PLoS ONE: N-myc Downstream Gereglementeerde Gene 1 (NDRG1) Bevordert metastase van Human scirrhous maagkanker cellen door epitheliale-mesenchymale Transition

Abstract

Onze recente studie toonde aan dat hogere expressie van N-myc neerwaarts gereguleerd gen 1 ( NDRG1) is nauw gecorreleerd met slechte prognose bij maagkankerpatiënten. In deze studie hebben we gevraagd of NDRG1 heeft centrale rol in maligne progressie inclusief metastase van maagkanker cellen. Door genexpressie microarray-analyse expressie van NDRG1 toonde de hogere stijging bij een totaal van 3691 up-gereguleerde genen in een sterk uitgezaaide maagkanker cellijn (58As1) dan hun ouderlijke lage metastatische tegenhanger (HSC-58). De zeer metastatische cellijnen vertoonden verminderde expressie van E-cadherine, samen met een verhoogde expressie van vimentine en Slak. Deze verminderde expressie van E-cadherine werd gerestaureerd door Snail knock-down in zeer metastatische cellijnen. We naast gevestigde stabiele NDRG1 knockdown cellijnen (As1 /Sic50 en As1 /Sic54) van de zeer metastatische cellijn, en beide van deze cellijnen vertoonden verhoogde expressie van E-cadherine en verminderde expressie van vimentine en Slak. Ook, E-cadherine-promoter gedreven luciferaseactiviteit bleek te verhogen met NDRG1 knockdown in de zeer metastatische cellijn. NDRG1 knock-down in maagkanker cel toonde onderdrukt invasie van kankercellen in surround weefsels, onderdrukt metastase naar het buikvlies en een verminderde ascites accumulatie in muizen met aanzienlijk verbeterde overlevingskansen. Dit is de eerste studie om aan te tonen dat NDRG1 speelt een centrale rol in de maligne progressie van maagkanker door middel van epitheliale mesenchymale transitie

Visum:. Ureshino H, Murakami Y, Watari K, Izumi H, Kawahara A, Kage M , et al. (2012) N-myc Downstream Gereglementeerde Gene 1 (NDRG1) Bevordert metastase van Human scirrhous maagkanker cellen door epitheliale-mesenchymale transitie. PLoS ONE 7 (7): e41312. doi: 10.1371 /journal.pone.0041312

Editor: Rakesh K. Srivastava, de Universiteit van Kansas Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 8 december 2011; Aanvaard: 22 juni 2012; Gepubliceerd: 23 juli 2012

Copyright: © 2012 Ureshino et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd gesteund door een subsidie-in-steun voor Cancer Research van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan (tot Dr. Ono), en door de 3rd Term Uitgebreide controle Research for Cancer van het ministerie van Volksgezondheid, arbeid en Welzijn van Japan (Dr. Kuwano). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is een van de meest voorkomende kwaadaardige tumoren in Japan en andere Aziatische landen. De patiënt prognose scirrhous maagcarcinoom is bijzonder slecht. Scirrhous maagcarcinoom gaat vaak gepaard met peritoneale verspreiding en verspreiding naar de lymfeklieren en lever, wat ernstige problemen die moeten worden bestuurd zijn. Genexpressieprofiel geopenbaard gen amplificaties van K-sam en c-Met in 30-40% van scirrhous maagkanker, en dat de overexpressie van verschillende groeifactoren, zoals transformerende groeifactor-β (TGF-β), platelet-derived growth factor (PDGF), insulineachtige groeifactor (IGF) en fibroblast groeifactor-2 (FGF-2) [1]. Recent DNA microarray analyse toonde aan specifieke opregulatie van verschillende genen, waaronder SPARC
, RGEIII
, S100A10
, en collageen type I [2] - [4].

Diermodellen dat de kenmerken van kankerachtige peritonitis en verspreiding naar het peritoneum weerspiegelen belangrijk inzicht in de ontwikkeling van kwaadaardige progressie van maagkanker. Yanagihara et al.
[5] voor het eerst vastgesteld de HSC-58 cellijn uit menselijke scirrhous maagkanker, en vervolgens opgericht twee sublijnen, 58As1 en 58As9, met een hoog potentieel voor peritoneale verspreiding en lymfeklieren metastase door herhaalde orthotope inoculatie van HSC-58 cellen in de maagwand van athymische muizen [6], [7]. Deze sublijnen veroorzaken vaak ophoping van ascites na orthotope implantatie en vertonen verhoogde expressie van genen die coderen voor proteasen en eiwitten betrokken bij celadhesie, celmotiliteit, proliferatie en angiogenese [6]. Zij selectief groeien ook in de maag submucosa en binnenvallen diepere laag aan de serosale vlak van de maag [7] bereiken. Het blijft echter onduidelijk waarom ze een dergelijk hoog potentieel voor metastasen tijdens de selectie hebben verworven.

In onze huidige studie, gebruikten we deze zeer metastatische cellijnen te onderzoeken hoe menselijke maagkanker cellen metastatische potentieel zou kunnen verwerven. We hebben eerst vergeleken genexpressie profielen tussen sterk uitgezaaide en lage metastatische ouderlijke cellijnen door middel van microarray-analyse. We gericht op een gen genaamd N-myc stroomafwaartse gereguleerde gen 1 (NDRG1) omdat bleek niet sterk opgereguleerd in de zeer metastatische maagkanker cellijnen in vergelijking met hun tegenhanger cellen. Ook werd eerder gemeld dat expressie NDRG1 een voorspellende marker voor maligne progressie en een slechte prognose bij patiënten gastrische [8]. Consistent met deze studie hebben we vastgesteld dat hoge NDRG1 expressie was significant gecorreleerd met tumor angiogenese en maligne progressie met slechte prognose bij maagkanker [9]. Wij ook gemeld dat NDRG1 knockdown induceert verlaagde productie van krachtige angiogene factoren en tumorangiogenese door longkankercellen, en dat NDRG1 een voorspellende marker voor tumorangiogenese en slechte prognose bij patiënten zonder-kleincellige longkanker [10]. NDRG1, één van de vier NDRG familie genen, blijkt dus diverse functies [11] en NDRG1 functioneert of als metastase suppressor of oncogene en maligne promoter, afhankelijk tumortypen [11], [12]. Bovendien is expressie van NDRG1 gen streng geregeld N-Myc en verwante Myc Eiwitten [13] en overexpressie van c-Myc geïnduceerde epitheliale mesenchymale transitie (EMT) in mammaire epitheelcellen [14]. De belangrijke rol van EMT wordt vaak genoemd in de nauwe context van de ontwikkeling en progressie van de tumor, waaronder kanker metastase [15], [16]. Maar in deze studies werd de regulerende rol van NDRG1 niet onderzocht. In onze huidige studie hebben we onderzoek gedaan naar de metastatische potentieel van maagkanker cellen door zijn correlatie met EMT-gebaseerde rol van NDRG1.

Resultaten

Vergelijking van celgroei, Cell morfologie, tumorgroei, Verspreiding en genexpressieprofielen tussen Highly gemetastaseerde maagkanker cellijnen en hun lage gemetastaseerde Counterpart

In overeenstemming met eerdere studies [6], [7], de zeer uitgezaaide kanker cellijnen 58As1 en 58As9 werden hogere groeicijfers dan hun ouderlijke tegenhanger, HSC-58, met een verdubbeling tijden van 23-26 uur, vergeleken met 30 uur voor de ouderlijke cellen (Figuur 1A). 58As1 cellen gemakkelijk los en liet suspensie-type celgroei met ronde morfologie, terwijl HSC-58 en 58As9 cellen werden gevoegd en liet gelaagde celgroei met een fibroblastische morfologie (figuur 1B). Zowel 58As1 en 58As9 cellen vertoonden veel hogere tumorgroei tarieven in een subcutane xenograft model in vergelijking met de ouders HSC-58-cellen (figuur 1C). Eerdere studies toonden aan dat de orthotope transplantatie van 58As1 cellen induceerde veel hogere peritoneale verspreiding en ascites ophoping dan die van HSC-cellen 58 [6], [7]. We verder bevestigd de peritoneale verspreiding van de cellen door implanteren in de peritoneale holte van muizen. Muizen geïmplanteerd met 58As1 cellen vertoonden de verschijning van een gemiddelde van 8 ± 3 toegankelijk knobbels in het mesenterium van elke muis en ophoping van ascites (variërend 0,7-2,5 ml /muis) (figuur 1D, E). Daarentegen muizen geïmplanteerd met ouderlijke HSC-58 cellen toonde de vorming van weinig of geen kleine knobbeltjes, en zonder duidelijke accumulatie van ascites.

We volgende vergelijking genexpressieprofielen tussen 58As1 cellen en hun ouderlijke tegenhanger, HSC- 58, met behulp van DNA microarray-analyse. Van de 41.000 RNA transcripten en varianten, identificeerden we 3691 differentieel tot expressie gebrachte genen die werden opgereguleerd tot 2-voudig en 3536 genen die neerwaarts gereguleerd werden tot 0,5-voudig of minder 58As1 cellen vergeleken met HSC-58 cellen. Figuur 1F gepresenteerd genen die differentieel tot expressie gebracht in 58As1 cellen vergeleken met HSC-58 cellen, beperkt tot die welke behoren tot de familie NDRG en genen betrokken bij metastase, zoals matrix metalloproteïnasen (MMPs) /cathepsines, adhesie en epitheliale-mesenchymale transitie ( EMT). Van de vier genen in de familie NDRG [17], de expressie van NDRG1 en NDRG4 werd opgereguleerd in de zeer metastatische cellijn (58As1) in vergelijking met de ouderlijke cellijn (HSC-58). De expressie van EMT-gerelateerde genen in 58As1 cellen werd vooral beïnvloed door het verkrijgen van een hoog metastatisch vermogen. De expressie van epitheel-specifieke genen, met inbegrip van E-cadherine ( CDH1
), P-cadherine ( CDH3
) en β-catenine ( CTNNB1
), werd neerwaarts gereguleerd . Daarentegen alleen MMP1 ( MMP1
) expressie werd duidelijk opgereguleerd; de expressie van cathepsine L ( CTSL1
) werd verhoogd, maar die van cathepsine B ( CTSB
) niet. De expressie van mesenchym-specifieke genen, vimentine ( VIM
) en Slak ( SNAI1
), een belangrijke transcriptiefactor voor de onderdrukking van E-cadherine, werd opgereguleerd.

Enhanced NDRG1 Gene Expression Sterk gemetastaseerde maagkanker cellijnen

We verder ten opzichte van het eiwit expressie van verschillende genen in HSC-58, 58As1 en 58As9 cellen (Figuur 2A). De expressie van NDRG1 werd aanzienlijk vergroot en die van vimentine, slak, p-ERK1 /2, p-Akt en p-GSK-3β was eveneens verhoogd in zowel 58As1 en 58As9 cellen vergeleken met HSC-58 cellen. Er was geen duidelijke expressie van Wnt3a en Wnt5a in deze cellijnen (data niet getoond). Daarentegen namen wij verminderde expressie van E-cadherine en β-catenine in 58As1 en 58As9 cellen vergeleken met HSC-58-cellen (Figuur 2A). Fosforylering van β-catenine Ser33 /37 en Ser552 bleek veel minder 58As1 en 58As9 dan HSC58 zijn. Consistent met de eiwitexpressie niveaus mRNA expressieniveaus van NDRG1, vimentine, Slak en MMP-1 waren hoger in zowel zeer metastatische cellijnen dan hun ouders tegenhanger (figuur 2B). Er was veel minder mRNA expressie van E-cadherine en β-catenine in zowel 58As1 en 58As9 dan HSC-58.

immunocytochemische analyse bleek dat de lokalisatie van E-cadherine zowel cytoplasma membraan en β-catenine was voornamelijk gelokaliseerd in cytoplasma in zowel HSC-58 en 58As9 cellen (Figuur 2C). Immunocytochemische analyse voor 58As1 kon niet worden uitgevoerd zoals 58As1 groeit in suspensie. Bovendien expressie van β-catenine relatief lager in zowel het cytoplasma en de kern, maar dat van Snail werd gevonden veel hoger kern van 58As1 en 58As9 dan HSC-58 (figuur 2D). We onderzochten ook E-cadherine promoteractiviteit (figuur 2E) en β-catenine geïnduceerde reporter-activiteit door TopFlash reporter assay (figuur 2F) en vonden dat er significante afname van de luciferaseactiviteit aangedreven door E-cadherine-promoter en door β-catenine in zowel 58As1 en 58As9 vergelijking met HSC-58, in overeenstemming met mRNA niveaus van beide genen.

NDRG1 Knockdown Veroorzaakt de opregulatie van E-cadherine en de negatieve regulatie van Vimentin en Slak in Highly uitgezaaide cellen

We volgende onderzocht of NDRG1 knock-down met name invloed op de expressie van EMT-gerelateerde genen in de zeer metastatische cellijn, 58As1. We opgericht twee stabiele NDRG1 knockdown celklonen, As1 /Sic50 en As1 /Sic54 door transfecteren NDRG1 shRNA in 58As1 cellen. Beide As1 /Sic50 en As1 /Sic54 cellen toonde vergelijkbare groeicijfers aan elkaar en hun ouderlijke tegenhanger As1 /Mock3, met een verdubbeling tijden van 25-27 uur in de cultuur (figuur 3A). Beide NDRG1 zwijgen opgelegd cellijnen toonde strakke hechting van cellen aan de cultuur schotel en fibroblast morfologie, terwijl As1 /Mock3 cellen vertoonden een suspensie-type celgroei met ronde celmorfologie (Figuur 3B). We vervolgens onderzocht het effect van NDRG1 silencing op tumorontwikkeling van 58As1 cellen met een verankering-onafhankelijke groei assay. Beide NDRG1 zwijgen cellijnen significante vermindering van hun verankering-onafhankelijke groei, zoals aangegeven door aantal kolonies in zachte agar ( ^{* p <
0,01). (Figuur 3C)}

Dan we vergeleken de genexpressieprofielen tussen As1 /Mock3 en As1 /Sic50 cellen met behulp van DNA microarray-analyse (Figuur 4A). NDRG1 knock-down resulteerde in een verhoogde expressie van het E-cadherine ( CDH1
) en P-cadherine ( CDH3
), maar verminderde expressie van de vimentine ( VIM
) en Slak ( SNAI1
). We vervolgens uitgevoerd western blot en qRT-RCR analyses voor meerdere moleculen die door NDRG1 knockdown werden gedifferentieerd in het microarray analyse (Figuur 4B, C). Deze twee cellijnen vertoonden veel lagere expressie van zowel NDRG1 mRNA en eiwit in vergelijking met de As1 /Mock3 cellen. Verhoogde expressie van E-cadherine werd consistent waargenomen in As1 /Sic50 en As1 /Sic54 cellen in vergelijking met As1 /Mock3 cellen door western blot analyse. In As1 /Sic50 en As1 /Sic54 cellen, zowel western blot en qRT-PCR-analyses bevestigde verminderde expressie van vimentine en Slak zonder dat de expressie van p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-Akt, Akt, p-GSK-3β en GSK-3β (Figuur 4B, C).

anderzijds, NDRG1 is bekend bij metastase en celproliferatie te onderdrukken door prostaat- en darmkanker cellen. Recente studies hebben aangetoond dat NDRG1 moduleert Wnt-β-catenine signaleringsroute met verhoogde expressie van E-cadherine in humane prostaat- en darmkanker cellen [18], [19]. Echter, NDRG1 knockdown in 58As1 cellen laat de β-catenine expressie zowel eiwit en mRNA-niveau (Figuur 4B, C). En ook β-catenine gedreven promotor activiteit met TopFlash reporter assay bleek geen verschil in de promotor activiteit tussen As1 /Mock en NDRG1 tot zwijgen cellijnen. Daarom werd β-catenine expressie niet beïnvloed door NDRG1 knockdown. NDRG1 dus knockdown consequent verhoogde expressie van E-cadherine en verlaagde expressie van Snail en vimentine in de zeer metastatische cellijn. Er was echter geen duidelijke verandering in de expressie van β-catenine door NDRG1 knockdown.

Enhanced E-cadherine promoteractiviteit door NDRG1 Knockdown tot Slak in Gastric kankercellen

Of verschillende transcriptiefactoren die onderdrukken expressie van E-cadherine waaronder Slak, Slug, Twist, TCF4 en SIP1 [20], expressie van Snail werd speciaal gemoduleerd door NDRG1 bij maagkanker cellen. We onderzocht of expressie van E-cadherine en /of vimentine kunnen worden geregeld door Slak in HSC-58 cellen. Voorbijgaande behandeling met Snail siRNA resulteerde in verhoogde expressie van E-cadherine, maar niet dat van vimentine en NDRG1, tijd-afhankelijke wijze (Figuur 5A). Er was slechts een geringe of geen toename van β-catenine expressie van Snail knockdown. Voorts werd E-cadherine-promoter gedreven luciferaseactiviteit significant onderdrukt door transfectie van Snail complementaire DNA in twee kankercellijnen getest (Figuur 5B). We volgende vergelijking E-cadherine-promoter activiteit tussen As1 /Mock3 en zijn NDRG1 tot zwijgen cellijnen. Zoals blijkt uit figuur 5C, was significant (* p
< 0,05) verhoging van E-cadherine promoteractiviteit door NDRG1 knockdown

GSK-3β is een sleutelenzym voor activering van EMT. pathway [20], [21], en ook fosforylering van NDRG1 [22], [23]. Expressie van p-GSK-3β werd verhoogd in de zeer metastatische cellijn, 58As1 (zie Figuur 2A). We onderzocht of GSK-3β was betrokken bij NDRG1 geïnduceerde veranderde expressie van E-cadherine en vimentine. Behandeling met een remmer (CT99021) van GSK-3β leidt tot een verminderde expressie van p-NDRG1 en p-GSK-3β, alsook verhoogde expressie van E-cadherine en β-catenine in 58As1 cellen (figuur 5D). Zoals getoond in figuur 5E leverde β-catenine knockdown laat expressie van E-cadherine, vimentine en slak.

NDRG1 Knockdown Veroorzaakt Epitheliale Mesenchymale Transitie en onderdrukt Metastase het peritoneum door zeer Cellen Gemetastaseerde maagkanker

Het vergelijken van tumorgroei tarieven van As1 /Mock3, As1 /Sic50 en As1 /Sic54 cellen in een xenograft model onthuld langzamere tumorgroei tarieven van beide As1 /Sic50 en As1 /Sic54 door NDRG1 knock-down (Figuur 6A, B). NDRG1 knockdown onderdrukte de lokale invasie van As1 /Mock3 tumorcellen in het omliggende stroma en aangrenzende vet- en /of spierweefsel, en ingekapselde tumorgroei (figuur 6C). Hoge expressie van E-cadherine werd waargenomen in As1 /Sic50 en As1 /Sic54 tumoren, terwijl hoge expressie van vimentine in kankercellen van As1 /Mock3 tumoren (figuur 6D) waargenomen. Daarentegen was er bijna geen verandering in de expressie van β-catenine in As1 /Sic50 en As1 /Sic54 tumoren in vergelijking met As1 /Mock3 tumor.

Om te onderzoeken of NDRG1 knock-down van invloed kunnen zijn uitzaaiingen naar het buikvlies en accumulatie van ascites, vergeleken we de metastatische potentieel van As1 /Sic50 en As1 /Mock3 cellen na orthotope transplantatie. Figuur 7A toont representatieve beelden van de uitgebreide buikholte en de aanwezigheid van kanker knobbeltjes in het buikvlies. Na inoculatie van orthotope As1 /Sic50 cellen, het aantal knobbeltjes die in het peritoneum was ongeveer 30% lager dan die welke uit As1 /Mock3 cellen, maar deze daling was niet statistisch significant ( p
= 0,21) (Figuur 7B). Echter knobbeltjes die voortvloeien uit As1 /Sic50 cellen vertoonden veel kleinere maten dan die uit As1 /Mock3 cellen (Figuur 7A). De ophoping van ascites door As1 /Sic50 cellen significant (* p < 0,01) daalde tot ongeveer 10% van die geïnduceerd door As1 /Mock3 cellen (figuur 7C). Bovendien was er een significant (* p
< 0,01) verhoging van het overlevingspercentage van muizen geïnoculeerd met As1 /Sic50 cellen (51 ± 16 dagen) in vergelijking met 35 ± 14 dagen voor muizen geïnoculeerd met As1 /Mock3 cellen, wat aangeeft dat NDRG1 knockdown overleving verlengt (Figuur 7D).

Discussie

We hebben eerder gemeld dat NDRG1 nauw gecorreleerd met tumor angiogenese en slechte overleving bij patiënten met maagkanker, wat suggereert dat NDRG1 is een voorspellend biomarker voor maligne progressie van maagkanker [9]. Aanbevolen huidige studie namen wij waar de volgende eigenschappen grondslag liggen aan de verwerving van een hoog metastatisch potentieel bij maagkanker: microarray, western blot en RT-PCR analyses samen geopenbaard opregulatie van NDRG1 in de zeer metastatische cellijnen, 58As1 en 58As9, vergeleken met hun lage metastatische ouderlijke tegenhanger, HSC-58; hogere expressie van vimentine, slak, en MMP-1, en lagere expressie van E-cadherine en β-catenine waren duidelijk in de zeer metastatische cellijnen in vergelijking met hun ouderlijke counterpart; van de genen neerwaarts gereguleerd in de zeer metastatische cellijn NDRG1 knockdown geleid opregulatie van E-cadherine en downregulatie van vimentine en slak, maar vrijwel geen effect op de expressie van β-catenine; E-cadherine promotoractiviteit was significant verhoogd met NDRG1 knockdown; NDRG1 knock-down ook onderdrukt peritoneale verspreiding en accumulatie van ascites, en de invasie van zeer uitgezaaide cellen in omringende normale weefsels.

In de huidige studie, NDRG1 knock-down resulteerde in de onderdrukking van metastase door zeer uitgezaaide maagkanker cellen (Figuur 6 , 7), wat suggereert dat NDRG1 mogelijk een metastase promoter gen in plaats van een metastase suppressor gen bij maagkanker is. Onze huidige studie steunt het idee dat de vraag of NDRG1 bevordert of onderdrukt de maligne progressie van kanker bij de mens is afhankelijk van tumortypen en /of differentiatie status [11], [12]. Het blijft echter onduidelijk waarom NDRG1 functioneert als tumor suppressor of promotor afhankelijk van tumor types of histologische types. Onze eerdere studie toonde aan dat NDRG1 onderdrukt tumorgroei en angiogenese van alvleesklierkanker door middel NDRG1 aangedreven verzwakking van NF-kB signaling pathway [24], [25]. Recent onderzoek heeft gemeld dat de expressie van metastase suppressor gen, KAI1
gen is betrokken bij NDRG1 bemiddelde metastase onderdrukking van prostaatkanker door middel van ATF3-NF-kB route [26]. Nader onderzoek is nodig om te begrijpen welke reguleringsmechanisme is specifiek verantwoordelijk is voor NDRG1 gedreven bevordering van maligne progressie van maagkanker cellen.

EMT is een recent hoogtepunt die nauw geassocieerd kan worden met kanker maligne progressie waaronder verwerven van zeer metastatische potentieel [15], [16]. In onze huidige studie, NDRG1 knockdown verhoogde de expressie van E-cadherine en onderdrukt de expressie van vimentine zowel In vitro Kopen en In vivo
. NDRG1 kan een sleutelrol bij de overgang van een gepolariseerde epitheliale fenotype spelen een zeer beweeglijke mesenchymale fenotype. Gedeeltelijk of volledig verlies van E-cadherine wordt vaak waargenomen tijdens de progressie richting maligniteit in vele tumoren, waaronder maagkanker [27], [28]. Oliveira et al. [29] meldde een nauw verband tussen E-cadherine verlies en een hoog metastatisch potentieel bij maagkanker. Chan et al. [30] ook gemeld oplosbare E-cadherine als biomarker voor verlengde overleving van maagkankerpatiënten. NDRG1 knock-down resulteerde in relatief hogere E-cadherine in As1 /Sic50 tumoren dan in As1 /Mock3 tumoren, wat suggereert dat NDRG1 specifiek de EMT kan besturen eventueel via de transcriptiefactor Snail door maagkanker cellen (Figuur 7E).

Wnt signalering centrale rol in de kwaadaardige progressie en metastase door longkanker en borstkanker cellen [31], [32] en Wnt signalering induceert ook EMT die metastatische progressie van epitheliale kanker [31] omvat, [33]. NDRG1 is bekend als een metastase suppressor gen in de prostaat en colorectale kankercellijnen [11], [12]. Liu et al [18] heeft gemeld dat NDRG1 metastase onderdrukt door middel Wnt /β-catenine signaleringsroute in prostaatkankercellen. Een relevante studie van Chen et al [19] heeft ook aangetoond dat NDRG1 moduleert-TGF-β geïnduceerde EMT tot veranderde expressie van β-catenine en E-cadherine in colorectale kankercellijnen. De onderhavige studie toonde verminderde expressie van β-catenine in zowel zeer metastatische cellijnen vergelijking met de oorspronkelijke tegenhanger, HSC-58. Echter, zowel western blot en qRT-PCR analyses toonden geen duidelijke verandering in expressie van β-catenine en ook β-catenine gedreven promotor activiteit tussen zeer metastatische 58As1 cellen en de twee NDRG1 zwijgen opgelegd cellijnen. Lijkt het minder waarschijnlijk dat β-catenine een sleutelrol bij onderdrukking van metastase door NDRG1 knockdown in sterk uitgezaaide kankercellen speelt.

Anderzijds, is GSK-3β ook bekend om een ​​rol te spelen bij de controle van EMT [20], [21] en GSK-3β is een enzym voor de fosforylering van NDRG1, een uitstekende subtoestand van GSK-3β [22], [23]. De expressie van p-GSK3ß relatief hoger in de zeer metastatische cellijnen dan hun ouderlijke cellijn (Figuur 2B). Behandeling met een sterke remmer van GSK-3β resulteerde in een onderdrukte expressie p-NDRG1, begeleid door opregulatie van E-cadherine en β-catenine (figuur 5D). Er was echter bijna geen verschil in expressie van GSK-3β en p-GSK-3β door NDRG1 knockdown in de zeer metastatische cellen (Figuur 4B), hetgeen suggereert dat GSK-3β geen belangrijke rol kunnen spelen bij de inductie van EMT tot NDRG1 bij maagkanker cellen.

Snail is een representatieve transcriptiefactor die de expressie van E-cadherine [20] regelt. Van verschillende regulerende factoren die transcriptie controle E-cadherine, werd expressie van Snail specifiek gemoduleerd door NDRG1 bij maagkanker cellijnen gebruikt bij dit onderzoek. Slak knockdown geïnduceerde opregulatie van E-cadherine (Figuur 5A) en exogene tarnsfection van Snail-cDNA onderdrukte E-cadherine promoteractiviteit (figuur 5B).

In sterk uitgezaaide maagkanker cellijnen expressie van Snail werd opgereguleerd als in vergelijking met hun lage metastatische tegenhanger, HSC-58 (Figuur 2A, B). Beide NDRG1 zwijgen cellijnen As1 /Sic50 en As1 /Sic54 toonde verminderde expressie van Snail in vergelijking met de zeer metastatische tegenhanger, As1 /Mock3 (Figuur 4B, C). Voorts werd E-cadherine promoteractiviteit significant gestimuleerd zowel NDRG1 zwijgen cellijnen in vergelijking met hun zeer metastatische tegenhanger (figuur 5C).

Concluderend NDRG1 knockdown induceerde de opregulatie van E-cadherine en downregulatie van vimentine en Slak, en onderdrukt de invasie, metastase en accumulatie van ascites door de sterk uitgezaaide maagkanker cellen. Dit NDRG1 gemedieerde regulering van de E-cadherine en /of vimentine expressie beïnvloed epitheliale mesenchymale transitie van maagkanker cellen. Deze NDRG1 geïnduceerde modificatie van EMT lijkt ten minste gedeeltelijk worden toegeschreven aan de transcriptiefactor Snail is. NDRG1, in de nauwe samenhang met EMT-gerelateerde genen, kan deelnemen aan de verwerving van een hoge metastatische potentieel door progressieve maagkanker cellen.

Materialen en methoden

Materialen en cellijnen

HSC-58 werd vastgesteld uit menselijk scirrhous maagcarcinomen en 58As1 en 58As9 werden onafhankelijk vastgesteld door herhaalde orthotope implantatie van HSC-58 cellen in de maagwand van athymische muizen zoals eerder beschreven [5], [6]. AS1 /Sic50 en AS1 /Sic54 cellen werden vastgesteld door de stabiele transfectie van NDRG1 shRNA in 58As1 cellen. Alle cellijnen werden in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) gehouden. BxPC-3, een humane pancreatische kankercellijnen, werd verkregen van de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Anti-NDRG1 antilichaam werd gegenereerd zoals eerder beschreven [34]. Andere antilichamen werden als volgt gekocht: anti-β-actine antilichaam en anti-Snail -antilichamen van Abcam; anti β-catenine antilichaam, anti-β-catenine (ser 33/37), anti-β-catenine (ser 552), anti-Wnt, anti-Ki-67, anti-GSK-3β antilichaam, anti-EGFR antilichaam, anti-GAPDH antilichaam, anti-p-GSK-3β antilichaam, anti-ERK1 /2-antilichaam anti-p-ERK1 /2-antilichaam, anti-AKT-antilichaam, anti-p-AKT -antilichamen van Cell Signaling Technology; anti-vimentine antilichaam bij Calbiochem; anti-E-cadherine antilichaam van BD. CT99021 werd gekocht van Axon Medchem BV (Nederland).

Gene Expression Microarrays

Aanvullende RNA werd versterkt, gelabeld en gehybridiseerd met een 44K Agilent 60-mer oligomicroarray volgens de instructies van de fabrikant (Agilent Technologies). Alle microarray gehybridiseerd objectglaasjes werden gescand met een scanner Agilent. Relatieve hybridisatie-intensiteiten en achtergrond hybridisatie waarden werden berekend met behulp van Agilent Feature Extraction Software. Identificeren omhoog of omlaag-gereguleerde genen, we berekende ratio's (non-log schaal veelvoudveranderingen) vanaf het genormaliseerde signaal intensiteiten van elke probe voor vergelijking tussen controle en experimentele monsters. Vervolgens hebben we vastgesteld criteria voor gereguleerde genen: up-gereguleerde genen, verhouding ≥2-voudig; down-gereguleerde genen, verhouding ≤0.5.

Construct van NDRG1 shRNA en Oprichting van NDRG1 Knockdown cellijnen

Om de mens een U6 siRNA vector gebaseerd op pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) te verkrijgen, de humane U6 promoter (die Hind III en
Bam Hl
kloneringsplaatsen) werd geamplificeerd uit humaan genomisch DNA met het primerpaar 5'-AGATCTGAATTCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGC en 5'-AGATCTAAGCTTCTCGAGGATCCCGCGTCCTTTCCACAAGATATATAAACCCAAG en geligeerd in de Bgl
II plaats van pcDNA3. De gedeeltelijke DNA-fragmenten van menselijke NDRG1 DNA werden chemisch gesynthetiseerd en gekloneerd in pcDNA3-hU6siRNA gesplitst met Hind
III en Bam
HI om pcDNA3shNDRG1 te produceren. De gesynthetiseerde DNA's voor pcDNA3shNDRG1 waren: 5'-GATCCGCGTGAACCCTTGTGCGGAATTCAAGAGATTCCGCACAAGGGTTCACGTTTTTTGGAAA en: 5'-AGCTTTTCCAAAAAACGTGAACCCTTGTGCGGAATCTCTTGAATTCCGCACAAGGGTTCACGCG. De slak cDNA werd bereid zoals eerder [35] beschreven. Slak cDNA werd geligeerd in de pcDNA3 (pcDNA3-Snail). Cellen werden getransfecteerd met pcDNA3-pcDNA3shNDRG1 of slak met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) volgens het protocol van de fabrikant. Stabiel getransfecteerde klonen werden vastgesteld aan de hand G418 selectie.

Transfectie van kleine interfererende RNA

SiRNA overeenkomt met sequenties van Snail en β-catenine werden aangekocht van Invitrogen (Carlsbad, CA), respectievelijk siRNA nucleotide duplexen werden getransfecteerd met gebruik van Lipofectamine RNAiMAX en Opti-MEM medium (Invitrogen) volgens de aanbeveling van de fabrikant.

Luciferase Assay

om E-cadherine-Luc vector, E-cadhein promotor te verkrijgen (-262 tot 120) werd geamplificeerd door PCR met de volgende primerparen: 5'AGATCTTAGTGAGCCACCGGCGGGGC-3 'en 5'- AAGCTTGGCCGGGGACGCCGAGCGAGGG-3'. Onderstreept geven restrictie-enzym splitsing sites. Het geamplificeerde fragment werd geligeerd in de pGEM-T Easy-vector (Promega) en overgebracht naar de pGL3-basis vector (Promega) in BglII en HindIII-plaatsen. E-cadherine-luc en pcDNA3-Snail waren getransfecteerd met gebruik van Lipofectamine en LTX Opti-MEM medium (Invitrogen) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Na 24 uur werd de luciferaseactiviteit gemeten volgens instructies van de fabrikant (Promega). Verder hebben we onderzocht luciferaseactiviteit aangedreven door β-catenine behulp TopFlash reporter vector zoals eerder beschreven [18].

Soft Agar kolonievormende Assay

4 x 10 ^{3 cellen werden uitgeplaat in 1 ml kweekmedium dat 0,36% (w /v) topagar gelaagd over een basale laag van 0,72% (w /v) agar in 6-well platen en toegestaan ​​te groeien gedurende 3-4 weken. Kolonies werden gefotografeerd en geteld in tien willekeurige gezichtsvelden bij 50X vergroting met behulp van licht microscopie. Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd.}

Western blotanalyse en Fractionering van Nucleus en cytoplasma

De cellen werden gelyseerd in buffer die 50 mM Tris-HCl, 350 mM NaCl, 0,1% NP40, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 10 ug /ml aprotinine, 10 ug /ml leupeptine en 1 mM Na3VO4. Totale cellysaten werden onderworpen aan SDS-PAGE en geblot op Immobilon membranen (Millipore Corp., Bedford, MA) zoals eerder beschreven [24], [25]. Om cytosol en nucleaire fractie te bereiden, werden de cellen gelyseerd in bufferA (10 mM HEPES, pH 7,9, 10 mM KCI, 10 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,4% IGEPAL en proteaseremmers) en incubeer gedurende 20 minuten op ijs. Na centrifugatie (3 minuten, 5000 rpm), werd supernatant als cytoplasmatische fractie. De resulterende pellets werden geresuspendeerd in bufferB (20 mM HEPES, pH 7,9, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 1 mM DTT en proteaseremmers) en geïncubeerd gedurende 2 uur onder continu roeren bij 4 ° C. Na centrifugatie (5 min, 15.000 rpm), werd supernatant als kernfractie. De kernen werden gekleurd met DAPI.

• PLoS ONE: Expression Profiling van Stem Cell-gerelateerde genen in-Neoadjuvante Behandeld maagkanker: A NOTCH2, GSK3B en β-catenine Gene handtekening voorspelt Survival
• PLoS ONE: Rol van de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en VEGF-R genotypering in het begeleiden van de gemetastaseerde Proces pT4a weggesneden MaagKanker Patients