PLoS ONE: panaikinimas tarp Pasaulis-29b /c ir DNMT3A yra susijęs su epigenetinius nutildyti iš CDH1 Gene, turinčių įtakos ląstelių migraciją ir invazija į skrandžio vėžio

Anotacija

de reguliavimas Mir-29 šeimos ir DNR metiltransferazės 3A (DNMT3A) yra susijęs su skrandžio vėžiu (GC). Nors daugėja įrodymų rodo Pasaulis-29B /C gali reguliuoti DNR metilinimas nukreipiant DNMT3A, šiuo metu nežinoma, ar epigenetinius triukšmo slopinimo miR-29b /c per rengėjas hypermethylation GC sukelia nenormalus išraiška DNMT3A. Taigi, mes buvo siekiama įvertinti, ar kryžminio aptarimas reguliavimas egzistuoja tarp Pasaulis-29b /c ir DNMT3A ir ar jis yra susijęs su piktybinio fenotipas GC. Pirma, žaizdų gijimas ir Transwell tyrimai parodė, kad Pasaulis-29b /c slopina naviko metastazių GC. Liuciferazės reporterio testą parodė, kad DNMT3A yra tiesioginė tikslinė miR-29b /c. Mes naudojome bisulfite genomo iššifravimas analizuoti DNR metilinimo statusą Pasaulis-29b /c. Iš denatūruotu CpGs procentas buvo žymiai sumažėjo DNMT3A-išeikvoti ląstelių, lyginant su kontrole. Be to, DNMT3A dalyvavimas skatinant GC ląstelių migracija buvo susijęs su promotoriaus metilinimo sąlygojamą represijų CDH1. 50 suporuotų klinikinių GC audinių pavyzdžių, sumažėjo Pasaulis-29b /c reikšmingai koreliavo su diferenciacijos ir invazijos į ląsteles laipsnį ir buvo neigiamai koreliuoja su DNMT3A išraiška. Kartu mūsų preliminarūs rezultatai rodo, kad ši procedūra gali dalyvauti GC Tumorigenesis. ir miR-29b /c slopina pasroviui genų DNMT3A, ir savo ruožtu, miR-29b /c slopina DNMT3A į DNR metilinimo priklausomu būdu. De-reguliavimas abu Pasaulis-29b /c ir DNMT3A veda į epigenetinio nuslopinami iš CDH1 ir prisideda prie metastazių fenotipas GC. Ši išvada rodo, kad DNR metilinimas susijęs triukšmo slopinimo miR-29b /c yra labai svarbus GC plėtros ir tokiu būdu gali būti terapinis taikinys

nurodomoji dalis:. Cui O Wang L, Gong P Zhao, C, Zhang S , Zhang K, ir kt. (2015) panaikinimas tarp Pasaulis-29b /c ir DNMT3A yra susijęs su epigenetinius nutildyti iš CDH1 Gene, turinčių įtakos ląstelių migraciją ir invazija skrandžio vėžio. PLoS ONE 10 (4): e0123926. Doi: 10,1371 /journal.pone.0123926

Akademinė redaktorius: Rajeev Samant, Alabamos universitetas Birmingeme, JAV

Įstojo rugsėjo 4, 2014 m Priėmė: Kovo 9, 2015 metų; Paskelbta: Balandžio 15, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Cui et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas:. Šis darbas buvo remiamas nacionalinio Gamtos mokslo fondo Kinijos (dotacijos Nr 81.171.915, Nr 91.229.107 ir Nr 81.472.548) http: //www .nsfc.gov.cn /. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra antra labiausiai mirtinas piktybinis navikas visame pasaulyje. Tai sudaro maždaug 1 mln naujų atvejų ir 0,7 mln mirčių viso per metus, iš kurių daugiau nei 70% įvyksta besivystančiose šalyse, ypač Rytų Azijos šalių [1]. Nors išgydomas, jei nustatomas anksti, dauguma GC pacientams diagnozuota vėlai liga. Pacientams, sergantiems operuoti ligos, nurodytos įprastinės operacijos ir mišriai chemoterapijos. Tačiau bendra 5-metų išgyvenamumas GC pacientams yra mažiau nei 30% [1, 2]. Pažymėtina, kad GC dažnai lydi peritoninės sklaidos ir metastazių į regioninius limfmazgius ir tolimus organus per limfos ir veninės laivų [3]. Taigi, nustatant molekulinę aberacijas GC gali pagerinti mūsų supratimą apie skrandžio kancerogenezėje ir padėti mums suskirstyti pacientus į biologiškai ir kliniškai atitinkamų vartotojų pogrupių, taip pat plėtoti naujus gydymo strategijas.

mikro RNR (miRNAs) yra endogeninio klasė, mažas, ne kodavimo reguliavimo RNR maždaug 20-25 nukleotidų, kurie neigiamai reguliuoti genų ekspresiją, slopindamas vertimą ar paskatinti iRNR degradaciją per bazinės Kergimas su 3 'neišverstas regione (3'UTR) ir tikslinės Messenger RNR (iRNR) [4]. Altered ekspresijos lygis miRNAs buvo pranešta apie daugelį vėžio ir sukelti nukrypusiu nuo normos išraiškos tikslinių genų, kurie įtakoja piktybinį elgesį, pavyzdžiui, platinimo, atsparumo apoptozės ir metastazių [5-7]. Daugėja įrodymų matyti, kad nereguliuojamoje miRNAs (pvz, PPN-17, PPN-129, PPN-148A ir Pasaulis-378) prisidėti prie skrandžio kancerogenezėje [8-10], kurie rodo, kad miRNAs gali būti naudojamas kaip diagnostikos ir prognozinių biologinių žymenų GC .

Mir-29 šeimos (MIR-29s) yra užkonservuotas šeimos miRNAs, kuri apima Pasaulis-29A /b /C. Sumažėjo išraiška miR-29 buvo aprašyta keliais vėžio, įskaitant GC [11-14]. Ankstesni tyrimai rodo, kad Mir-29s vaidina dominuojantį vaidmenį GC ląstelių proliferaciją, ląstelės ciklo progresavimo, apoptozės, ir ląstelių judrumui [14, 15]. Potencialūs taikiniai MIR-29, prisidedančių prie piktybinės GC fenotipo apima Cdc42, CCND2 ir MMP2 [14, 15]. Be to, kai kurie tyrimai nustatė MIR-29, kaip bendraautorių į DNR metilinimo reguliavimo nukreipiant DNMT3s plaučių vėžio [13]. Be to, keletas tikslinių genų, pavyzdžiui, TCL-1, CDK6, laminino-1, ir MCL-1, taip pat pastebėta kitose vėžio [16]. Pažymėtina, kad nors įrodymus Mirna-29 gali veikti kaip naviko slopintuvas genų, vienas iš pagrindinių klausimų, susijusių su Mirna-29s išraiška vis dar iš dalies išspręsta. Kokie kontrolės Mirna-29s raiškos GC ląstelių mechanizmai? Buvo pranešta, kad C-Myc dalyvauja miR-29a /b represijų [17]. Nustatyti papildomas slopinimo mechanizmus yra įdomūs.

Tai žinoma, kad transkripcijos slopinimo auglio slopintuvas genų (GTG) pagal CpG salos hypermethylation yra bendras bruožas kancerogenezėje. Įdomu tai, kad panašus į baltymų kodavimo GTG, nemažai miRNAs reglamentuoja promotoriaus metilinimo [18-20]. Iš tiesų, buvo vis daugiau tyrimų, rodančių, kad navikas slopintuvas miRNAs, pavyzdžiui, miR-34b, PPN-129, ir miR-124, dažnai nutildė DNR metilinimo GC [21-23]. Remiantis CpG sala Searcher programos analize, mūsų prognozės parodė, kad Mirna-29b /c yra CpG salas jų tariamų promotoriaus regionuose. Tačiau tai dar nėra aišku, ar netipinė DNR hypermethylation sąskaitas už PPN-29b /c disreguliacija. Be to, kol kas nežinoma, ar atsiliepimai reguliavimas egzistuoja tarp Pasaulis-29b /c ir DNMT3s. Tiesą sakant, nė Ankstesnis tyrimas išnagrinėjo metilinimo statusą PPN-29b /c GC ląstelių, ir nė vienas ištirti ryšį tarp PPN-29b /c ir lygių išraiškos DNMT3s metilinimo santykius. Šiame tyrime mes nustatėme, kad Pasaulis-29b /c slopino DNMT3A išraišką nukreipiant savo 3'UTR, kuris prisidėjo prie slopina GC ląstelių migraciją ir invazija. Kita vertus, DNMT3A žemyn reguliuojama ir miR-29B /C per netipiško hypermethylation Promotorių. Taigi potencialus grįžtamojo ryšio egzistuoja tarp Pasaulis-29b /c ir DNMT3A, kurioje žemyn reguliavimas Pasaulis-29b /c naikina į DNMT3A kritimą. Tuo tarpu, up-reguliavimas DNMT3A įtakos Pasaulis-29b /c išraiškos promotoriaus metilinimo. Šie rezultatai rodo, kryžminio aptarimas tarp Pasaulis-29b /c ir DNMT3A. Jų disbalansas ir dereguliavimo kurią sukelia epigenetinio mechanizmą, kuris gali būti dalyvauja GC ląstelių migracijos ir invazija savybių.

Medžiagos ir metodai

Mobilusis Kultūra

GC ląstelių linijas, įskaitant MAA ir BGC-823, buvo gauti iš ląstelių banko Kinijos mokslų akademijos ir prižiūrimi RPMI-1640 terpėje, papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija), penicilino 100 V /ml ir 100 mg /ml streptomicino (Invitrogen, Karlovi Varai, Kalifornija) drėgnoje inkubatoriuje 5% CO _{2 atmosferos 37 ° C temperatūroje.}

audinių mėginiai

50 porų GC audinių ir jų greta ne vėžiniai audinio mėginiai buvo imami tarp 2011 ir 2013 iš Jiangning ligoninės Nanjing. Klinikinė informacija atrinktų pacientų, sergančių GC yra parodyta S1 lentelėje. Tyrimas buvo patvirtintas komiteto Etikos apžvalga mokslinių tyrimų ties Jiangning ligoninės Nanjing, Kinija, ir pacientai pasirašė informuoto asmens sutikimą formas. Visi audinio mėginiai buvo paimti iš pacientų su GC. Jie buvo renkami operacijos metu ir iš karto Snap užšaldyti skystame azote, kol RNR ir baltymų gavyba.

atvirkštinės transkripcijos reakcijos ir kiekybinės realaus laiko PGR (qPCR)

Viso RNR buvo išskirta iš ląstelių ir audiniai nuimami naudojant Trizol reagentą (Invitrogen, Karlovi Varai, Kalifornija) pagal gamintojo nurodymus.

Jei aptikti Mirna išraišką, kamieninių ciklo AT-PGR buvo atliekama kaip aprašyta anksčiau [24], ir U6 mažos RNR buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. qPCR buvo atliekami naudojant SYBR Pašaro Ex Taq (TAKARA, Dalian, Kinija) pagal gamintojo protokolą. Santykinis išraiška buvo vertinama pagal lyginamosios KT metodu. Grunto sekos kiekvieno geno rodomi S2 lentelėje.

Vakarų dėmė

Vakarų dėmės buvo atliekama naudojant anti-DNMT3A (Abcam, Kembridžas, Jungtinė Karalystė), anti-CDH1 (Abcam, Cambridge, JK), anti-Vimentin (Santa Krusas biotechnologijos, Santa Krusas, Kalifornija, JAV) ir kovos su β
-actin antikūnai (Sigma, Ronkonkoma, NY, JAV) ir aptikimo buvo atliktas su super Signal cheminės liuminescencijos substrato (Pierce, Rokfordas, Ilinojus, JAV).

transfekcijq

Pasaulis-29b /c imituoja /inhibitoriai ir neigiamus kontrolinius molekulės (peštynės kontrolė mimikos ir inhibitorius) buvo susintetinti ir išgrynintas GenePharma Company (Šanchajus, Kinija). Sekos, parodytos S2 lentelėje. Jie buvo transfekuota į ląsteles, kurio galutinė koncentracija yra 50 nm, naudojant Lipofectamine-2000 transfekcijos reagento (Invitrogen, Carlsbad, USA) pagal gamintojo protokolą. Vidutinės buvo pakeistas po 6 valandų. Ląstelės buvo kultivuojamos 48 valandas ir nuimami analizei. Procentas transfekcija efektyvumas lėmė iš PPN-29b /c raiškos lygių vertinimo ar triuškinantis po transfekcija (S1A ir S1B pav). Dėl steigimo DNMT3A stabilius triuškinantis ląsteles protokolas buvo aprašyta mūsų ankstesniame darbe [25]. Iš DNMT3A išraiška labai sumažėjo per BGC-shDNTM3A ir AGS-shDNTM3A ląstelių (S1C pav), palyginti su kontrolinių ląstelių.

žaizdų gijimą, migracijos ir invazija tyrimai

Mobilusis mobilumas buvo atliktas žaizda gydymo tyrimas analizė, kaip aprašyta anksčiau [26]. Įbrėžimams žaizda buvo sukurtas naudojant 200 iL pipetės galiuką apie susiliejantis ląstelių monosluoksnių į šešių duobučių lėkštelėse. Po to ląstelės buvo plaunamas šviežią terpę pašalinti plūduriuojančius ląsteles, ir buvo stebimas iš žaizdų uždarymui plitimą po 48 valandų ir fotografuojami pagal mikroskopu. Dėl migracijos ir invazija į perkeltų ląstelių potencialas buvo įvertintas pagal Transwell tyrimu. Ląstelės buvo auginamos iki 70% santakoje ir transfekuota už 24 valandų su miR-29B /c imituoja arba kontrolės imituoja, ir miR-29b /c inhibitorius arba kontrolė inhibitorius. Į migracijos tyrimo, ląstelės buvo auginamos į 200 ml terpėje su 1% vaisiaus galvijų serumo viršutiniame kameroje ne dengtos transwell įdėklu. Apatinėje kameroje, 600 ml vidutinės su 10% vaisiaus galvijų serumo buvo naudojamas kaip chemoattractant skatinti ląstelių migraciją. Invazija tyrime, viršutinė kamera iš transwell intarpais buvo padengtas su 50 ml 1,0 mg /ml Matrigel, ir ląstelės buvo padengtą viršutiniame kameroje Matrigel dengtos transwell įdėklu (Millipore, JAV). Po 24 valandų inkubacijos ne migravimas ar ne užplūsta ląsteles švelniai pašalinti su medvilniniu tamponu. Visi iš ląstelių buvo dažomi 0,1% metilvioletinio dažymo ir skaičiuojami 5 laukai pagal apversto mikroskopu. Nepriklausomi bandymai buvo kartojamas tris kartus.

bisulfite genomo sekos "(BGS)

Genomo DNR buvo išskirta iš ląstelių, naudojant fenolio-chloroformo metodą. Bisulfite gydymas buvo atliktas pagal CpGenome Universal DNR modifikacija Kit (miliporų, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. PGR produktai bisulfito sekos buvo gelio valytas ir subklonuotas į pMD19-T vektoriaus sistema (Takara, Dalian, Kinija). Ne mažiau kaip dešimt kolonijos sekos buvo įvertinti metilinimo laipsnio ne kiekvieno CpG vietoje. Pradmenys yra išvardyti S2 lentelėje.

liuciferazės reporterio testą

už liuciferazė reporterio testą protokolas buvo aprašyta anksčiau [14]. Žmogaus DNMT3A 3'UTR buvo PGR sustiprina ir klonuotas tarp ne aš ir Xba I svetainėse PGL-3 (Promega, JAV). Į BGC-823 ląstelės buvo padengtas esant 5 × 10 ^{5 proc pat tankio 12 šulinėlių plokštelės prieš pat transfekcija. Ląstelės buvo pernešta su PGL-3 Firefly luciferase žurnalistais (1μg už gerai), PRL-TK (50 ng už gerai) ir Pasaulis-29 imituoja /inhibitorius (50 nm) arba neigiami kontroliniai imituoja /inhibitoriai (50 Nm), naudojant Lipofectamine- 2000 transfekcija reagentas (Invitrogen, Karlovi Varai, JAV) pagal gamintojo protokolą. Liuciferazė veikla buvo išbandyta 48 valandas po transfekciją naudojant dvejopo liuciferazės veiklos tyrimo sistema (PROMEGA, JAV). Visi eksperimentai buvo atliekami kaip trijų nepriklausomų lygiagrečių.}

Statistinė analizė

nepriklausoma Studento , T
-test buvo naudojamas palyginti rezultatus, kurie pateikiami kaip vidurkis ± SD tarp bet kurių dviejų iš anksto pasirinktuose grupes. Norėdami nustatyti koreliacijas tarp kintamųjų, "Pearson
koreliacijos koeficientas buvo apskaičiuotas. P
-Pridėtinės mažiau nei 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas.

Rezultatai

Pasaulis-29b /c reikalingas ir pakankamas GC ląstelių migracijos

Ankstesni tyrimai leidžia manyti, kad Pasaulis-29b /c yra kritinė GC ląstelių invaziją. Išsamiau įvertinti, ar Pasaulis-29b /c yra atsakingas už GC ląstelių migracija, naudojant , buvo atliktas in vitro
įbrėžimams žaizdų gijimą tyrimas ir Transwell tyrimas. Po laikinai transfekuoja Mir-29b /c imituoja arba neigiamą kontrolę į BGC-823 ląstelių, žaizda gydomųjų tyrimą paaiškėjo, kad ląstelės su priverstinio išraiškos PPN-29b /c demonstravo ypač lėtesnį atsigavimą, palyginti su kontrolinių ląstelių (pav 1A). Be to, Transwell migracija analizė parodė, kad miR-29b /c raiškos buvo susijęs su žymiai mažiau migracijos nei kontrolės ( P
< 0,05, pav 1B). Be to, dera su kitais duomenimis HGC-207 ir MSV-803 GC ląstelių [14], Mir-29b /c raiškos ląstelės taip pat atskleidė, kad gerokai sumažėtų invazinės gebėjimas Matrigel invazijos tyrimas ( P
< 0,05, pav 1C). Šie rezultatai rodo, kad miR-29b /c yra ne svarbu tik GC ląstelių invazijos bet taip pat dėl ​​ląstelių migracija. Siekiant dar labiau patvirtina slopinimas PPN-29b /c apie GC ląstelių migracijos ir invazijos, BGC-823 ląstelės buvo laikinai perkeltų su Mir-29b /c inhibitoriais arba neigiama kontrole. Iš miR-29b išbraukta /C gerokai padidėjo migracijos ir invazinių galimybes GC ląstelių, kurios buvo įvertintas žaizdų gijimą (pav 1D) ir Transwell tyrimo ( P
< 0,05, pav 1E ir pav 1F). Bendrai, šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-29b /c efektyviai panaikinta GC ląstelių migraciją ir invazija, kuri todėl prisidėjo prie ankstyvosiose stadijose piktybinės progresavimo GC.

DNMT3A yra tiesioginis transkripcijos tikslas miR-29b /c GC

Jei suprasti mechanizmo, lemiančio Pasaulis-29b /c apie ląstelių migracija ir invazijos poveikį, mes ištirti PPN-29b /c tikslus. DNMT3A 3'UTR papildo Pasaulis-29b /c ir yra tiesioginis taikinys genas Pasaulis-29b /c, todėl mes atlikti reporterio testą į BGC-823 ląstelių. DNMT3A iRNR 3'UTR buvo įtraukta į vartotojų regione liuciferazės reporterio geno iš PGL-3 vektorius (ty DNMT3A 3'UTR-Luc). Tuomet konstruktai buvo cotransfected su PRL-TK ir Mir-29B /c imituoja ar neigiamų kontrolinių imituoja į BGC-823 ląstelių. Kaip parodyta Fig 2A, santykinis liuciferazės veikla buvo žymiai sumažėjo PGL-3 vektorių su DNMT3A 3'UTR srities ( P
< 0,05). Tačiau konstruktai cotransfected su Mir-29b /c inhibitorių neturėjo įtakos liuciferazės aktyvumą PGL-3 vektorių su DNMT3A 3'UTR srities, palyginti su konstruktų cotransfected su neigiamu kontroliniu inhibitorių (pav 2b). Siekiant dar labiau patvirtina šį Mirna-tikslinę sąveiką, kiekybinė PGR (KRL-PGR) ir Vakarų dėmės buvo atliekami siekiant patvirtinti DNMT3A reguliavimą Pasaulis-29b /c. Mes laikinai perkeltų Mir-29b /c imituoja ar neigiamus kontrolinius imituoja į BGC-823 ląstelių. Padidėjęs Pasaulis-29b /c sumažino DNMT3A išraišką tuo mRNR (pav 2C) ir baltymų koncentracijos (pav 2E lane1-3). Priešingai, Mir-29b /c žemyn reguliavimo pagal savo inhibitorius padidino DNMT3A išraišką tuo mRNR (pav 2D) ir baltymų koncentracijos (pav 2E lane4-6). Bendrai, šie rezultatai rodo, kad DNMT3A yra tiesioginis transkripcijos tikslas Pasaulis-29b /c ir neigiamai susijęs su Pasaulis-29b /c raiškos GC ląsteles.

Pasaulis-29b /c slopina DNMT3A A DNR metilinimas priklausomu būdu

Kadangi netipinė hypermethylation yra labai svarbus Mirna žemyn reguliavimo, mes spėliojo, kad neigiamas grįžtamasis ryšys egzistuoja tarp Pasaulis-29b /c ir DNMT3A. Norėdami patikrinti šią hipotezę, kad CpG salos metilinimo buvimas Mir-29b /c promotoriaus regione buvo įvertintas pagal BGS analizė DNMT3A-triuškinantis ląsteles. Kaip parodyta Fig 3A, 7 atskirus CpG vietose esantys CpG salų regionuose (5 kb prieš srovę miR-29b /c) sekos buvo nustatyti metilintuose citozino likučių. Iš Pasaulis-29b /c promotoriaus metilinimo į DNMT3A-triuškinantis ląstelių dažnis buvo 34,2%, kuris buvo gerokai mažesnis nei kontrolinių ląstelių (58,6%; pav 3B). Šis rezultatas rodo, kad transkripcijos slopinimo miR-29b /C GC ląstelių yra susijęs su CpG salos hypermethylation, kurioje buvo patvirtinta matuojant brandus miR-29b /c atliekant KRL-PGR. Yra žymiai padidėjo Pasaulis-29b /c išraišką AGS-shDNMT3A ir BGC-shDNMT3A ląstelių, lyginant su jų kontrolę (pav 3c). Šie rezultatai rodo, svarbų molekulinį pagrindą miR29-b /c žemyn reguliavimą ir patvirtina hipotezę, kad yra kryžminio aptarimas tarp Pasaulis-29b /c ir DNMT3A.

DNMT3A skatina GC ląstelių migraciją

molekulinė ryšys tarp Pasaulis-29b /c ir DNMT3A iškėlė DNMT3A dalyvavimo GC ląstelių migracijos klausimą. Mes taip pat taikomi in vitro
tyrimus, atliekamus siekiant nustatyti funkcinius pokyčius ląstelių elgesį šiuos pakitusiu išraiška DNMT3A. Žaizda gydymo tyrimas parodė ypač lėtesnį atsigavimą į BGC-shDNMT3A ląstelių, lyginant su kontrolinių ląstelių (pav 4A, viršuje), bet tik kuklus atsigavimas AGS-shDNMT3A ląstelių, lyginant su kontrolinių ląstelių (pav 4A, apačioje). Šie rezultatai rodo, kad DNMT3A yra svarbu, kad ląstelių mobilumo. Atsižvelgiant į tai, kad ląstelių adhezijos molekulės yra svarbus ląstelių judrumui, kad CDH1 ir Vimentin išraiška išnagrinėjo KRL-PGR ir Vakarų dėmė. Nokdaunas iš DNMT3A išraiška žymiai padidino CDH1 išraiška tiek mRNR ir baltymų koncentracijos, tačiau neturėjo nepaprastą poveikį Vimentin (pav 4b ir 4c) išraiška, o tai rodo, kad CDH1 gali būti DNMT3A sąlygojamą disreguliacija ląstelės taikinio judrumas. Be to, mes atliko BGS tyrimą dėl CDH1 genu DNMT3A-triuškinantis ląsteles. Kaip parodyta pav 4D, iš metilo CpGs esančių CDH1 procentas buvo mažesnis DNMT3A-išeikvoti ląstelių negu kontrolinių ląstelių (35,8% vs 94,1%). Šie rezultatai rodo, kad nenormalus išraiška DNMT3A veda į epigenetinio nuslopinami iš CDH1.

Pasaulis-29b /c yra dalyvauja CDH1

slopinti toliau tirti pakeisti miR- poveikį 29b /c išraiška CDH1, mes laikinai perkeltų mir-29b /c imituoja ar neigiamos kontrolės imituoti į BGC-823 ląstelių. Palyginti su kontrole, priverstinio išraiškos PPN-29b /c žymiai padidino CDH1 išraiška tiek mRNR ir baltymų koncentracijos (pav 4e ir 4f). Vėliau metilinimas statusas promotoriaus regione CDH1 buvo tiriama naudojant BGS ištirtas Mir-29b /c imituoja ar neigiamos kontrolės imituoti laikinai perkeltų BGC-823 ląstelių. Rezultatai parodė, kad CDH1 promotoriaus metilinimo dažnis Mir-29B /c raiška ląstelių buvo 5,2% arba 12,9%, kuris buvo gerokai mažesnis nei lygis, matuojamas kontrolinių ląstelių (88,2%; pav 4G). Šie duomenys atitiko todėl DNMT3A nokdaunas tarpininkauja UP-reguliavimą CDH1 ir įrodo, kad de reguliavimas Pasaulis-29b /c ir DNMT3A dalyvauja GC ląstelių migracijos ir invazijos.

Sumažėjo išraiška Pasaulis-29b ir 29c Pasaulis-GC audinių

miR-29b /c išraiška 50 GC navikų ir suporuotas ne navikų audiniuose išnagrinėjo KRL-PGR. Palyginti su suporuotas ne-navikų audiniuose, miR-29b ir miR-29c dažnis down-regulation (apibrėžiamas kaip didesnis nei du kartus mažiau) buvo 66% (33/50) ir 60% (30/50), atitinkamai (pav 5A ir 5B). Iš miR-29b ir miR-29c vidutiniškai kartų kaita buvo žymiai mažesnis naviko audiniuose negu ne navikų audiniuose ( P
< 0,01, pav 5C ir 5D). Tirti klinikos reikšmę Mir-29B ir Pasaulis-29C raiškos modelių GC Tumorigenesis, buvo analizuojami klinikiniai požymiai GC pacientams. Visi 43 pacientų analizuojami buvo suskirstyti į dvi grupes pagal miR-29b ir 29c Pasaulis-ekspresijos lygį. Sumažėjęs Pasaulis-29b stipriai koreliuoja su naviko ląstelių diferenciacijos ir invazijos laipsnio, o sumažėjo MIR-29c tik susijusiam su naviko invazijos (1 lentelė). Be to, tarp Pasaulis-29b /c išraiška ir DNMT3A išraiškos santykiai buvo išbandytas 33 GC atvejais. Asociacija tyrimas parodė, kad DNMT3A išraiška buvo neigiamai koreliuoja su miR-29b ( R
= -0,640 P
< 0,01, pav 5E) ir Pasaulis-29c ( r
= -0,349 P
< 0,05, pav 5F). Bendrai, šie duomenys rodo, kad Pasaulis-29b /c gali vaidinti svarbų vaidmenį skrandžio kancerogenezėje progresavimą.

Diskusijos

užkonservuoti Pasaulis-29 šeimos, įskaitant miR-29A, miR- 29b ir 29c Pasaulis-yra susijęs keliomis rūsio procesų, pavyzdžiui, platinimo, diferenciacija, apoptozės ir metastazių, todėl juos gerai išanalizuoti šeimos miRNAs į tumorigenesis [16]. Ankstesni tyrimai parodė, kad padidėjo išraiška PPN-29a yra susijęs su geresnių bendrų išgyvenimo etape II žarnos vėžiu sergantiems pacientams [27], ir žemesnio lygio PPN-29b galėtų skatinti prostatos vėžio metastazių reguliuojant epitelio-mezenchiminių signalizavimas kelius [28] , Be to, PPN-29C veikia kaip metastazių slopintuvas, kuris slopina plaučių vėžio ląstelių sukibimą su tarpląsteliniame ir migracijos in vitro parsisiųsti ir vivo
[29]. GC, žymiai sumažino lygius PPN-29b ir miR-29c, visų pirma, buvo pastebėta, palyginti su miR-29a [14], o tai rodo, kad Pasaulis-29b /c gali vaidinti svarbesnį vaidmenį. Taigi, PPN-29b /c buvo pasirinkta analizuoti šiame tyrime. Šioje studijoje, mes parodė padidėjusį Pasaulis-29b /c slopina migracija ir invazija BGC-823 ląstelių naudojant žaizdų gijimą tyrimą ir Transwell tyrimą. Šie rezultatai sutampa su kitų pateikiamų duomenų, gautų iš SGC-7901, HGC-27 ir MSV-803 GC ląstelių [14, 15]. Atsižvelgiant į tai, kad Pasaulis-29b /taip pat c žaisti vaidmenis ginklo platinimo ir apoptozės GC, mes įvertino ląstelių augimą gebėjimus ir ląstelių apoptozės lygį BGC-823 ląstelių. Rezultatai parodė, kad nėra platinimu skirtumas 48 valandų Mir-29B /c imituoja arba inhibitoriai-Transfekuoti ląstelių, lyginant su neigiamos kontrolės ląstelių ( P
> 0,05, S2A ir S2B pav). Be to, aneksinas-V "dažymo neparodė dramatišką padidėjimas apoptozę Mir-29b /c imituoja-perkeltų ląstelių kiekis po 48 valandų inkubacijos (S2C pav). Be to, ląstelės ciklo analizė neparodė jokių reikšmingų skirtumų G1, S G2 /M etapai po gydymo Mir-29b /c imituoja arba neigiamas kontrolės imituoja 48 valandas ( P
> 0,05, S2D pav). Šie duomenys rodo, kad Pasaulis-29b /c lėtina žaizdų zona atkūrimo 48 valandų daugiausia dėl sumažėjusio ląstelių judrumą sugebėjimus.

miRNAs daryti savo funkcijas daugiausia nukreipti skirtingų genų 3'UTRs. Tačiau išsamios molekulinius mechanizmus PPN-29b /c, susiję su piktybiniu GC plėtros yra sunkiai suprantamas. Pažymėtina, PPN-29b /c dalijasi ta pačia papildomumas į svetaines į DNMT3A 3'UTR srities, kuri buvo prognozuojama pagal tikslines prognozavimo programas, įskaitant TargetScan, Miranda ir miRBase. Ji dar nėra žinoma, ar miR-29b /c reguliuoja nenormalus metilinimą genų, susijusių su metastazių sąveikaudami su DNMT3A per GC vystymosi. Todėl mes atlikome liuciferazės reporterio testą ir nustatė, kad didelė DNMT3A išraiška buvo susijęs su žema Pasaulis-29b /c raiškos GC ląstelių, nurodant DNMT3A yra tiesioginis transkripcijos tikslas Pasaulis-29b /c. Tačiau, molekulinė pagrindas, kuris veda į miR-29b disbalanso /C GC lieka nežinomas. Pasaulis-29 artimieji vykdytojai turi privalomus svetaines kelių transkripcijos faktorių, tokių kaip C-Myc ir CEBPA, kurie prisideda prie Mir-29 [30, 31] dereguliavimo. Tačiau tyrimų apie epigenetinio reguliavimo Mirna-29 nebuvo pranešta.

eukariotinių ląstelių, yra trys fermentais aktyvių DNR metiltransferazių (DNMTs), DNMT1, DNMT3A ir DNMT3B. Iš DNMT3A išraiška GC yra žymiai didesnis nei DNMT3B [32, 33]. Be to, tik padidėjo DNMT3A išraiška reikšmingai susijęs su trumpesniu ligos reiškinių išgyventas laikotarpis GC [34], kuris rodo DNMT3A vaidina svarbesnius vaidmenis skrandžio kancerogenezėje. Taigi, siekėme ištirti, ar neigiamas-Grįžtamasis ryšys Nuostatai egzistuoja tarp Pasaulis-29b /c ir DNMT3A. Šiame tyrime mes panaudojome BGS tyrimą analizuoti DNR metilinimo statusą Pasaulis-29b /C DNMT3A RNRi GC ląsteles. Iš tiesų, sumažėjo Pasaulis-29b /c buvo iš dalies dėl to, DNMT3A sąlygojamą hypermethylation. Be to, mes patvirtino, kad DNMT3A dalyvauja skatinant GC ląstelių migraciją per apačią reguliavimo CDH1. Tuo tarpu, mes taip pat parodė, kad miR-29b /c yra dalyvauja CDH1 slopinimo. Vėžio metastazių bruožas yra CDH1 išraiška [35] ir hypermethylation nuostoliai per CDH1 promotoriaus regione taip pat pastebėtas GC [36]. Taigi, mūsų rezultatai rodo, kad tiek Pasaulis-29b /c ir DNMT3A yra susiję su CDH1 down-regulation per DNMT3A tarpininkaujant promotoriaus hypermethylation. Kitų DMNTs vaidmuo, pavyzdžiui, DNMT3B, reguliuojant MIR-29b /c turi būti nagrinėjamos būsimose studijose.

GC egzempliorių, mes išnagrinėjo išraiška modelio Pasaulis-29b /c 50 porų GC audiniuose. Sumažėjęs Pasaulis-29b /c dalis (sofa-keitimas Apipjaustymas: 2.0) buvo reikšmingai koreliuoja su diferenciacijos ir invazijos laipsnis GC, rodo, kad Pasaulis-29b /c vaidina lemiamą vaidmenį GC piktybinės priežiūra ir tiesiogiai rodo klinikinė reikšmė PPN -29b /c GC progresavimą. Apibendrinant, mūsų tyrimas rodo, kad gali būti kryžminio aptarimas tarp Pasaulis-29b /c ir DNMT3A. Iš šių veiksnių pusiausvyros gali dalyvauti GC migracijos ir invazija fenotipų. Šis neatitikimas gali būti žemo lygio išraiška Pasaulis-29b /c gali panaikinti slopinimo DNMT3A ir aukšto lygio DNMT3A toliau veikia PPN-29b /c išraiškos epigenetinio mechanizmą. Šie duomenys gali būti naudingas dėl naujų gydymo galimybių plėtros GC šį tikslą Pasaulis-29B /C ir jos tolesnis genų DNMT3A.

Parama Informacija
S1 paveiksle. Procentinis transfekcija efektyvumas buvo pateikta vertinimo lygių PPN-29b /c ar DNMT3A.
(A ir B) KRL-PGR buvo atliekama siekiant nustatyti santykinę išraišką PPN-29b /C bgc-823 ląstelių su imituoja (A) arba inhibitoriai (b) po 48 valandų transfekciją. (C), AT-PGR ir Vakarų dėmės buvo atliekama siekiant aptikti DNMT3A triuškinantis į bgc ir AGS ląstelių efektyvumą. β
-actin buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolę
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s001
(TIF)
S2 pav. Iš miR-29b /c į BGC-823 ląstelių proliferaciją, apoptozė ir ląstelės ciklo vaidmuo.
(A) ląstelių augimo tempai PPN-29b /c raiškos buvo aptikta CCK-8 proliferacijos tyrimu. Pasaulis-29b /c raiškos neparodė reikšmingas skirtumas 48 valandas, palyginti su neigiamų kontrolinių ląstelių ( P
> 0,05). (B) ląstelių augimo tempai PPN-29b /c slopinimas buvo aptikta CCK-8 proliferacijos tyrimu. Iš Pasaulis-29b /c slopinimas neparodė jokių reikšmingų pokyčių per 48 valandas, palyginti su neigiamų kontrolinių ląstelių ( P
> 0,05). (C) Apoptozę tyrimas rodo ne dramatišką sukeliama apoptozė pagal Pasaulis-29b /c raiškos 48 valandas, palyginti su neigiamų kontrolinių ląstelių. Biparametric histograma rodo ląstelių anksti (apatiniame dešiniajame kvadrante) ir vėlai apoptozinių narių (viršutiniame dešiniajame kvadrante). (D) ląstelės ciklo tyrimas buvo atliekamas pagal tėkmės citometrijos ant BGC-823 ląstelių po Pasaulis-29b /c imituoja ar neigiamos kontrolės imituoja gydymą 48 valandas. MiR-29B /c raiškos ar kontrolės ląstelių G1 procentai, S, ir G2 /M yra parodyta diagramą kaip vidutinis ± s.d. iš trijų nepriklausomų eksperimentų. Lyginant su kontrolinės ląstelių, nebuvo reikšmingo poveikio ląstelės ciklo po Pasaulis-29b /c raiškos
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s002
(TIF)
S1 metodas. Ląstelių augimą ir apoptozė tyrimas
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s003
(DOC)
S2 metodas. . Ląstelės ciklo analizė
Doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s004
(DOC)
S1 lentelė. Klinikiniai požymiai pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s005
(DOC)
S2 stalo. . Mirna mimikos ir inhibitorius sekų ir gruntai naudojami šiame tyrime
Doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s006
(DOC)

Padėka

Mes dėkojame dr gauja chen iš Nanjing Jiangning ligoninės mėginius renkant. Dėkojame prof Sheng Zhong iš sostinės medicinos universiteto padėti keisti rankraštį.

• PLoS ONE: Chrysin slopina auglio Promoter sukeltos MMP-9 raiška blokuoja AP-1 per slopinimas ERK ir JNK kelius skrandžio vėžys Cells
• PLoS ONE: poveikis Helicobacter pylori ekspresijos Lygiai FHIT, IL-8 ir P73 skrandžio gleivinėje pirmos eilės giminių skrandžio vėžys Patients