PLoS One: A dereguláció között miR-29b /c és DNMT3A társul epigenetikai némító a Cdh1 Gene befolyásoló Cell migrációs és behatolás a gyomor Cancer

absztrakt katalógusa

A dereguláció a miR-29 család és DNS metiltranszferáz 3A (DNMT3A) van társítva gyomorrák (GC). Bár egyre több bizonyíték utal miR-29b /c lehetne szabályozni a DNS metiláció megcélozva DNMT3A, jelenleg ismert, epigenetikai elnémítása miR-29b /c keresztül promoter hipermetiláció GC okozta kóros expressziója DNMT3A. Így kívánta értékelni, hogy áthallás szabályozás áll fenn miR-29b /c és DNMT3A és hogy ez együtt jár a malignus fenotípus GC. Először is, a sebgyógyulást és Transwell assay kiderült, hogy a miR-29b /c elnyomja a tumor metasztázis GC. A luciferáz riporter vizsgálat bizonyította, hogy DNMT3A közvetlen célpontja a miR-29b /c. Használtuk biszulfit genomi szekvenálás, hogy elemezze a DNS metiláció állapotát miR-29b /c. A százalékos metilezett CpGs szignifikánsan csökkent DNMT3A-hiányos sejtek a kontrollhoz képest. Továbbá bevonásával DNMT3A előmozdításában GC sejtmigrációt kapcsolódó promoter metiláció által közvetített elnyomását Cdh1. 50 páros klinikai GC szövetmintából, csökkent miR-29b /c szignifikáns korrelációt a foka a differenciálás és invázió a sejtek és negatívan korrelált DNMT3A kifejezést. Együtt mi előzetes eredmények arra utalnak, hogy a következő eljárást lehet vonni GC tumorogenezisben. miR-29b /c elnyomja a downstream gén DNMT3A, és viszont, a miR-29b /c elnyomja DNMT3A a DNS metiláció-függő módon. A dereguláció mind a miR-29b /c és DNMT3A vezet epigenetikus hangtompító Cdh1 és hozzájárul a metasztázis fenotípus GC. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a DNS-metilációs-asszociált silencing miR-29b /c kritikus a GC fejlődés, és így lehet egy terápiás célpont.

bevezető hivatkozás: Cui H, Wang L, Gong P, Zhao C, Zhang S , Zhang K, et al. (2015) A dereguláció között miR-29b /c és DNMT3A társul epigenetikai némító a Cdh1 Gene befolyásoló Cell migrációs és behatolás gyomorrákban. PLoS ONE 10 (4): e0123926. doi: 10,1371 /journal.pone.0123926 katalógusa

Akadémiai Kiadó: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: szeptember 4, 2014; Elfogadva: március 9, 2015; Megjelent: április 15, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Cui et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír és az azt támogató információs fájlokat. katalógusa

Forrás: Ezt a munkát támogatta a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (Grant No. 81171915, 91229107 számú és No. 81472548), http: //www .nsfc.gov.cn /. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák (GC) a második leggyakoribb halálos malignitás világszerte. Ez teszi ki, összesen mintegy 1 millió új esetet és 0,7 millió ember halálát okozza évente több, mint 70% -a fejlődő országokban következik be, különösen a kelet-ázsiai országok [1]. Bár gyógyítható, ha korai stádiumban kimutatható a legtöbb GC betegnél csak a késői stádiumú. Azoknál a betegeknél, operábilis betegség, a hagyományos műtét és a kombinációs kemoterápiás van tüntetve. Azonban a teljes 5 éves túlélési arány GC betegek kevesebb, mint 30% [1, 2]. Figyelemre méltó, hogy a GC gyakran kíséri peritoneális terjesztése, valamint az áttétek a regionális nyirokcsomók és távoli szervekbe a nyirokrendszeren és vénás erekben [3]. Így azonosítása molekuláris rendellenességek GC lehet jobban megértsük a gyomor carcinogenesis és segítenek osztják betegek biológiailag és klinikailag releváns alcsoportok, valamint fejleszteni új terápiás stratégiák. Katalógusa

A mikroRNS (miRNS) egy osztály endogén, kicsi, nem kódoló szabályozó RNS-ek körülbelül 20-25 nukleotid, amely negatívan szabályozzák a génexpressziót azáltal, hogy gátolja fordítás vagy indukáló mRNS degradáció a bázispárosodás a 3 'nem transzlálódó régiót (3'UTR) target messenger RNS-ek (mRNS-ek) [4]. Megváltozott expressziója szintjének miRNS számoltak be számos rák és eredményezheti aberráns a célgének expresszióját, amelyek befolyásolják a malignus viselkedés, mint például proliferáció, ellenállás az apoptózis és a metasztázis [5-7]. Egyre több bizonyíték mutatja, hogy a szabályozatlan miRNS (pl miR-17, miR-129, miR-148a, miR-378 és) hozzájárul a gyomor karcinogenezis [8-10], amely azt jelzi, hogy a miRNS lehetne használni diagnosztikai és prognosztikai biomarkerek GC .

A miR-29 család (miR-29-esek) egy konzervált család miRNS, amely magában foglalja a miR-29a /b /c. Csökkent expressziója miR-29s leírták több rákos megbetegedések, beleértve a GC [11-14]. Korábbi tanulmányok azt mutatják, hogy a miR-29-esek játszanak meghatározó szerepet GC sejtburjánzást, a sejtciklus előrehaladását, az apoptózis és a sejtek mozgékonyságát [14, 15]. Potenciális célpontjainak miR-29-esek hozzájárul a malignus fenotípus GC közé Cdc42, CCND2 és MMP2 [14, 15]. Ezen kívül néhány tanulmány azonosította miR-29-esek, mint közreműködők a szabályozás a DNS metiláció megcélozva DNMT3s tüdőrákban [13]. Továbbá számos célgének, mint például a TCL-1, CDK6, laminin-1, és az Mcl-1, is beszámoltak más rák [16]. Figyelemre méltó, hogy annak ellenére, hogy bizonyítékokat miRNS-29-esek is funkcionálhat tumor szupresszor gének, az egyik kulcskérdés kapcsolatos miRNS-29s kifejezés továbbra is részben megoldatlan. Mik az ellenőrzési mechanizmusokat miRNS-29s expresszió GC sejtekben? Leírták, hogy a c-Myc részt vesz a miR-29a /b elnyomás [17]. Azonosítása további elnyomása mechanizmusok érdekes.

Köztudott, hogy a transzkripciós silencing a tumorszuppresszor gének (HKT) által CpG-szigetre hipermetiláció közös fémjelzi a karcinogenezis. Érdekes, hogy hasonló fehérjét kódoló HKT, jelentős számú miRNS szabályozzák promoter metiláció [18-20]. Sőt, volt egy egyre több tanulmány azt mutatja, hogy a tumor szupresszor miRNS, mint a miR-34b, miR-129, miR-124 és, gyakran elhallgattatta DNS metiláció GC [21-23]. Alapján a CpG Island kereső program elemzése, a becslés azt mutatta, hogy a miRNS-29b /c tartalmaz CpG-szigetek saját feltételezett promoter régióban. Azonban ez még nem tisztázott, hogy a rendellenes DNS hipermetilációt esetében a zavara miR-29b /c. Ezen túlmenően, nem ismert, hogy egy visszacsatolásos szabályozás között létezik miR-29b /c és DNMT3s. Tény, hogy nem korábbi tanulmány megvizsgálta a metilációs állapotát miR-29b /c GC sejtekben, és egyik sem vizsgálta a kapcsolat a metilációs miR-29b /c és expressziós szintje DNMT3s. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy a miR-29b /c elnyomta a kifejezés DNMT3A megcélozva a 3'UTR, ami hozzájárult ahhoz, hogy gátolja a GC-migráció és inváziót. Másrészt, DNMT3A alulszabályozott miR-29b /c keresztül aberráns hipermetiláció a promoter. Így egy potenciális visszacsatolási hurok között létezik miR-29b /c és DNMT3A, amelyben a down-regulációja miR-29b /c eltörli a elnyomása DNMT3A. Eközben a up-regulációját DNMT3A befolyásolja expressziójának miR-29b /c promoter metiláció. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az áthallás között miR-29b /c és DNMT3A. Az egyensúly és a dereguláció okot egy epigenetikus mechanizmus, amely részt vesz a GC-migráció és invázió jellemzőit. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Sejtkultúra katalógusa

GC sejtvonalak, beleértve AGS és BGC-823, kaptuk a sejtbank a kínai Tudományos Akadémia és RPMI-1640 tápközegben, amelyet 10% magzati borjú szérumot (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U /ml penicillint és 100 mg /ml sztreptomicinnel (Invitrogen, Carlsbad, CA), párásított inkubátorban, 5% -os CO _{2 atmoszférában 37 ° C-on.}

a szövetmintákat

50 pár GC szövetek és azok szomszédos nem rákos szöveti mintákat gyűjtöttünk 2011 és 2013 között a Jiangning Kórház Nanjing. A klinikai adatokat a betegek GC látható S1 táblázatban. A vizsgálatot a Bizottság által elfogadott vonatkozó etikai felülvizsgálata Kutatás a Jiangning Kórház Nanjing Kínában, és a betegek írásbeli beleegyezését adta a formákat. Az összes szöveti mintákat szenvedő betegekből származó GC. Ezeket összegyűjtjük műtét közben, és azonnal hirtelen lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, míg az RNS és a fehérje kitermelése.

reverz transzkripciós reakciót és kvantitatív valós idejű PCR (qPCR)

Teljes RNS-t kivontuk a sejtek és szövetek betakarított Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), a gyártó előírásainak megfelelően.

kimutatására miRNS expresszió egy szár-hurok RT-PCR-t végeztünk a korábban leírtak [24], és U6 kis RNS-eket használható, mint egy belső kontroll. qPCR végeztük SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, Kína), a gyártó protokollja szerint. A relatív expressziós értékeltük az összehasonlító CT módszer. A primer szekvenciák az egyes gén mutatjuk be az S2 táblázatban.

Western blot

Western blot alkalmazásával végeztük anti-DNMT3A (ABCAM, Cambridge, UK), anti-Cdh1 (ABCAM, Cambridge, UK), anti-vimentin (santa Cruz Biotechnology, santa Cruz, CA, USA), és anti- β
aktin antitesteket (Sigma, Ronkonkoma, NY, USA), és a detektálás végeztük Super Signal kemilumineszcenciás szubsztrát (Pierce, Rockford, IL, USA).

Transzfekció

miR-29b /c utánozza /inhibitorok és negatív kontroll molekulák (scramble kontroll utánozzák és inhibitor) szintetizáltuk és tisztítjuk GenePharma Társaság (Sanghaj, Kína). A szekvenciákat mutatjuk be az S2 táblázatban. Ezeket transzfektáljuk a sejtekbe, a végső koncentráció 50 nM Lipofectamine-2000 transzfekciós reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, USA), a gyártó protokollja szerint. A tápközeget lecseréltük 6 óra után. A sejteket 48 órán keresztül tenyésztettük, és a betakarított elemzésre. A százalékos transzfekciós hatékonyságot úgy határoztuk meg, hogy felmérje a szint a miR-29b /c kifejezés vagy knockdown következő transzfekciókra (S1A és S1B ábra). A protokoll létrehozó DNMT3A stabil akciós sejtekben leírták a korábbi munka [25]. A kifejezés a DNMT3A drámaian csökkent a BGC-shDNTM3A és AGS-shDNTM3A sejtek (S1C ábra), mint a kontroll sejtek.

sebgyógyulást, migrációs és behatolás vizsgálatokban

Cell mobilitás vetjük alá, a sebgyógyulási assay analízis a korábban leírtak szerint [26]. A karcolás seb keletkezett alkalmazásával 200 ul pipetta hegyét a konfluens egysejtrétegek hat-üregű lemezeken. A sejteket ezután mostuk, friss közeg eltávolítására lebegő sejteket és a terjedését a seb lezárását volt megfigyelhető 48 óra elteltével és fényképezett mikroszkóp alatt. A potenciális migráció és invázió a transzfektált sejteket értékeltük egy Transwell assay. A sejteket 70% -os összefolyásig és transzfektáltuk 24 órán át a miR-29b /c utánozza, vagy kontroll-utánzatok, valamint a miR-29b /c inhibitor vagy vezérlő inhibitor. A migrációs assay, a sejteket 200 ml-es tápközegben, 1% magzati szarvasmarha szérumot a felső kamrában egy nem bevont transwell insert. Az alsó kamrában, 600 ml tápközegben 10% magzati szarvasmarha-szérumot használtunk, mint egy kemoattraktáns ösztönzésére sejtek migrációját. Az inváziós vizsgálati eljárás, a felső kamra a transwell lapkák vontunk be 50 ml 1,0 mg /ml Matrigel, és a sejteket szélesztjük a felső kamrában, a Matrigel bevont Transwell betét (Millipore, USA). Miután a 24 órás inkubáció után a nem-vándorló vagy nem árasztja sejteket óvatosan eltávolítani egy vattacsomót. Mind a sejteket megfestettük 0,1% -os kristályibolya-festéssel és számláltuk 5 mező egy invertált mikroszkóp alatt. A független kísérletek háromszor ismételtük.

biszulfit genomi szekvenálással (BGS)

A genomi DNS-t vontunk ki a sejteket a fenol-kloroform módszerrel. Biszulfit-kezeiés végeztük a CpGenome Universal DNS-módosító Kit (Millipore, USA) a gyártó utasításai szerint. PCR-termékek a biszulfit szekvenálás voltak gélen tisztítottuk és szubklónoztuk egy pMD19-T vektor rendszer (Takara, Dalian, Kína). Legalább tíz telepet szekvenáltuk, hogy értékelje a mértéke metiláció az egyes CpG hely. A primereket felsorolt ​​S2 táblázatban.

luciferáz riporter assay

A protokoll a luciferáz riporter assay korábban már leírták [14]. 3'UTR humán DNMT3A PCR-rel amplifikáltuk és klónoztuk a NotI és XbaI helyei pGL-3 (Promega, USA). A BGC-823 sejteket sűrűségben 5 × 10 ^{5 lyukanként egy 12 lyukú lemez, mielőtt a transzfekció. A sejteket transzfektáltuk pGL-3 szentjánosbogár luciferáz riporter (1 jig per lyuk), pRL-TK (50 ng per lyuk), és a miR-29 utánozza /inhibitor (50 nM) vagy negatív kontroll utánozza /inhibitorok (50 nM) alkalmazásával Lipofectamine- 2000 transzfekciós reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, USA), a gyártó protokollja szerint. A luciferáz aktivitást a tesztelt 48 órával a transzfektálás után a Dual-luciferáz aktivitást Assay System (Promega, USA). Minden kísérletet végeztünk három független ismétlésben. Katalógusa}

A statisztikai elemzés katalógusa

A független Student t katalógusa -teszt hasonlítottuk össze az eredményeket, amelyeket az átlag és ± SD bármely két előre kiválasztott csoport. Annak megállapításához összefüggés a változók, Pearson katalógusa 's korrelációs koefficiens számolható. A P katalógusa -érték kisebb, mint 0,05 tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

miR-29b /c szükséges és elégséges GC sejtek migrációját katalógusa

korábbi tanulmányok arra utalnak, hogy a miR-29b /c kritikus GC sejtek invázióját. Ahhoz, hogy tovább értékeli, hogy a miR-29b /c felelős GC sejtek migrációját, egy in vitro katalógusa karcolás sebgyógyulási vizsgálat és Transwell assay végeztünk. Miután tranziensen transzfektálása a miR-29b /c utánozza, vagy negatív kontroll a BGC-823 sejtek, a sebgyógyulási vizsgálat azt mutatta, hogy a sejtek a kényszerű expresszióját miR-29b /c megjelenik egy különösen lassabb helyreállítási összehasonlítva a kontroll sejtek (ábra 1A). Hasonlóképpen, a Transwell migrációs assay azt mutatta, hogy a túlzott kifejeződése miR-29b /c szignifikánsan kevesebb migráció, mint a kontrollcsoportban ( P katalógusa < 0,05, 1B ábra). Sőt, összhangban vannak más adatokat HGC-207 és MGC-803 GC sejtek [14], a miR-29b /c túltermelése sejtek is kimutatták, hogy jelentősen csökkenti az invazív képességét a matrigel inváziós vizsgálat ( P <katalógusa 0,05, ábra 1C). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a miR-29b /c nem csak az fontos, GC sejtek invázióját, hanem a sejtek migrációját. Annak további igazolására, a szuppresszív hatását miR-29b /c GC sejtek migrációját és invázióját, a BGC-823 sejteket tranziensen transzfektáltunk a miR-29b /C inhibitorok vagy a negatív kontroll. A törlés a miR-29b /c jelentősen növelte a migrációs és invazív képességek a GC sejtek, amelyek megítélése a sebgyógyulást (1d) és Transwell assay ( P katalógusa < 0,05, ábra 1E ábra a 1F). Együttesen ezek az eredmények azt jelzik, hogy a miR-29b /c hatásosan szüntette GC sejt migrációs és behatolás, amely tehát hozzájárult a korai szakaszában a malignus progressziójának GC.

DNMT3A közvetlen transzkripciós target miR-29b /c GC katalógusa

Ahhoz, hogy megértsük a mechanizmus alapjául hatása miR-29b /c sejtvándorlásra és invázió, megvizsgáltuk a célokat a miR-29b /c. DNMT3A 3'UTR komplementer miR-29b /c és a közvetlen cél gén miR-29b /c, ezért végeztünk egy riporter esszé BGC-823 sejtekben. A DNMT3A mRNS 3'UTR-t helyezünk a downstream régióban egy luciferáz riporter gént a pGL-3 vektorba (azaz DNMT3A 3'UTR-Luc). A szerkezeteket ezután kotranszfektáltunk pRL-TK és a MIR-29b /c utánozza, vagy a negatív kontroll utánozza a BGC-823 sejtekben. Amint azt a 2A ábra a relatív luciferáz aktivitás szignifikánsan csökkent a pGL-3 vektorokat a DNMT3A 3'UTR ( p
< 0,05). Ugyanakkor a konstrukciók kotranszfektáltuk a miR-29b /c inhibitor nem befolyásolta a luciferáz aktivitást a pGL-3 vektorokat a DNMT3A 3'UTR összehasonlítva a konstrukciók kotranszfektáltuk a negatív kontroll inhibitor (2B ábra). Ahhoz, hogy tovább igazoljuk az miRNS-target interakció, kvantitatív RT-PCR (qRT-PCR) és Western-blot végeztünk, hogy erősítse meg a szabályozás DNMT3A által miR-29b /c. Mi átmenetileg transzfektált a miR-29b /c utánozza, vagy a negatív kontroll utánozza a BGC-823 sejtekben. A megnövekedett miR-29b /c csökkentette DNMT3A kifejezés mRNS (2C) és fehérje szinten (ábra 2E, lane1-3). Ezzel szemben, a miR-29b /c leszabályozza által inhibitor növelte a DNMT3A kifejezés mRNS (ábra 2D) és fehérje szinten (ábra 2E, lane4-6). Együttesen ezek az eredmények azt jelzik, hogy DNMT3A közvetlen transzkripciós target miR-29b /c és negatívan kapcsolódó miR-29b /C expresszió GC sejtekben.

miR-29b /c elnyomja DNMT3A egy DNS metiláció függő módon katalógusa

Tekintettel arra, hogy a rendellenes hipermetiláltsági kritikus miRNS leszabályozza, azt gondolták, hogy a negatív visszacsatolás áll fenn miR-29b /c és DNMT3A. Ezen hipotézis, a jelenléte a CpG sziget metiláció a miR-29b /c promoter régiót értékeltük a BGS-elemzés a DNMT3A-knockdown sejteket. Ábrán látható a 3A, 7 egyedi CpG oldalak belül a CpG-szigetre régiókban (5 kb upstream miR-29b /C) szekvenáltuk azonosítani metilezett citozin maradványok. A frekvencia a miR-29b /c promoter metiláció DNMT3A-knockdown sejtek 34,2% volt, ami lényegesen alacsonyabb, mint a kontroll sejtek (58,6%; 3. ábrán). Ez az eredmény azt jelzi, hogy a transzkripciós silencing miR-29b /c GC sejtekben van társítva jelenlétében CpG-sziget hipermetilációt amelyet megerősített mérésével érett miR-29b /c által QRT-PCR. Ott volt szignifikánsan növelte a miR-29b /c kifejezést a AGS-shDNMT3A és BGC-shDNMT3A sejtek képest a kontroll (3C). Ezek az eredmények azt mutatják, fontos molekuláris alapját miR29-b /c leszabályozza és alátámasztják azt a feltételezést, hogy van közötti áthallás miR-29b /c és DNMT3A. Katalógusa

DNMT3A elősegíti GC sejtek migrációját katalógusa

a molekuláris kapcsolatot miR-29b /c és DNMT3A felmerült a kérdés DNMT3A részvétel GC sejtek migrációját. Mi továbbra is alkalmazni in vitro katalógusa meghatározására irányuló vizsgálatokban a funkcionális változások sejt viselkedését követően megváltozott expressziója DNMT3A. A sebgyógyulás vizsgálat bizonyította meglehetősen lassú fellendülés a BGC-shDNMT3A sejtek, mint a kontroll sejtekben (4A, felső), de csak szerény fellendülés az AGS-shDNMT3A sejtek, mint a kontroll sejtekben (4A, alul). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy DNMT3A fontos a sejt mobilitást. Tekintettel arra, hogy a sejtadhéziós molekulák amelyek fontosak a sejt motilitást, a kifejezés a Cdh1 és Vimentin vizsgáltuk QRT-PCR és Western-blottal. Kiütése DNMT3A expresszió jelentősen nőtt a Cdh1 kifejezés mind az mRNS és fehérje szinten, de nem volt jelentős hatása a kifejezés a vimentin (ábra 4B és 4C), ami arra utal, hogy a Cdh1 lehet egy célpontja DNMT3A által közvetített szabályozási zavarának sejt mozgékonyság. Továbbá, mi végzett a BGS vizsgálatot a Cdh1 gén DNMT3A-knockdown sejteket. Ábrán látható a 4D, a százalékos metilezett CpGs belül található Cdh1 alacsonyabb volt a DNMT3A-hiányos sejtek, mint a kontroll sejtek (35,8% vs. 94,1%). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a kóros expressziója DNMT3A vezet epigenetikus hangtompító Cdh1. Katalógusa

miR-29b /c részt vesz az elnyomás Cdh1 katalógusa

Ahhoz, hogy tovább vizsgálják a hatását a megváltozott miR 29b /c véleménynyilvánítás Cdh1, mi átmenetileg transzfektált a miR-29b /c utánozza, vagy negatív kontroll utánozzák a BGC-823 sejtekben. A kontrollokhoz képest, a kényszerű expresszióját miR-29b /c jelentősen megnövekedett expresszióját Cdh1 mind az mRNS és fehérje szinten (ábra 4E és 4F). Ezt követően, a metilációs állapotát a promoter régió a Cdh1 alkalmazásával vizsgáltuk egy BGS assay a miR-29b /c utánozza, vagy negatív kontroll hasonlítanak tranziensen transzfektáltunk BGC-823 sejtekben. Az eredmények azt mutatták, hogy a frekvencia Cdh1 promoter metiláció a miR-29b /c túltermelése sejtek 5,2% vagy 12,9% volt, ami lényegesen alacsonyabb a mért szint a kontroll sejtek (88,2%; ábra 4G). Ezek az adatok összhangban voltak az eredménnyel, hogy DNMT3A knockdown közvetíti a up-regulációját Cdh1 és azt mutatja, hogy a de-szabályozás a miR-29b /c és DNMT3A vesznek részt a GC-migráció és invázió.

csökkent expressziója miR-29b és miR-29c GC szövetek katalógusa

A kifejezés a miR-29b /c 50 GC tumorok és páros nem daganatos szövetekben vizsgáltuk qRT-PCR-rel. Összehasonlítva a párosított nem tumoros szövetekben, a frekvencia a miR-29b és miR-29c down-regulációja (meghatározni, mint egy nagyobb, mint két-szeres csökkenés) 66% volt (33/50), illetve 60% (30/50), illetőleg (5A és 5B). Az átlagos szeres változást a miR-29b és miR-29c szignifikánsan alacsonyabb volt a tumor szövetben, mint a nem daganatos szövetek ( P katalógusa < 0,01, ábra 5C és 5D). Hogy vizsgálja meg a klinikopatológiai jelentőségét miR-29b és miR-29c expressziós mintázatot GC tumorogenezisben, a klinikai jellemzői GC betegek elemezték. Minden 43 betegnél elemzett két csoportba sorolhatók szerint miR-29b és miR-29c szinteket. Csökkent miR-29b erősen korrelál a mértéke a tumorsejtek differenciálódását és invázió, míg a csökkent miR-29c csak korrelált a tumor invázió (1. táblázat). Továbbá, a kapcsolat a miR-29b /c expresszió és DNMT3A expresszióját vizsgáltuk 33 GC esetben. Az egyesület tanulmány kimutatta, hogy DNMT3A kifejezés negatívan korrelált a miR-29b ( R katalógusa = -0,640, P katalógusa < 0,01, ábra 5E) és miR-29c ( R
= -0,349, P katalógusa < 0,05, ábra 5F). Együttesen ezek az adatok azt mutatják, hogy a miR-29b /c játszhat fontos szerepet a progresszió gyomor kialakulásában. Katalógusa

Vita katalógusa

A konzervált miR-29 család, beleértve a miR-29a, miR 29b és miR-29c, közrejátszik néhány pincében folyamatokban, mint például a proliferáció, a differenciálódás, az apoptózis és metasztázis, így egy jól elemzett család miRNS-ek a tumorigenezisben [16]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a fokozott expresszió a miR-29a társított jobb általános túlélési arány Stage II vastagbélrákos betegeknél [27] és alacsonyabb szintek a miR-29b elősegítheti prosztatarák metasztázis szabályozása által epithelialis-mesenchymalis átmenet jelátviteli utak [28] . Ezen túlmenően, a miR-29c működik, mint egy metasztázisszuppresszor-, amely gátolja a tüdőrák sejtadhéziót az extracelluláris mátrix és a migráció in vitro
és a in vivo katalógusa [29]. GC, lényegesen csökken a miR-29b és miR-29c, különösen figyeltek képest miR-29a [14], ami arra utal, hogy a miR-29b /c játszhat nagyobb szerepet. Így miR-29b /C-t elemzésre kiválasztott ebben a vizsgálatban. A jelen tanulmányban azt mutatták, fokozott miR-29b /c elnyomja a migráció és invázió BGC-823 sejtekben sebgyógyulási vizsgálat és Transwell assay. Ezek az eredmények összhangban vannak más jelentett nyert adatokat SGC-7901, HGC-27 és MGC-803 GC-sejtek [14, 15]. Tekintettel arra, hogy a miR-29b /c is szerepet játszanak a proliferáció és az apoptózis GC, megvizsgáltuk a képességét, a sejtnövekedés és a szintek a sejt apoptózis BGC-823 sejtekben. Az eredmények azt mutatták, hogy nincs különbség a proliferáció 48 óra miR-29b /c utánozza vagy inhibitorok-transzfektált sejtek, míg a negatív kontroll sejtek ( p
> 0,05, S2A és S2B ábra). Továbbá Annexin-V festés nem mutatott drámai növekedése szintjének apoptózis a miR-29b /c utánozza-transzfektált sejtek 48 óra után az inkubálás (S2C ábra). Ezen túlmenően, a sejtciklus analízis nem mutatott szignifikáns különbséget a G1, S, G2 /M fázisban való kezelés után a miR-29b /c utánozza, vagy negatív kontroll utánozza 48 órán át ( p
> 0,05, S2D Ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a miR-29b /c lassítja a seb területének hasznosítás 48 órában főleg azért, mert a csökkent sejtek mozgékonyságát képességeit. Katalógusa

miRNS fejtik funkcióit elsősorban célzó 3'UTRs különböző gének. Azonban a részletes molekuláris mechanizmusainak miR-29b /c kapcsolatos rosszindulatú GC fejlődés nehezen érthető. Figyelemre méltó, hogy a miR-29b /c ugyanazokkal a kiegészítő jelleg helyek 3'UTR a DNMT3A, amely megjósolta target predikciós programok, beleértve TargetScan, Miranda és miRBase. Egyelőre nem ismeretes, hogy a miR-29b /C szabályozza a rendellenes metilációs kapcsolatos gének metasztázis kölcsönhatásban DNMT3A fejlesztése során GC. Ezért elvégeztük a luciferáz riporter vizsgálat, és megállapította, hogy a magas DNMT3A kifejezést járó alacsony miR-29b /c expresszió GC sejtekben, jelezve DNMT3A közvetlen transzkripciós cél a miR-29b /c. A molekuláris alapon, hogy vezet az egyensúly a miR-29b /c GC továbbra is ismeretlen. miR-29 proximális promoterek van kötőhelyeket több transzkripciós faktorok, mint például a c-Myc, és CEBPA, amelyek hozzájárulnak a deregulációját miR-29s [30, 31]. A kutatás azonban az epigenetikai szabályozása miRNS-29-esek még nem számoltak be. Katalógusa

Az eukarióta sejtekben, három enzimatikusan aktív DNS metiltranszferázok (DNMTs), DNMT1, DNMT3A és DNMT3B. A kifejezés a DNMT3A GC lényegesen nagyobb, mint a DNMT3B [32, 33]. Sőt, csak növelte DNMT3A expresszió szignifikánsan összefügg a rövidebb betegségmentes túlélés időszak GC [34], ami azt jelzi, DNMT3A játszik fontosabb szerepet a gyomor kialakulásában. Így célja annak vizsgálata, hogy a negatív visszacsatolás szabályok között fennálló miR-29b /c és DNMT3A. Ebben a vizsgálatban használtunk BGS assay, hogy elemezze a DNS-metilációs állapotát miR-29b /C DNMT3A RNSi GC sejteket. Valóban, a csökkent miR-29b /c részben volt köszönhető DNMT3A közvetített hipermetiláltsági. Továbbá, azt megerősítette, hogy DNMT3A részt előmozdításában GC sejt migrációt alulszabályozza Cdh1. Közben azt is kimutatta, hogy a miR-29b /c részt vesz az elnyomás Cdh1. A fémjelzi a rák metasztázis a veszteség Cdh1 kifejezés [35], és hipermetiláció belül Cdh1 promoterrégió is megfigyelhető GC [36]. Ebből kifolyólag, eredményeink azt mutatják, hogy mind a miR-29b /c és DNMT3A társított Cdh1 leszabályozza keresztül DNMT3A közvetített promoter hipermetilációt. Szerepe más DMNTs, például DNMT3B, szabályozásában miR-29b /c kell vizsgálni a jövőbeli vizsgálatokban. Katalógusa

A GC példányok megvizsgáltuk a kifejeződési mintázatát miR-29b /c 50 pár GC szövetekben. Csökkent miR-29b /c (szétnyitható változás cutoff: 2,0) szignifikáns korrelációt mutatott a differenciálás és invázió diplomát GC, ami arra utal, hogy a miR-29b /c kritikus szerepet játszik a GC rosszindulatú karbantartási és közvetlenül bizonyítja a klinikai jelentősége miR -29b /c GC progresszióját. Összefoglalva, a vizsgálat során kiderül, hogy lehet között áthallás miR-29b /c és DNMT3A. Egyenlőtlenség ilyen tényező lehet vonni GC migrációs és behatolás fenotípus. Ez az egyensúlyhiány tartalmazhat alacsony szintű expressziójának miR-29b /c lehetett megszüntetni elnyomása DNMT3A és a magas szintű DNMT3A további befolyásolja a kifejezés a miR-29b /c egy epigenetikus mechanizmus. Ezek az eredmények előnyös lehet az új kezelési lehetőségek GC célzó miR-29b /c és a feldolgozó gén DNMT3A. Katalógusa

alátámasztó információk katalógusa S1 ábra. A százalékos transzfekciós hatékonyság adtak értékelést szintek miR-29b /c vagy DNMT3A.
(A és B) QRT-PCR-t végeztünk, hogy észleli a relatív expressziójának miR-29b /C BGC-823 sejteket utánozza (A) vagy inhibitorok (B) után 48 órás transzfekció. (C) RT-PCR és Western blot végeztünk, hogy észleli a hatékonyságát DNMT3A knockdown a BGC és AGS sejteket. β-aktin katalógusa használtunk kontrollként. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s001 katalógusa (TIF) hotelben S2 ábra. A szerepe miR-29b /c a BGC-823 sejtek proliferációs, az apoptózis és a sejtciklus.
(A) a sejt növekedési rátája miR-29b /c overexpresszió detektáltunk CCK-8-proliferációs vizsgálati eljárásban. miR-29b /c overexpresszió nem mutatott jelentős különbséget a 48 óra, szemben a negatív kontroll sejtek ( p
> 0,05). (B) A sejtszaporodás mértékét miR-29b /c gátlás detektáltunk CCK-8-proliferációs vizsgálati eljárásban. Elnyomása miR-29b /c nem mutatott jelentős változást a 48 óra, szemben a negatív kontroll sejtek ( p
> 0,05). (C) Apoptózis assay nem mutatja drámai apoptózis indukciója által miR-29b /c overexpresszió 48 óra, szemben a negatív kontroll sejtek. A biparametric hisztogram megmutatja cella elején (jobb alsó kvadráns), valamint a késői apoptotikus államok (jobb felső negyede). (D) a sejtciklus vizsgálatot úgy végezzük, áramlási citometriával BGC-823 sejtek után miR-29b /c utánozza, vagy negatív kontroll utánozza kezelés 48 órán át. A százalékokat a miR-29b /c túltermeléssel vagy kontroll sejtek a G1, S és G2 /M látható az oszlopdiagram, mint az átlag ± s.d. három független kísérlet. Összehasonlítva a kontroll sejtek, nem volt szignifikáns hatása a sejtciklus után miR-29b /c overexpresszió.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s002 katalógusa (TIF) katalógusa S1 Módszer. Sejtnövekedést és apoptózist vizsgálattal. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s003 katalógusa (DOC) hotelben S2 módszer. Sejtciklus esszé. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s004 katalógusa (DOC) hotelben S1 táblázat. Klinikai jellemzői gyomorrákos betegeknél. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s005 katalógusa (DOC) hotelben S2 táblázat. miRNS utánozzák és gátló szekvenciák és használt primerek ebben a vizsgálatban. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s006 katalógusa (DOC) hotelben

Köszönetnyilvánítás katalógusa

Köszönöm Dr. Gang Chen Nanjing Jiangning Kórház gyűjtésére a minták. Köszönetet mondunk Dr. Sheng Zhong Capital Orvostudományi Egyetem segítesz, hogy módosítsa a kézirat. Katalógusa

• PLoS One: Chrysin gátolja a tumor promoter által kiváltott MMP-9 expressziója blokkolásával AP-1 via elnyomása ERK és JNK utak gyomorrákban Cells
• PLoS One: Effect of Helicobacter pylori a Expression szintek FHIT, IL-8 és P73 a gyomornyálkahártya az első fokú rokonok a gyomorrákos betegek