip pat buvo padidintas, tiek 58As1 ir 58As9 ląstelių, lyginant su SAK-58 ląstelių. Nebuvo aišku, išraiška Wnt3a ir Wnt5a šių ląstelių linijas (duomenys neparodyti). Priešingai, mes nustatėme, sumažėjo išraišką E-cad ir beta-kateninai į 58As1 ir 58As9 ląstelių, lyginant su SAK-58 ląstelių (2A pav.) buvo rastas fosforilinimo beta-kateninai Ser33 /37 ir Ser552 būti daug mažiau 58As1 ir 58As9 nei HSC58. Suderinamas su baltymų ekspresijos lygį, iRNR raiška lygiai NDRG1, vimentin, sraigė ir MMP-1 buvo didesnis tiek labai metastazavusiu ląstelių linijų, nei jų tėvų kolega (2b pav.) Ten buvo daug mažiau iRNR raiška E-cad ir beta-kateninai tiek 58As1 ir 58As9 nei SAK-58.

imunocitocheminiam analizė parodė, kad lokalizacija E-cad tiek citoplazmoje ir membranos, ir beta-kateninai buvo dažniausiai lokalizuojasi citoplazmoje abiejose SSK-58 ir 58As9 ląstelių (2c pav.) Imunocitocheminiam analizė 58As1 negalėjo būti atliekami kaip 58As1 auga sustabdymo. Be to, išraiška beta-kateninai buvo santykinai mažesnis tiek citoplazmos ir branduolio, bet kad sraigė buvo nustatyta, kad bus daug didesnis branduolio 58As1 ir 58As9 nei SSK-58 (2d pav). Mes taip pat išnagrinėjo El cad promotoriaus aktyvumą (2e pav) ir β-kateninai sukeltas reporteris aktyvumą TopFlash reporterio testą (2F paveikslas) ir nustatė, kad buvo padaryta reikšmingų sumažėjimas liuciferazės veiklos lemia El cad promotoriaus ir taip pat beta-kateninai tiek 58As1 ir 58As9 palyginti su SSK-58, suderinamas su mRNR lygių abiejų genų.

NDRG1 triuškinantis Skatina e-cad ląstelę ir Vimentin ir sraigė downregulation į labai metastazavusiu Cells

Mes šalia išnagrinėti, ar NDRG1 nokdaunas specialiai paveikė EMT susijusių genų ekspresiją labai metastazavusiu ląstelių linija, 58As1. Mes sukūrėme du stabilius NDRG1 triuškinantis ląstelių klonai, AS1 /Sic50 ir AS1 /Sic54 iki transfekuoja NDRG1 shRNR į 58As1 ląsteles. Tiek AS1 /Sic50 ir AS1 /Sic54 ląstelės parodė panašius augimo tempus tarpusavyje ir jų tėvų analogiškus AS1 /Mock3, su dvigubai laikus 25-27 val kultūra (3a paveikslas). Abu NDRG1 nutildė ląstelių linijas parodė stora sukibimą ląstelių kultūrai patiekalas ir fibroblastų morfologijos, o AS1 /Mock3 ląstelės parodė pakaba tipo ląstelių augimą su apvalia ląstelių morfologija (3b pav.) Mes šalia išnagrinėjo NDRG1 nuslopinami poveikis tumorogeniškas veiklos 58As1 ląstelių, naudojant tvirtinimo nepriklausomas augimo tyrimą. Abu NDRG1 nutildė ląstelių linijas parodė žymiai sumažinti jų tvirtinimo nepriklausomas augimo, kaip nurodyta kolonijų skaičius minkštas agaro ( ^{* P <
0,01). (3c pav)}

Tada lyginome genų ekspresijos profilius tarp AS1 /Mock3 ir AS1 /Sic50 elementams, kuriuose naudojamas DNR mikrogardeliq analizę (4a pav.) NDRG1 nokdaunas lėmė padidėjusios raiškos E-cad ( CDH1
) ir P-cad ( CDH3 pervežimas), tačiau sumažėjo išraiška vimentin ( VIM pervežimas) ir sraigė ( SNAI1
). Mes šalia atliekama Vakarų dėmė ir KRL-RCR analizuoja keletą molekulių, kurios buvo moduliuojamos NDRG1 triuškinantis į mikrogardeliq analizė (4b paveikslas C). Šie du ląstelių linijos parodė daug mažesnį išraiška tiek NDRG1 mRNR ir baltymų, palyginti su AS1 /Mock3 ląstelių. Glaudesnis išraiška E-cad buvo nuolat stebimas AS1 /Sic50 ir AS1 /Sic54 ląstelių, palyginti su AS1 /Mock3 ląstelėse Vakarų dėmė analizė. Be AS1 /Sic50 ir AS1 /Sic54 ląstelių, tiek Vakarų dėmė ir KRL-PGR analizė patvirtino sumažėjo išraiška vimentin ir sraigė nepaveikiant išraišką p-ERK1 /2 ERK1 /2, p-Akt, Akt, p-GSK-3β ir GSK-3β (pav 4B, C).

iš kitos pusės, NDRG1 yra gerai žinoma, kad slopinti metastazių ir ląstelių proliferaciją prostatos ir storosios žarnos vėžio ląstelių. Naujausi tyrimai parodė, kad NDRG1 moduliuoja WNT-β-kateninai signalizacijos kelią su padidintu raiškos E-cad į žmogaus prostatos ir storosios žarnos vėžio ląstelių [18], [19]. Tačiau NDRG1 nokdaunas į 58As1 ląstelių neturėjo įtakos β-kateninai išraišką tiek baltymų ir iRNR lygio (4b paveikslas C). Ir taip pat β-kateninai varomas rengėjas veikla, TopFlash reporterio testą paaiškėjo nesiskiria promotoriaus veiklos tarp AS1 /Mock ir NDRG1 nutildė ląstelių linijas. Todėl, β-kateninai išraiška nebuvo paveikti NDRG1 triuškinantis. NDRG1 taip triuškinantis nuosekliai didėjo išraišką E-cad ir sumažėjo išraiška sraigė ir vimentin į labai metastazavusiu ląstelių linija. Tačiau nebuvo aišku, pokytis išraiška beta-kateninai iki NDRG1 triuškinantis.

Glaudesnis El cad Rėmėjas aktyvumą NDRG1 triuškinantis per sraigė skrandžio vėžio ląstelių

Įvairių transkripcijos veiksnių, kurie silpnina išraiška E-cad įskaitant sraigė, šliužas, ir Tvist, TCF4 ir SIP1 [20], išraiška sraigė buvo specialiai moduliuoti NDRG1 skrandžio vėžio ląsteles. Mes išnagrinėti, ar išraiška E-cad ir /ar vimentin gali būti reguliuojamas sraigė į SAK-58 ląstelių. Praeinantis gydymas sraigė siRNA lėmė padidėjusios raiškos E-cad, bet ne kad vimentin ir NDRG1, laiku priklausomu būdu (5a pav.) Buvo tik šiek tiek, jei bet koks β-kateninai išraiška padidėjo sraigė triuškinantis. Be to, e-cad rengėjas varoma liuciferazė veikla buvo reikšmingai slopino transfekuojant sraigė papildomą DNR dviem vėžio ląstelių linijų išbandytų (5b pav.) Mes šalia palyginti El cad promotoriaus aktyvumą tarp AS1 /Mock3 ir jos NDRG1 nutildė ląstelių linijų. Kaip matyti iš 5C paveiksle, buvo reikšmingas (* P
< 0,05) stiprinimas E-cad promotoriaus veiklos pagal NDRG1 triuškinantis

GSK-3β yra pagrindinis fermentas aktyvavimo EMT. kelias [20], [21], o taip pat fosforilinimo NDRG1 [22], [23]. Išraiška p-GSK-3β buvo padidintas labai metastazavusiu ląstelių linijos, 58As1 (žr 2a paveikslas). Mes išnagrinėti, ar GSK-3β dalyvavo NDRG1 sukeltas pakitusiu raiškos E-cad ir vimentin. Gydymas inhibitoriaus (CT99021) GSK-3β lėmė sumažėjęs išraišką p-NDRG1 ir p-GSK-3β, taip pat padidėjo išraiška E-cad ir beta-kateninai į 58As1 ląstelių (5d pav). Kaip parodyta 5E paveiksle, β-kateninai nokdaunas neturėjo įtakos išraiška El cad, vimentin ir sraigė.

NDRG1 triuškinantis Skatina mezenchiminių epitelio Pereinamojo laikotarpio ir slopina Metastazė į aukštos skrandžio vėžiui ląstelių pilvaplėvės

"Lyginant naviko augimo tempus AS1 /Mock3, AS1 /Sic50 ir AS1 /Sic54 ląstelių į svetimo modelio atskleidė lėčiau naviko augimo tempus tiek AS1 /Sic50 ir AS1 /Sic54 iki NDRG1 triuškinantis (6a pav B). NDRG1 nokdaunas slopino vietos Invazija AS1 /Mock3 vėžinių ląstelių į supančią stromos ir gretimos riebaliniame ir /arba raumenų audinio ir aplieti naviko augimą (6c pav). Aukštos raiškos E-cad buvo pastebėtas AS1 /Sic50 ir AS1 /Sic54 navikų, o aukštos raiškos vimentin buvo stebimas vėžiu ląstelių AS1 /Mock3 navikų (6d pav). Priešingai, ten buvo beveik jokio išraiškos beta-kateninai į AS1 /Sic50 ir AS1 /Sic54 navikų, palyginti su AS1 /Mock3 naviko kaita.

Jei išnagrinėti, ar NDRG1 nokdaunas gali paveikti metastazių į pilvaplėvės ir kaupimo iš ascitas, mes palyginti metastazavusiu potencialą AS1 /Sic50 ir AS1 /Mock3 ląstelių po orthotopic transplantacijos. 7A paveikslas rodo atstovybes vaizdus išsiplėtusios pilvo ertmę ir vėžio junginių buvimo pilvaplėvės. Po orthotopic Sėjimas AS1 /Sic50 ląstelių, iš mazgelių, įtrauktų į pilvaplėvės skaičius buvo apie 30% mažiau nei tos, kurios atsiranda AS1 /Mock3 ląsteles, tačiau šis sumažėjimas nebuvo statistiškai reikšmingas ( P
= 0,21) (7B pav.) Tačiau mazgeliai atsiranda AS1 /Sic50 ląstelių parodė daug mažesni dydžiai nei iš AS1 /Mock3 ląstelių (7A pav.) Iš ascitas kaupimo pagal AS1 /Sic50 ląstelių buvo žymiai (* p < 0,01) sumažėjo, iki maždaug 10% nuo tas, kurį sukelia AS1 /Mock3 ląstelių (Pav 7C). Be to, ten buvo reikšmingas (* P
< 0,01) padidėjo išgyvenamumas pelių užkrėstų AS1 /Sic50 ląstelių (51 ± 16 dienos), palyginti su 35 ± 14 dienų pelių užkrėstų AS1 /Mock3 ląstelės, nurodydama, kad NDRG1 nokdaunas pailgina išgyvenamumą (7d pav.)

Diskusijos

Mes jau anksčiau pranešė, kad NDRG1 glaudžiai koreliuoja su naviko angiogenezę ir prastos išlikimo pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu, rodo, kad NDRG1 tai nuspėjamo biologinis piktybinė progresavimo skrandžio vėžio [9]. Iš mūsų Šiame tyrime mes laikomasi šių savybių, kuriomis remiantis aukšto metastazavusiu potencialo skrandžio vėžio įsigyti: microarray, Vakarų dėmė ir RT-PGR analizė kartu atskleidė ląstelę NDRG1 į labai metastazavusiu ląstelių linijų, 58As1 ir 58As9, palyginti su jų mažas metastazavusiu tėvų kolega, SAK-58; didesnis išraiška vimentin, sraigė, ir MMP-1, ir mažesnės raiškos E-cad ir beta-kateninai buvo akivaizdus labai metastazavusiu ląstelių linijų, palyginti su jų tėvų kolega; genų downregulated į labai metastazavusiu ląstelių linijos, NDRG1 triuškinantis rezultatas ląstelę E-cad ir downregulation iš vimentin ir sraigė, tačiau beveik jokios įtakos išraiška beta-kateninai poveikio; El cad rengėjas veikla buvo gerokai papildyta NDRG1 triuškinantis; NDRG1 nokdaunas pat mažina peritoninė sklaidą ir kaupimosi ascitas ir invazija labai metastazavusiu ląstelių į aplinkinių sveikų audinių.
6

Šiame tyrime NDRG1 nokdaunas lėmė metastazių slopinimas labai skrandžio vėžiui ląstelių (paveikslas , 7), tai rodo, kad NDRG1 gali būti metastazių promotorius genas, o ne metastazių slopintuvas genų skrandžio vėžio. Mūsų dabartinis tyrimas tvirtai remia mintį, kad, ar NDRG1 skatina arba slopina piktybinių progresavimas žmogaus vėžio priklauso nuo naviko tipo ir /ar diferenciacija statuso [11], [12]. Tačiau lieka neaišku, kodėl NDRG1 veikia kaip naviko slopintuvas ar rengėjas priklausomai nuo naviko tipų ar histologinių tipų. Mūsų Ankstesnis tyrimas parodė, kad NDRG1 slopina naviko augimą bei angiogenezę kasos vėžio per NDRG1 varomas silpninimo NF-κB signalinio kelio [24], [25]. Neseniai atliktas tyrimas pranešė, kad išraiška metastazės slopinamojo geno KAI1
genas, dalyvauja NDRG1 tarpininkaujant metastazių slopinimo prostatos vėžio per ATF3-NF-κB keliu [26]. Daugiau tyrimas privalo suprasti, kokios reguliavimo mechanizmas yra specialiai atsakingas už NDRG1 varomas skatinimo piktybinės ligos progresavimo skrandžio vėžio ląsteles.

EMT yra neseniai akcentas, kuris gali būti glaudžiai susijęs su vėžio piktybinei progresavimo įskaitant įsigijimą labai metastazavusiu potencialo [15], [16]. Mūsų Šiame tyrime NDRG1 nokdaunas sustiprino E-cad išraišką ir slopino vimentin išraišką tiek in vitro, parsisiųsti ir vivo
. NDRG1 gali vaidinti pagrindinį vaidmenį pereinant nuo poliarizuota epitelio ląstelių fenotipo į labai judrių mezenchimos fenotipą. Dalinis ar visiškas praradimas E-cad dažnai pastebimas per progresavimo link piktybinių navikų daugelyje navikų, įskaitant skrandžio vėžio [27], [28]. Oliveira ir kt. [29] pranešė apie glaudų ryšį tarp e-cad nuostolių ir aukštos metastazavusiu potencialo skrandžio vėžio. Chan ir kt. [30] taip pat pranešė, tirpus E-cad kaip ilgai išgyventi skrandžio vėžiu sergantiems pacientams biologinis žymuo. NDRG1 nokdaunas lėmė santykinai didesnį El cad išraišką AS1 /Sic50 navikų negu AS1 /Mock3 navikų, o tai rodo, kad NDRG1 gali specialiai kontroliuoti EMT galbūt per transkripcijos faktorius sraigė skrandžio vėžio ląstelių (7E pav.)

WNT signalizacijos turi centriniai vaidmenis piktybinės ligos progresavimo ir metastazių plaučių ir krūties vėžio ląstelių [31], [32], ir WNT signalizacijos taip pat skatina EMT, kuris naudoja metastazių progresavimas epitelio vėžio [31], [33]. NDRG1 yra žinomas kaip metastazių slopinamojo geno prostatos ir storosios žarnos vėžio ląstelių [11], [12]. Liu ir kt [18] pranešė, kad NDRG1 slopina metastazių per WNT /β-kateninai signalinio kelio į prostatos vėžio ląstelių. Atitinkami tyrimai Chen et al [19] taip pat parodė, kad NDRG1 moduliuoja TGF-beta-sukeltas EMT per pakeisti išraiška beta-kateninai ir E-cad į gaubtinės žarnos vėžio ląstelių. Mūsų dabartinis tyrimas parodė, sumažėjo išraiška beta-kateninai tiek labai metastazavusiu ląstelių linijų, palyginti su tėvų kolega HSC-58. Tačiau tiek Vakarų dėmė ir KRL-PGR analizė neparodė žymų pokytį ekspresijos lygio beta-kateninai ir taip pat β-kateninai varomas promotoriaus veiklos tarp labai metastazavusiu 58As1 ląstelių ir jos dviejų NDRG1 engiamų ląstelių linijų. Atrodo mažiau tikėtina, kad β-kateninai vaidina svarbų vaidmenį malšinant metastazių pagal NDRG1 triuškinantis į labai metastazavusiu vėžinių ląstelių.

Kita vertus GSK-3β taip pat žinoma, vaidina vaidmenį kontrolės EMT [20], [21], o GSK-3β yra esminis fermentas už NDRG1, puikus substate GSK-3β [22] fosforilinimo, [23]. P-GSK3β išraiška buvo santykinai didesnės labai metastazavusiu ląstelių linijų, nei jų tėvų ląstelių linijos (2b pav.) Gydymas kuris stipriai slopina GSK-3β lėmė nutylėtų išraiškos p NDRG1, lydimas ląstelę E-cad ir beta-kateninai (5d pav). Tačiau ten buvo beveik jokio skirtumo išraiška GSK-3β ir p-GSK-3β iki NDRG1 triuškinantis į labai metastazavusiu ląstelių (4b paveikslas), o tai rodo, kad GSK-3β negali vaidinti svarbų vaidmenį EMT indukcijos per NDRG1 skrandžio vėžio ląsteles.

sraigė yra atstovas transkripcijos faktorius, kuris kontroliuoja išraišką E-cad [20]. Iš įvairių reguliavimo veiksnių, transkripciškai kontroliuoti E-cad, išraiška sraigė buvo specialiai moduliuoti NDRG1 skrandžio vėžio ląstelių linijų, naudojamų šiame tyrime. Sraigė nokdaunas sukeltas ląstelę E-cad (5a pav) ir egzogeninės tarnsfection iš sraigė kDNR slopino El cad promotoriaus aktyvumą (5b pav.)

labai skrandžio vėžiui ląstelių linijų, išraiška sraigė buvo aktyvinama kaip palyginti nedidelės jų metastazavusio atitikmens, SSK-58 (2A pav B). Abu NDRG1 nutildytų ląstelių linijas, AS1 /Sic50 ir AS1 /Sic54 parodė, sumažėjo išraišką iš sraigė, palyginti su jų labai metastazavusiu kolega AS1 /Mock3 (4b paveikslas, C). Be to, e-cad rengėjas veikla buvo smarkiai skatino tiek NDRG1 nutildė ląstelių linijas, palyginti su jų labai metastazavusiu kolega (5c pav.)

Taigi, NDRG1 nokdaunas paskatino E-cad ir downregulation iš vimentin ląstelę ir sraigė, ir slopino invazija, metastazių ir kaupimą ascitas kurį labai skrandžio vėžiui ląstelių. Tai NDRG1 tarpininkaujant reguliavimas E-cad ir /arba vimentin išraiška įtakos epitelinio mezenchimos perėjimo skrandžio vėžio ląsteles. , atrodo, tai NDRG1 sukeltas modifikacija EMT turi būti bent iš dalies priskirtinas transkripcijos faktoriaus sraigės. NDRG1, jos glaudžiai kontekste EMT susijusių genų, gali dalyvauti aukšto metastazavusiu potencialo įsigijimo progresyvių skrandžio vėžio ląsteles.

Medžiagos ir metodai

Medžiagos ir ląstelių linijų

SAK-58 buvo sukurtas žmogaus Tarpikliai skrandžio karcinoma ir 58As1 ir 58As9 buvo nepriklausomai nustatyti pakartotinio orthotopic implantacijos SAK-58 ląstelių į skrandžio sienelės athymic pelių, kaip aprašyta anksčiau [5], [6]. AS1 /Sic50 ir AS1 /Sic54 ląstelės buvo nustatyta stabili transfekciją NDRG1 shRNR į 58As1 ląsteles. Visi ląstelių linijos ir buvo išlaikytos RPMI-1640 terpėje, papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS). BxPC-3, žmogaus kasos vėžio ląstelių linijas, buvo gauta iš amerikiečių tipas kultūros kolekcija (Manassas, VA). Anti-NDRG1 antikūnas buvo sukurtas kaip buvo aprašyta anksčiau [34]. Kitos antikūnai buvo įsigyti taip: Anti-β-aktino antikūnų ir anti-sraigė antikūnų buvo iš Abcam; prieš β-kateninai antikūnų anti-β-kateninai (SER 33/37), anti-β-kateninai (SER 552), Anti-WNT, Anti-Ki-67, prieš-GSK-3β antikūnų anti-EGFR, anti-GAPDH antikūnas, anti-p-GSK-3β antikūnas, anti-ERK1 /2 antikūnas anti-p-ERK1 /2 antikūnas, anti-AKT antikūnas, anti-p-AKT antikūnas buvo iš ląstelių signalizavimo technologijos; prieš vimentin antikūnų buvo iš CalBiochem; Anti-E-cad antikūnų buvo iš BD. CT99021 buvo įsigytas iš AXON Medchem BV (Nyderlandai).

genų ekspresijos Mikrogardelių

Papildoma RNR buvo papildyta, paženklinti, ir kryžminosi prie 44k Agilent 60-mer oligomicroarray pagal gamintojo nurodymus (Agilent technologijos). Visi hibridizavosi mikrogardeliq skaidres nuskaityta kurį Agilent skenerio. Santykiniai hibridizacijos intensyvumas ir fono hibridizacijos vertės apskaičiuotos naudojant "Agilent požymių išskyrimas programinę įrangą. Norėdami nustatyti aukštyn arba žemyn reguliuojamų genų, mes apskaičiavome santykis (ne prisijunkite išaugtų sulankstomomis pokyčiai) iš normalizuotų signalo intensyvumo kiekvieno zondo palyginimui tarp kontrolės ir eksperimentinių pavyzdžių. tada mes sukūrėme kriterijus reguliuojamų genų: iki reguliuojamų genų, santykis ≥2 kartus; žemyn reguliuoja genų, santykis ≤0.5.

konstruktą NDRG1 shRNR ir steigimas NDRG1 triuškinantis ląstelių linijų

Norėdami gauti žmogiškai U6 siRNR vektorius remiantis pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA), žmogaus U6 rengėjas (kurių sudėtyje yra Hind
III ir Bam
HI klonavimo vietas) buvo papildytas iš žmogaus genomo DNR pradmenų pora 5'-AGATCTGAATTCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGC ir 5'-AGATCTAAGCTTCTCGAGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAG ir susiūta į BGL
II svetainėje pcDNA3. Dalinės DNR fragmentai žmogaus NDRG1 DNR buvo chemiškai susintetinti ir klonuotas į pcDNA3-hU6siRNA suskaldyti su Hind pervežimas III ir Bam
HI gaminti pcDNA3shNDRG1. Susintetintas DNR už pcDNA3shNDRG1 buvo: 5'-GATCCGCGTGAACCCTTGTGCGGAATTCAAGAGATTCCGCACAAGGGTTCACGTTTTTTGGAAA ir: 5'-AGCTTTTCCAAAAAACGTGAACCCTTGTGCGGAATCTCTTGAATTCCGCACAAGGGTTCACGCG. Sraigė kDNR buvo paruoštas kaip aprašyta anksčiau [35]. Sraigė kDNR buvo susiūta į pcDNA3 (pcDNA3-sraigė). Ląstelės buvo pernešta su pcDNA3shNDRG1 arba pcDNA3-sraigė naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Po gamintojo protokolu. Stabilus Transfekuoti klonai buvo nustatytas G418 pasirinkimą.

transfekciją sirnr

siRNA atitinkantis nukleotidų sekas sraigė ir beta-kateninai buvo perkamos iš Invitrogen (Carlsbad, CA), atitinkamai, siRNA dupleksus buvo tranfected naudojant Lipofectamine RNAiMAX ir OPTI-MEM terpe (Invitrogen) pagal gamybos rekomendaciją.

liuciferazės Analizės

Norėdami gauti e-cad-Luc vektorių, E-cadhein rengėjas (-262 iki +120) buvo amplifikuotas naudojant šiuos pradmenų poros: 5'-AGATCTTAGTGAGCCACCGGCGGGGC-3 'ir 5'-AAGCTTGGCCGGGGACGCCGAGCGAGGG-3'. Pabrėžia nurodyti restrikcijos fermentas skilimo svetainėse. Papildyta fragmentas buvo susiūta į pGEM-T yra lengva vektoriaus (Promega) ir perkelti į pGL3 bazinis vektorius (Promega) į BglII ir Hind III svetainėse. El cad-Luc ir pcDNA3-sraigė buvo pernešta naudojant Lipofectamine LTX ir OPTI-MEM terpe (Invitrogen) pagal gamybos rekomendaciją. Po 24 val, liuciferazės aktyvumas buvo matuojamas pagal gamintojo nurodymus (PROMEGA). Be to, mes taip pat išnagrinėjo liuciferazės veiklą orientuotus beta-kateninai naudojant TopFlash reporteris vektorių taip, kaip aprašyta anksčiau [18].

Minkštas Agaras kolonijas sudarančių Analizės

4 × 10 ^{3 ląstelės buvo padengtas 1 ml kultūros terpėje, turinčioje 0.36% (w /v) iš viršaus agarą, sluoksniais per bazinio sluoksnio 0.72% (w /v) agaro 6-duobučių lėkštelėse ir leidžiama augti 3-4 savaičių. Kolonijos buvo fotografuotas ir skaičiuojami dešimčiai atsitiktinių matymo laukais ne 50x priartinimas naudojant šviesos mikroskopu. Kiekvienas eksperimentas buvo atliekamas tris kartus.}

Vakarų dėmė analizė ir frakcionuojant branduolio ir citoplazmos

Ląstelės buvo lizuoti buferyje, kurio sudėtyje yra 50 mM Tris-HCl, 350 mm NaCl 0,1% NP40, 5 mm EDTA, 50 mM NaF, 1 mM fenilmetilsulfonilfluoridą fluorido, 10 mikrogramų /ml aprotinino, 10 mikrogramų /ml leupeptiną, ir 1 mM Na3VO4. Iš viso ląstelių fragmentai buvo tiriami SDS-PAGE ir Lik ant Immobilon membranomis (Millipore Corp Bedford, MA), kaip aprašyta anksčiau [24], [25]. Parengti citozolyje ir branduolinės frakcija, ląstelės buvo lizuoti į bufferA (10 mm Hepes, pH 7,9 ir 10 mm KCl, 10 mM EDTA, 1 mM DDT, 0,4% IGEPAL ir proteazių inhibitorių) ir inkubuojama 20 min ant ledo. Po centrifugavimo (3 minutės, 5000 apsisukimų per minutę) supernatantas buvo naudojamas kaip citoplazminio frakciją. Gautos granulės buvo resuspenduotos bufferB (20 mM Hepes, pH 7,9, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glicerolio, 1 mM DTT ir proteazės inhibitorių) ir inkubuojami ant 2 val nepertraukiamai maišydami, esant 4 ° C temperatūroje. Po centrifugavimo (5 minutės, 15000 apsisukimų per minutę) supernatantas buvo naudojamas kaip branduolinės frakciją.

• PLoS ONE: ekspresijos kamieninių ląstelių susijusių genų neoadjuvantu apdorotų skrandžio vėžys A NOTCH2, GSK3B ir β-kateninai Genų Parašas prognozuoja Survival
• PLoS ONE: vaidmuo kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) ir VEGF-R genotipo į Guiding metastazėms procesą į pT4a rezekcijos skrandžio vėžys Patients