PLOS NËMMEN: Dereguléierung tëscht Mir-29b /c an DNMT3A Ass mat Epigenetic Silencing vun der CDH1 Gene Associéierten, déi Zell Migratioun a Missiounen an Gastric Cancer

Wat VerfÜgung

D'de-Regulatioun vun der Raumstatioun-29 Famill an DNA methyltransferase 3A (DNMT3A) ass mat gastric Kriibs (GC) assoziéiert. Iwwerdeems Beweiser waarden bedeit Mir-29b /c konnt DNA methylation vun gezielt DNMT3A regléieren, ass et am Moment onbekannt wann epigenetic silencing vum Mir-29b /c via Promoteur hypermethylation am GC vun Manque Ausdrock vun DNMT3A ëmmer ass. Sou, fir mir ze diskutéieren, ob Kräiz-Diskussioun Regulatioun tëscht Mir-29b /c an DNMT3A an ob et mat enger malignant phenotype am GC verbonnen ass. Éischt, Teamchef Meter Heelung a Transwell assays dass Mir-29b /c entholl Metastasen am GC Hien. A luciferase reporter assay bewisen, dass DNMT3A engem direkten Zil vum Mir-29b /c ass. Mir benotzt bisulfite Frankräich sequencing der DNA methylation Status vum Mir-29b /c ze analyséieren. De Prozentsaz vun methylated CpGs war ofgeholl bedeitend an DNMT3A-do ass Zellen am Verglach zu den Kontrollen. Doriwwer eraus, war d'Bedeelegung vun DNMT3A doran GC Zell Migratioun mat de Promoteur methylation-mediated Repressioun vun CDH1 assoziéiert. Am 50. vläit Medeziner uplanzen GC Otemschwieregkeeten, ofgeholl Mir-29b /c vill mat den Ofschloss dat an Invasioun vun den Zellen soll war a war negatif mat DNMT3A Ausdrock soll. Zesumme, proposéiere eis virleefeg Resultater dass de folgenden Prozess zu GC tumorigenesis Équipe kann. Mir-29b /c Hien der afgerappt Gentherapie DNMT3A, an am Tour, Mir-29b /c ass vun DNMT3A zu engem DNA methylation-ofhängeg Manéier opgeléist. Der de-Regulatioun vun béiden Mir-29b /c an DNMT3A féiert zu der epigenetic silencing vun CDH1 an dréit zu der Metastasen phenotype am GC. Dëst brengt verréid eis, datt DNA methylation-verbonne silencing vum Mir-29b /c fir GC Entwécklung kritesch ass an domat eng therapeutesch Zil- kënnen VerfÜgung

Fro:. CUI H, Wang L, Gong P, Zhao C, Zhang S , Zhang K, et al. (2015) Dereguléierung tëscht Mir-29b /c an DNMT3A Ass mat Epigenetic Silencing vun der CDH1 Gene Associéierten, déi Zell Migratioun a Missiounen an Gastric Cancer. PLoS NËMMEN 10 (4): e0123926. Doi: 10.1371 /journal.pone.0123926 VerfÜgung

Akademesch Redakter: Rajeev Samant, Universitéit vun Alabama op Birmingham, USA VerfÜgung

Arnaque: 4 September 2014; Akzeptéiert: 9 Mäerz 2015; Publizéiert: April 15, 2015 VerfÜgung

Copyright: © 2015 CUI et al. Dëst ass eng oppen Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz CC BY verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt si vum original Auteur an d'Quell Kaiser VerfÜgung

Data Disponibilitéit: All Daten sinn bannent de Pabeier a seng Ennerstëtzung Informatiounen Fichieren VerfÜgung

Funding:. Dës Aarbecht vun der National Natural Science Foundation of China (Grant Nr 81171915, Nr 91229107 an Nr 81472548), http ënnerstëtzt gouf: //www .nsfc.gov.cn /. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung

Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

Gastric Kriibs (GC) ass déi zweet Équipe fatale weltwäit malignancy. Et Konte fir eng total vu ronn 1 Millioun neie Fäll an 0,7 Milliounen Doudesfäll all Joer, iwwer 70% vun deem vun den Entwécklungslänner geschéien, besonnesch am Osten asiatesch Länner [1]. Obwuel curable wann fréi erwëscht, sinn déi meescht GC Patienten mat spéiden Etapp Krankheet diagnostizéiert. Fir Patiente mat operable Krankheet, si konventionell Agrëff an Kombinatioun Chimioen uginn. Allerdéngs ass de globale 5-Joer Iwwerliewe Taux vun GC Patienten manner wéi 30% [1, 2]. Gëlt, ass GC oft vun peritoneal Verbreedung an Metastasen ze regional lymph Wirbelen a wäiter Uergel duerch lymphatic an Schwächt kritt [3] begleet. Soumat kënnen molekulare geometrescher Figur vun GC Erkenntnesser verbesseren eisem Verständnis vun gastric carcinogenesis an hëllefen eis Patienten an biologically a klinesch relevant subgroups subdivide, souwéi Roman therapeutesch Strategien entwéckelen. VerfÜgung

MicroRNAs (miRNAs) sinn eng Klass vu endogenous, inhibiting Iwwersetzung oder Pinguin mRNA ofgeschnidden duerch huel Accord mat der untranslated Regioun (3'UTR) vun Zil- Messenger RNAs (mRNAs) [4] "3 kleng, Net-coding reglementaresche RNAs vun ongeféier 20-25 nucleotides déi negatif vun der Gentherapie Ausdrock regléieren. Verännert Ausdrock Niveau vun miRNAs goufen an ville Cancers an Resultat vun aberrant Ausdrock vun Zil- Genen gemellt dass malignant gelooss Afloss, wéi Prolifératioun, Resistenz ze apoptosis an Metastasen [5-7]. Méi Beweiser weist dass dereguléierte miRNAs (zB, Mir-17, Mir-129, Mir-148a, a Mir-378) bis gastric carcinogenesis bäidroen [8-10], déi weisen, dass miRNAs als diagnostic an prognostic biomarkers am GC benotzt ginn . VerfÜgung

D'engem conserved Famill vun miRNAs ass Mir-29 Famill (Mir-29s) dass Mir-29a /b /c ëmfaasst. Ofgeholl Ausdrock vu Mir-29s huet an Multiple Cancers beschriwwe ginn, dorënner GC [11-14]. Virdrun Studie weisen dass Mir-29s eng dominant Roll an GC Zell Prolifératioun Leeschtung, Zell Zyklus Werdegang, apoptosis, an Zell motility [14, 15]. Potential Ziler vum Mir-29s fir den malignant GC phenotype Contributioun och Cdc42, CCND2, an MMP2 [14, 15]. Zousätzlech, hunn e puer Studien Mir-29s als Bäitrag zu der Regelung vun DNA methylation identifizéiert vun DNMT3s zu haett Kriibs [13] gezielt. Ausserdeem, verschidden Zil- Genen, wéi TCL-1, CDK6, laminin-1, an MCL-1, hunn och an anere Kriibs [16] gemellt ginn. Virun allem, trotz Beweiser miRNA-29s Musiktherapie- kann als entholl-suppressor Genen Funktioun, eng wichteg Fro, déi zu miRNA-29s Ausdrock bleiwen nach deelweis ongeléister. Wat sinn d'Mechanisme vun der Kontroll vun miRNA-29s Ausdrock am GC Zellen? Et ass confirméiert ginn, dass c-Myc zu Mir-29a /b Repressioun Équipe ass [17]. Identifikatioun Mechanismen zousätzlech Ennerdréckung ass vun Interessi. VerfÜgung

Et ass bekannt, datt d'transcriptional silencing vun entholl suppressor Genen (TSGs) vun CpG Insel hypermethylation eng gemeinsam Markenzeeche vun carcinogenesis ass. Spannen, ähnlech zu FAQ-coding TSGs, sinn eng substantiell Zuel vun miRNAs vum Promoteur methylation reegelen [18-20]. Iwwerhaapt, et huet domatten eng Erhéijung vun der Zuel vun de Studien ass, datt entholl suppressor miRNAs, wéi Mir-34b, Mir-129, an Mir-124, sinn dacks duerch DNA methylation am GC entsat [21-23]. Baséiert op der CpG Island Searcher Programm Analyse, huet eis Cepheid datt miRNA-29b /c enthält CpG Inselen an hirem putative Promoteur Regiounen. Mä, ass et nach net kloer, ob aberrant DNA hypermethylation fir d'dysregulation vum Mir-29b /c Konten. Ausserdeem, ass dat onbekannt ob e Feedback Regulatioun tëscht Mir-29b /c an DNMT3s. An Tatsaach, huet kee virdrun Etude der methylation Status vum Mir-29b /c zu GC Zellen iwwerpréift, an keent hunn d'Relatioun tëscht der methylation vum Mir-29b /c an Niveau vun Ausdrock vun DNMT3s lant. An dëser Etude, hunn mer dat Mir-29b /c den Ausdrock vun DNMT3A vun gezielt seng 3'UTR opgeléist, déi zu inhibiting GC Zell Wanderung an Invasioun bäigedroen. Wéinst dem DNMT3A verwandelt-reegelen Mir-29b /c via aberrant hypermethylation vum Promoteur. Sou, existéiert e Potential Feedback Glück tëscht Mir-29b /c an DNMT3A, an deem d'verwandelt-Regulatioun vum Mir-29b /c d'Ennerdréckung vun DNMT3A abolishes. Mëttlerweil, schellt der up-Regulatioun vun DNMT3A den Ausdrock vun Mir-29b /c vum Promoteur methylation. Dës Conclusiounen proposéiere engem Kräiz-Diskussioun tëscht Mir-29b /c an DNMT3A. Hir Desequiliber an Dereguléierung ass opgrond vun engem epigenetic Mechanismus, datt am GC Zell Wanderung an Invasioun Charakteristiken Équipe kann. VerfÜgung

spontan a Methode VerfÜgung

Zell Kultur VerfÜgung

GC Zell Linnen, dorënner AGS an BGC-823, sech aus der Zell Bank vun de Chinese Academy vu Wëssenschaft an haten an RPMI-1640 mëttelfristeg ergänzt mat 10% an et Bovine serum (Invitrogen, Karlsbad CA), 100 u /ml vun penicillin an 100 mg kritt /ml streptomycin (Invitrogen, Karlsbad CA) an engem humidified incubator mat enger 5% CO _{2 Ambiance bei 37 ° C. VerfÜgung}

Ray Echantillon VerfÜgung

50 Puer GC Stoffer an hir bascht Net-kriibserreegend Otemschwieregkeeten uplanzen sech tëscht 2011 an 2013 vun der Jiangning Hospital vun Nanjing gesammelt. D'Medeziner Informatioun vun de Patienten mat GC ass am S1 Table gewisen. D'Etude gouf vun de Komitee fir ethneschen Bilan vun Fuerschung an der Jiangning Hospital vun Nanjing a China guttgeheescht, an d'Patiente Awëllegung Formen ënnerschriwwen. All déi Otemschwieregkeeten Echantillon waren aus Patienten mat GC kritt. Si goufen während Agrëff gesammelt an direkt an flëssegem Stéckstoff bis RNS an FAQ Extraktioun gefruer briechen. VerfÜgung

Réckproduktioun Transkriptiouns Reaktioun a grouss real-Zäit Hinnen alleguer (qPCR) VerfÜgung

Total RNS war vun der Zellen ofgebaut a Stoffer recoltéiert benotzt Trizol reagent (Invitrogen, Karlsbad CA) laut der Uweisunge d'Hiersteller. VerfÜgung

fir miRNA Ausdrock, engem Desaccord-Glück RT-Hinnen alleguer war standing entdecken wéi virdrun [24] beschriwwen, an U6 kleng RNAs sech wéi eng intern Kontroll benotzt. qPCR war mat SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, China) duerchgefouert no de Protokoll d'Hiersteller. Der relativer Ausdrock war vun der Komparativ CT Method bewäert. D'primer Message vun all Gene sinn zu S2 Table gewisen. VerfÜgung

Western blot VerfÜgung

Western blots sech mat Anti-DNMT3A (Abcam, Cambridge, UK) gesuergt, anti-CDH1 (Abcam, Cambridge, UK), anti-Vimentin (Santa Cruz déi, Santa Cruz, CA, USA) an anti β VerfÜgung -actin antibodies (Fläch, Ronkonkoma, NY, USA), a erkennen war mat Super Signal chemiluminescence Realitéiten gesuergt (Pierce, Rockford, IL, USA). VerfÜgung

Transfection VerfÜgung

Mir-29b /c mimics /inhibitors an negativ Kontroll Molekülle (Alaister Kontroll rescht an inhibitor) waren Wierderbuch a sidd vun der GenePharma Company (Shanghai, China). De Message sinn zu S2 Table gewisen. Si waren op eng final Konzentratioun vun 50 nm an d'Zellen transfected benotzt Lipofectamine-2000 transfection reagent (Invitrogen, Karlsbad, USA) laut den Hiersteller d'Protokoll. Déi mëttel- war no 6 Stonnen geännert. D'Zellen sech fir 48 Stonnen cultured a fir Analyse recoltéiert. D'Prozent transfection Effizienz war duerch eng Evaluatioun vun den Niveau vum Mir-29b /c Ausdrock oder knockdown folgenden transfections (S1A an S1B Lalumi) alles. De Protokoll fir mise der DNMT3A stabil knockdown Zellen gouf zu eiser leschter Aarbecht [25] beschriwwen. Den Ausdrock vun DNMT3A ofgeholl Trainer an der BGC-shDNTM3A an AGS-shDNTM3A Zellen (S1C Lalumi) am Verglach zu der Kontroll Zellen. VerfÜgung

Meter verkënnegt, Migratioun an Invasioun assays VerfÜgung

Zell Mobilitéit ënnerworf gouf zu d'Wonn verkënnegt assay Analyse wéi virdru beschriwwen [26]. E Null Meter war eng 200 μl Pipette Tipp op d'Spuenien wär Zell monolayers zu sechs-gutt Placke generéiert benotzt. D'Zellen sech dann mat frëschen mëttelfristeg Katakombe Wénkel gekäppt Zellen ze läschen, an d'Verbreedung vun der Wonn Zoumaache war no 48 Stonnen an fotografeschen ënnert engem microscope observéiert. D'Potential fir Migratioun a Invasioun vun der transfected Zellen sech vun engem Transwell assay bewäert. D'Zellen sech mat der Mir-29b /c mimics oder Kontroll mimics, a Mir-29b /c inhibitor oder Kontroll inhibitor fir 24 Stonnen op 70% Niewebaach an transfected ugebaut. An der Migratioun assay, goufen d'Zellen cultured zu 200 ml mëttelfristeg mat 1% An et Bovine serum an der ieweschter ëmkomm vun engem Net-Beschichtete transwell opginn. Am ënneschten ëmkomm, 600 ml mëttelfristeg mat 10% An et Bovine serum war als chemoattractant benotzt Zell Migratioun ze encouragéieren. An der Invasioun assay, waren der ieweschter ëmkomm vun der transwell Text mat 50 ml vun 1.0 mg /ml Matrigel bedeckt, an d'Zellen sech an der ieweschter ëmkomm vun der Matrigel-Beschichtete transwell g (Millipore, USA) plated. No 24-Stonne incubation, goufen d'Net-wanderen oder Net-hypothetesch Zellen verbannen mat engem Koteng Swab geläscht. All vun den Zellen sech an 5 Felder ënnert en Inverted microscope mat 0,1% glaskloer mauve staining a gezielt Kierchefënster. Déi onofhängeg Experiment dräi Mol widderholl. VerfÜgung

Bisulfite Frankräich sequencing (BGS) VerfÜgung

Frankräich DNA war vun der Zellen ofgebaut der phenol-chloroform Method benotzt. Bisulfite Traitement war vun der CpGenome Universal DNA Verännerung Kit (Millipore, USA) folgenden Fabrikant d'Instruktioune gesuergt. Hinnen alleguer Produiten fir bisulfite sequencing waren gelies-sidd an subcloned an enger pMD19-T Vecteure System (Takara, Dalian, China). Op d'mannst zéng Kolonien huet Nepgen den Ofschloss vun methylation bei all CpG Site ze bewäerten. D'primers sinn zu S2 Table opgezielt. VerfÜgung

Luciferase reporter assay VerfÜgung

De Protokoll fir de luciferase reporter assay huet virdru beschriwwen ginn [14]. D'3'UTR vum Mënsch DNMT3A war Hinnen alleguer-Kick an tëscht Net ech an Xba ech Siten vun pGL-3 (Promega, USA) gekloonten an. D'BGC-823 Zellen sech zu engem 12-Meter zappen pro gutt bei eng Dicht vu 5 × 10 5 plated virum transfections. D'Zellen sech mat pGL-3 Liichtkäfer luciferase gemellt transfected (1μg pro gutt), Praxis-TkLanguage (50 NG pro gutt) an Mir-29 mimics /inhibitor (50 nm) oder negativ Kontroll mimics /inhibitors (50 nm) benotzt Lipofectamine- 2000 transfection reagent (Invitrogen, Karlsbad, USA) no de Protokoll d'Hiersteller. Luciferase Aktivitéit war 48 Stonnen no der transfection mat der Dual-Luciferase Aktivitéit Assay System (Promega, USA) getest. All d'Experiment wéi dräi onofhängeg gefaart gesuergt. VerfÜgung

statistique Analyse VerfÜgung

Déi onofhängeg Student d' t VerfÜgung Azeton benotzt gouf de Resultater ze vergläichen, déi als mengen ± ausgedréckt ginn Fils tëschent all zwee preselected Gruppen. Ze bestëmmen kennenzeléieren tëscht der Verännerlechen, Pearson VerfÜgung senger Korrelatioun souguer gemaach berechent huet. A P VerfÜgung -value manner wéi 0,05 considéréiert gouf statistesch relevant. VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

Mir-29b /c ass néideg a genuch fir GC Zell Migratioun VerfÜgung

virdrun Studien préziséiert dass Mir-29b /c fir GC Zell Invasioun kritesch ass. Fir weider diskutéieren, ob Mir-29b /c fir GC Zell Migratioun responsabel ass, goufen eng kënschtlech VerfÜgung Null Meter verkënnegt assay an Transwell assay gesuergt. No transiently der Mir-29b /c mimics oder negativ Kontroll an d'BGC-823 Zellen transfecting, d'Wonn verkënnegt assay gewisen, datt d'Zellen mat de Batti Ausdrock vu Mir-29b /c engem gëlt lues Erhuelung am Verglach mat der Kontroll Zellen ugewisen (Lalumi 1A). Den Zerfall, huet de Transwell Migratioun assay datt d'overexpression vum Mir-29b /c mat däitlech manner Migratioun wéi d'Kontrollen verbonne war ( P VerfÜgung &Si besteet; 0,05, Lalumi 1B). Desweideren, konsequent mat aneren Date vun HGC-207 an MGC-803 GC Zellen [14], de Mir-29b /c overexpression Zellen verroden och en däitleche Minus am invasiv Fähegkeet an der Matrigel Invasioun assay ( P VerfÜgung &Si besteet; 0,05, Lalumi 1c). Dës Resultater hindeit, datt Mir-29b /c ass net nëmme wichteg fir GC Zell Invasioun mä och fir Zell Migratioun. Fir weider der suppressive Auswierkunge vum Mir-29b /c op GC Zell Wanderung an Invasioun confirméieren, goufen d'BGC-823 Zellen mat der Raumstatioun-29b /c inhibitors oder eng negativ Kontroll transiently transfected. D'Auteuren vun Mir-29b /c geklomme den Opbau an invasiv Capacitéite vum GC Zellen, déi vum Meter verkënnegt (Lalumi 1D) an engem Transwell assay ( évaluéieren war P VerfÜgung &Si besteet; 0,05, Lalumi 1E an Lalumi 1F). Erginn des Resultater weisen, datt Mir-29b /c effektiv GC Zell Wanderung an Invasioun ofgeschaf, déi also fir de Grondsteen vun der malignant Werdegang vun GC bäigedroen. VerfÜgung

DNMT3A engem direkten transcriptional Zil vum Mir-29b ass /c zu GC VerfÜgung

de Mechanismus ze verstoen den Effet vum mir-29b /c op Zell Wanderung an Invasioun Basisdaten, mir den Ziler vum mir-29b /c propagéieren. DNMT3A 3'UTR ass ergänzen ze Mir-29b /c an ass en direkten Zil- Gentherapie vum Mir-29b /c, also duerchgefouert mir eng reporter assay zu BGC-823 Zellen aus. D'DNMT3A mRNA 3'UTR war an der afgerappt Regioun vun engem luciferase reporter Gentherapie vum pGL-3 Vecteure (nämlech DNMT3A 3'UTR-Luc) gesaat. Déi gesond sech dann mat Praxis-TkLanguage an der Mir-29b /c mimics oder negativ Kontroll mimics nees BGC-823 Zellen cotransfected. Als zu Lalumi 2A gewisen, huet d'famill luciferase Aktivitéit vill zu der pGL-3 vectors mat der DNMT3A 3'UTR reduzéiert ( P VerfÜgung &Si besteet; 0,05). Allerdéngs, betreffen déi gesond mat der Raumstatioun-29b /c inhibitor cotransfected rauszesichen der luciferase Aktivitéit vun der pGL-3 vectors mat der DNMT3A 3'UTR Verglach zu der gesond mat den negativen Kontroll inhibitor (Lalumi 2B) cotransfected. Fir weider dëst miRNA-Zil- Interaktioun validéieren, grouss RT-Hinnen alleguer (qRT-Hinnen alleguer) a westlech blots sech standing d'Regulatioun vun DNMT3A vum Mir-29b /c confirméieren. Mir transfected transiently der Mir-29b /c mimics oder negativ Kontroll mimics an der BGC-823 Zellen. D'fräi Mir-29b /c Uschlossgoal DNMT3A Ausdrock um mRNA (Lalumi 2C) an FAQ Niveauen (Lalumi 2E, lane1-3). Ëmgedréit, fräi Mir-29b /c verwandelt-Regulatioun duerch seng inhibitor der DNMT3A Ausdrock um mRNA (Lalumi 2D) an FAQ Niveauen (Lalumi 2E, lane4-6). Zesummen, weg dëse Conclusiounen datt DNMT3A engem direkten transcriptional Zil vum Mir-29b /c ass an negativ mat Mir-29b /c Ausdrock am GC Zellen. VerfÜgung

Mir-29b /c vun DNMT3A ass opgeléist an enger assoziéiert ass DNA methylation-ofhängeg Manéier VerfÜgung

Well déi aberrant hypermethylation kritesch ass fir miRNA verwandelt-Regulatioun, spekuléieren mir dat negativ Réckkopplung tëscht mir-29b /c an DNMT3A. Fir dëst Hypothes Test, d'Präsenz vun CpG Insel methylation vun der Raumstatioun-29b /c Promoteur Regioun gouf vun engem BGS Analyse vun der DNMT3A-knockdown Zellen bewäert. Als zu Lalumi 3A gewisen, 7 eenzelne CpG Siten bannent der Insel Regiounen CpG (5 KB Offloss vum Mir-29b /c) sech methylated cytosine Reschter ze identifizéieren Nepgen. D'Frequenz vum Mir-29b /c Promoteur methylation zu DNMT3A-knockdown Zellen war 34,2%, déi wesentlech méi niddreg wéi d'Kontroll Zellen war (58.6%; Lalumi 3B). Dëst Resultat beweist dass der transcriptional silencing vum Mir-29b /c zu GC Zellen mat der Präsenz vun CpG Insel hypermethylation verbonnen ass, deen duerch Miessunge eeler Mir-29b /c vun qRT-Hinnen alleguer bestätegt gouf. Et war vill Mir-29b /c Ausdrock vun der AGS-shDNMT3A an BGC-shDNMT3A Zellen fräi Verglach mat hir Kontrollen (Lalumi 3C). Dës Conclusiounen weg eng wichteg molekulare Basis fir miR29-b /c verwandelt-Regulatioun an ënnerstëtzt d'Hypothes, datt et Kräiz-Diskussioun tëscht Mir-29b /c an DNMT3A. VerfÜgung

DNMT3A ënnerstëtzt GC Zell Migratioun VerfÜgung

d'molekulare Verbindung tëscht Mir-29b /c an DNMT3A konnten d'Fro vun DNMT3A Engagement am GC Zell Migratioun. Mir weider applizéiert kënschtlech VerfÜgung assays der funktionell Ännerungen am Zell gelooss folgenden verännert Ausdrock vun DNMT3A ze bestëmmen. D'Meter verkënnegt assay bewisen engem gëlt lues Erhuelung am BGC-shDNMT3A Zellen am Verglach mat der Kontroll Zellen (Lalumi 4A, Top), mee nëmmen e bescheidenen Erhuelung am AGS-shDNMT3A Zellen am Verglach mat der Kontroll Zellen (Lalumi 4A, ënnen). Dës Resultater weisen, datt DNMT3A fir Zell Mobilitéit wichteg ass. Well déi Zell Haftung Molekülle sinn wichteg fir Zell motility, den Ausdrock vun CDH1 an Vimentin sech duerch qRT-Hinnen alleguer a westlech blot iwwerpréift. Knockdown vun DNMT3A Ausdrock geklomme der CDH1 Ausdrock um souwuel mRNA an FAQ Niveauen, mä net eng aussergewéinlech Wierkung op den Ausdrock vun Vimentin (Lalumi 4B an 4C) hunn, suggeréiert datt CDH1 eng Zilscheif vun DNMT3A-mediated dysregulation vun Zell kann motility. Ausserdeem, duerchgefouert mir an der DNMT3A-knockdown Zellen e BGS assay op der CDH1 Gentherapie eraus. Als zu Lalumi 4D gewisen, war de Prozentsaz vun methylated CpGs bannent CDH1 läit manner an der DNMT3A-do ass Zellen wéi an der Kontroll Zellen (35.8% vs. 94,1%). Dës Resultater weisen, datt den Manque Ausdrock vun DNMT3A féiert zu enger epigenetic silencing vun CDH1. VerfÜgung

Mir-29b /c ass an dem Ophiewe vun CDH1 VerfÜgung Équipe

weider Fir den Effet vun verännert miR- ermëttelen 29b /c Ausdrock op CDH1, mir transfected transiently der mir-29b /c mimics oder negativ Kontroll rescht an BGC-823 Zellen. Am Verglach mat de Kontrollen, déi forcéiert Ausdrock vu Mir-29b /c geklomme den Ausdrock vun CDH1 souwuel d'mRNA an FAQ Niveauen (Lalumi 4E an 4F). Duerno, war d'methylation Zoustand vun de Promoteur Regioun vun CDH1 iwwerpréift mat engem BGS assay vun der Raumstatioun-29b /c mimics oder negativ Kontroll rescht BGC-823 Zellen transiently transfected. D'Resultater weisen, dass déi meescht vun CDH1 Promoteur methylation am Mir-29b /c overexpression Zellen war 5.2% oder 12,9%, déi gemooss an d'Kontroll Zellen vill méi niddereg wéi den Niveau war (88.2%; Lalumi 4G). Dës Donnéeë sech konsequent mat der Konsequenz, datt DNMT3A knockdown d'bis-Regulatioun vun CDH1 mediates a beweist, dass de de-Regulatioun vum Mir-29b /c an DNMT3A sinn am GC Zell Wanderung an Invasioun Équipe. VerfÜgung

Ofgeholl Ausdrock vun Mir-29b an Mir-29c am GC Stoffer VerfÜgung

Den Ausdrock vun Mir-29b /c zu 50 GC erhéijen a vläit Net-entholl Stoffer vun qRT-Hinnen alleguer iwwerpréift huet. Am Verglach zu den Net-entholl Stoffer vläit, d'Frequenz vun Mir-29b an Mir-29c verwandelt-Regulatioun (definéiert als eng méi grouss wéi zwee-Weeër erofgoen) huet 66% (33/50) an 60% (30/50), bzw. (Lalumi 5A an 5B). D'Moyenne fantastesch Ännerung vum Mir-29b an Mir-29c war wesentlech méi déif an d'entholl Stoffer wéi am Net-entholl Stoffer ( P VerfÜgung &Si besteet; 0,01, Lalumi 5C an 5D). Fir d'clinicopathological Bedeitung vun der Raumstatioun-29b an Mir-29c Ausdrock Musteren an GC tumorigenesis, de Medeziner Charakteristike vun GC Patienten goufen beschen analyséiert. All déi 43 Patiente analyséiert goufen an zwou Gruppen kategoriséiert no Mir-29b an Mir-29c Ausdrock Niveauen. Ofgeholl Mir-29b staark mat dem Ofschloss vun entholl Zell dat an Invasioun soll hierkommen Mir-29c ofgeholl nëmme mat der entholl Invasioun (Table 1) soll. Doriwwer eraus, war d'Relatioun tëscht Mir-29b /c Ausdrock an DNMT3A Ausdrock vun 33 GC Fäll getest. Eng Associatioun Etude gewisen, datt DNMT3A Ausdrock negatif mat Mir-29b ( R VerfÜgung = -0,640, P VerfÜgung &Si besteet; 0,01, Lalumi 5E) soll war an Mir-29c ( R
= -0,349, P VerfÜgung &Si besteet; 0,05, Lalumi 5F). Zesummen, weg dës Donnéeën, datt Mir-29b /c kéint eng wichteg Roll an de Werdegang vun gastric carcinogenesis Leeschtung. VerfÜgung

Diskussioun VerfÜgung

D'conserved Mir-29 Famill, dorënner Mir-29a, miR- 29b an Mir-29c, ass an e puer Keller Prozesser, wéi Prolifératioun, dat, apoptosis an Metastasen agebonne, hinnen eng gutt-analyséiert Famill vun miRNAs zu tumorigenesis nees [16]. Virdrun Studie berichten iwwer propedeutësch Ausdrock vu Mir-29a fräi ass mat besser allgemeng Iwwerliewe Tauxe Etapp II Colon Kriibs Patienten [27] an den ënneschten Niveaue vu Mir-29b verbonne konnt duerch Regulatioun epithelial-mesenchymal Transitioun sécher Weeër [28] Aarbecht Kriibs Metastasen Promotioun . Zousätzlech, Mir-29c Funktiounen als Metastasen suppressor datt haett Kriibs Zell Haftung fir d'extracellular Matrixentgasung a Migratioun kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung [29] bremst. An GC, vill Niveau vun Mir-29b reduzéiert a Mir-29c, besonnesch, hunn am Verglach zu Mir-29a observéiert ginn [14], suggeréiert datt Mir-29b /c eng méi wichteg Roll spille kann. Sou, Mir-29b /c war fir Analyse vun dëser Etude ausgewielt. Am Moment studéieren, huet mir eng fräi Mir-29b /c der Migratioun an Invasioun vun BGC-823 Zellen mat engem gudde Meter verkënnegt assay an enger Transwell assay Hien. Des Resultater sinn konsequent mat anere gemellt Donnéeë kritt aus SGC-7901, HGC-27 an MGC-803 GC Zellen [14, 15]. Tatsaach, datt Mir-29b /c och Rollen an Prolifératioun an apoptosis am GC Leeschtung, évaluéieren mir d'Fähegkeet vun Zell Wuesstem an de Niveau vun Zell apoptosis zu BGC-823 Zellen. D'Resultater weisen, dass et keen Ënnerscheed zu Prolifératioun op 48 Stonnen fir Mir-29b /c mimics oder inhibitors-transfected Zellen, am Verglach mat den negativen Kontroll Zellen ( P VerfÜgung > 0,05, S2A an S2B Lalumi). Ausserdeem, bewisen Annexin-V staining keng dramatesch Erhéijung vun den Niveau vun apoptosis vun der Raumstatioun-29b /c mimics-transfected Zellen no 48 Stonnen vun incubation (S2C Lalumi). Ausserdeem huet d'Zell Zyklus Analyse keng Differenze an G1, S, G2 /M Phasen der Behandlung mat der Raumstatioun-29b /c mimics oder negativ Kontroll mimics fir 48 Stonnen ( P VerfÜgung > 0,05, S2D Figebam). Dës Donnéeë hindeit, datt Mir-29b /c Géigend Erhuelung op 48 Stonnen Meter laang haaptsächlech wéinst der ofgeholl Zell motility Fähegkeeten. VerfÜgung

miRNAs hir Funktiounen vollt haaptsächlech vun der 3'UTRs vu verschiddene Genen gezielt. Allerdéngs sinn déi detailléiert molekulare Mechanisme vum Mir-29b /c Zesummenhang mat malignant GC Entwécklung ganz wéineg verstan. Gëlt, Mir-29b /c deelt deen selwechten complementarity zu Siten an der 3'UTR vun DNMT3A, déi Zil- Cepheid Programmer dorënner TargetScan, Miranda an miRBase virausgesot gouf. Et ass nach net gewosst, ob Mir-29b /c de Manque methylation vun Genen verbonne mat Metastasen reguléieren déi mat DNMT3A während der Entwécklung vun GC proposéiert. Dofir, standing mir eng luciferase reporter assay a fonnt, datt eng héich DNMT3A Ausdrock mat niddereg Mir-29b /c Ausdrock am GC Zellen verbonne war, déi besot DNMT3A ass en direkte transcriptional Zil vum Mir-29b /c. de molekulare Basis awer, datt fir den Desequiliber Mir-29b féiert /c zu GC bleift onbekannt. Mir-29 proximal Promoteuren hunn obligatoresch Siten fir verschidden Transkriptiouns Facteuren, wéi c-Myc, an CEBPA, déi zu der Dereguléierung vum Mir-29s bäidroen [30, 31]. Allerdéngs, Fuerschung op der epigenetic Regulatioun vun miRNA-29s ass net gemellt goufen. VerfÜgung

An eukaryotic Zellen, ginn et dräi enzymatically aktiv DNA methyltransferases (DNMTs), DNMT1, DNMT3A an DNMT3B. Den Ausdrock vun DNMT3A am GC ass vill méi héich wéi déi vun DNMT3B [32, 33]. Ausserdeem, ass nëmme fräi DNMT3A Ausdrock vill mat engem kuerz Krankheet-gratis Iwwerliewe Period vun GC [34], verbonne déi DNMT3A spillt méi wichteg Roll an gastric carcinogenesis ugëtt. Sou, fir mir ze ermëttelen, ob negativ-Feedback Reglementer existéieren tëscht Mir-29b /c an DNMT3A. An dëser Etude, déi mir engem BGS assay der DNA methylation Status vum Mir-29b /c zu DNMT3A RNAi GC Zellen ze analyséieren. Tatsächlech war d'Verréngerung Mir-29b /c deelweis wéinst DNMT3A-mediated hypermethylation. Ausserdeem, confirméiert mir dat DNMT3A doran GC Zell Migratioun via verwandelt-Regulatioun CDH1 Équipe ass. Mëttlerweil hu mir awer och, datt Mir-29b /c an dem Ophiewe vun CDH1 Équipe ass. A Markenzeeche vun Kriibs Metastasen ass de Verloscht vun CDH1 Ausdrock [35], an hypermethylation bannent de CDH1 Promoteur Regioun ass och zu GC observéiert [36]. Sou, weisen eis Resultater datt souwuel Mir-29b /c an DNMT3A si mat CDH1 verbonne verwandelt-Regulatioun duerch DNMT3A-mediated Promoteur hypermethylation. D'Roll vun anere DMNTs, zum Beispill DNMT3B, an Regulatioun Mir-29b /brauch c an Zukunft Studien iwwerpréift ginn. VerfÜgung

An GC uplanzen, mir den Ausdrock Muster vum Mir-29b /c iwwerpréift an 50 Puer vun GC Stoffer. Ofgeholl Mir-29b /c (fantastesch-Ännerung cutoff: 2.0) war vill mat der dat an Invasioun Supérieur am GC, soll wat drop hindeit, datt Mir-29b /c enger kritescher Roll am GC malignant Ënnerhalt spillt a weist direkt de Medeziner Bedeitung vum Mir -29b /c zu GC Werdegang. Am Resumé, verréid eis Etude dass et Kräiz-Diskussioun tëscht Mir-29b /c an DNMT3A kann. En Desequiliber vun deene Facteure kënnen am GC Wanderung an Invasioun phenotypes Équipe ginn. Dëst Desequiliber kann och niddereg-Niveau Ausdrock vu Mir-29b /c konnt Ennerdréckung vun DNMT3A an héijen Niveau vun DNMT3A weider schellt den Ausdrock vun Mir-29b /c duerch eng epigenetic Mechanismus ofschafen. Dës Conclusiounen vläicht fir d'Entwécklung vun neie Behandlung Optiounen fir GC datt Zil- Mir-29b /c a seng afgerappt Gentherapie DNMT3A positiv sinn. VerfÜgung

Ennerstëtzung Informatiounen VerfÜgung S1 Figebam. De Prozentsaz transfection Effizienz war vun Evaluatioun vum Niveau vun Mir-29b /c oder DNMT3A gëtt. VerfÜgung (A a B) qRT-Hinnen alleguer war standing der famill Ausdrock vu Mir-29b /c zu BGC-823 Zellen mat mimics z'entdecken (a) oder inhibitors (B) an der 48-Stonne transfection. (C) RT-Hinnen alleguer a westlech blots sech standing d'Effizienz vun DNMT3A knockdown zu BGC an AGS Zellen ze entdecken. β VerfÜgung -actin war als Luede Kontroll benotzt VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s001 VerfÜgung (TIF) VerfÜgung S2 Figebam. D'Roll vum Mir-29b /c am BGC-823 Zellen Prolifératioun, apoptosis an Zell Zyklus. VerfÜgung (A) d'Zell Wuesstem Tauxe vum Mir-29b /c overexpression sech duerch CCK-8 Prolifératioun assay fonnt. Mir-29b /c overexpression zougedréckt kee bemierkenswäert Ënnerscheed op 48 Stonnen am Verglach zu negativ Kontroll Zellen ( P VerfÜgung > 0,05). (B) D'Zell Wuesstem Tauxe vum Mir-29b /c inhibition sech duerch CCK-8 Prolifératioun assay fonnt. D'Ophiewe vum Mir-29b /c zougedréckt kee groussen Ännerungen an 48 Stonnen am Verglach zu negativ Kontroll Zellen ( P VerfÜgung > 0,05). (C) Apoptosis assay keng dramatesch Aféierungs- vun apoptosis vum Mir-29b /c overexpression op 48 Stonnen am Verglach zu negativ Kontroll Zellen weist. D'biparametric ugëtt weist Zell am Ufank (ennen riets ugeholl) an de spéiden apoptotic Staaten (uewen riets ugeholl). (D) D'Zell Zyklus assay war vun Flux cytometry op BGC-823 Zellen der Mir-29b /c mimics oder negativ Kontroll mimics Behandlung fir 48 Stonnen gesuergt. D'Prozentzuelen vum Mir-29b /c overexpression oder Kontroll Zellen am G1, S, an G2 /M sinn an der Bar geklommen wéi dat ± s.d gewisen. vun dräi onofhängeg Experimenter. Verglach mat Kontroll Zellen, do war keen groussen Effet op d'Zell Zyklus nom Mir-29b /c overexpression VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s002 VerfÜgung (TIF) VerfÜgung S1 Language. Zell Wuesstem an apoptosis assay VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s003 VerfÜgung (Intrigue) VerfÜgung S2 Language. . Zell Zyklus assay VerfÜgung Doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s004 VerfÜgung (Intrigue) VerfÜgung S1 Table. Séminairen Charakteristike vun Patienten mat gastric Kriibs VerfÜgung Doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s005 VerfÜgung (Intrigue) VerfÜgung S2 Table. . MiRNA rescht an inhibitor Message an an dëser Etude benotzt primers VerfÜgung Doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s006 VerfÜgung (Intrigue) VerfÜgung

Arbeschterlidder VerfÜgung

Mir Merci Dr. Gang Chen aus Nanjing Jiangning Hospital fir d'Echantillonen sammelen. Mir Merci Prof. Sheng Zhong vum Capital Medical Universitéit fir ze hëllefen d'mëttelalterlech Handschrëft ze beaarbechten. VerfÜgung

• PLOS NËMMEN: Chrysin bremst entholl Promoter-entschlof MMP-9 Expression vum erauszesichen AP-1 via Herzogtum vun Erk an JNK Weeër an Gastric Cancer BTS
• PLOS NËMMEN: Effekt vun Ausradéiere vun Helicobacter pylori op Expression Niveauen vun FHIT, IL-8 an P73 zu Gastric Mucosa vun Éischt-studéiert Familjenmemberen vun Gastric Cancer kennen