PLoS ONE: Deregulering tussen miR-29b /c en DNMT3A wordt geassocieerd met Epigenetische Silencing van de CDH1 Gene, die van invloed Cell Migratie en invasie bij maagkanker

Abstract

De deregulering van de miR-29 familie en DNA methyltransferase 3A (DNMT3A) is geassocieerd met maagkanker (GC). Terwijl steeds meer bewijs geeft aan miR-29b /c kon DNA-methylatie te reguleren door zich te richten DNMT3A, het is momenteel niet bekend of epigenetische silencing van miR-29b /c via promoter hypermethylering in GC wordt veroorzaakt door abnormale expressie van DNMT3A. Zo wilden wij beoordelen of overspraak regeling bestaat tussen miR-29b /c en DNMT3A en of het wordt geassocieerd met een maligne fenotype in GC. Eerst, wondgenezing en Transwell assays bleek dat miR-29b /c onderdrukt tumormetastase in GC. Een luciferase reporter assay aangetoond dat DNMT3A is een direct doelwit van miR-29b /c. We gebruikten bisulfiet genome sequencing om het DNA methylatie status van miR-29b /c analyseren. Het percentage gemethyleerde CpGs werd significant verlaagd in DNMT3A uitgeputte cellen vergeleken met de controles. Bovendien is de betrokkenheid van DNMT3A bij het bevorderen van GC celmigratie werd geassocieerd met de promotor methylatie-gemedieerde onderdrukking van CDH1. In 50 gepaarde klinische GC weefselmonsters, verminderde miR-29b /c was significant gecorreleerd met de mate van differentiatie en invasie van de cellen en is negatief gecorreleerd met DNMT3A expressie. Samen Preliminaire resultaten suggereren dat het volgende proces betrokken kunnen zijn bij tumorgenese GC. miR-29b /c onderdrukt het stroomafwaartse gen DNMT3A, en op zijn beurt, is miR-29b /c onderdrukt door DNMT3A in een DNA methylatie-afhankelijke wijze. De deregulering van beide miR-29b /c en DNMT3A leidt tot de epigenetische inactivatie van CDH1 en draagt ​​bij aan het metastase fenotype in GC. Deze bevinding laat zien dat DNA-methylatie geassocieerd silencing van miR-29b /c is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van GC en kan dus een therapeutisch doelwit

Visum:. Cui H, Wang L, Gong P, Zhao C, Zhang S , K Zhang, et al. (2015) Deregulering tussen miR-29b /c en DNMT3A wordt geassocieerd met Epigenetische Silencing van de CDH1 Gene, die van invloed Cell Migratie en invasie bij maagkanker. PLoS ONE 10 (4): e0123926. doi: 10.1371 /journal.pone.0123926

Academic Editor: Rajeev Samant, Universiteit van Alabama in Birmingham, VERENIGDE STATEN

Ontvangen: 4 september 2014; Aanvaard: 9 maart 2015; Gepubliceerd: 15 april 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. Dit is een open toegang Artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Beschikbaarheid: Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81171915, nr 91229107 en nr 81472548), http: //www .nsfc.gov.cn /. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is de tweede meest dodelijke maligniteit wereldwijd. Het is goed voor een totaal van ongeveer 1 miljoen nieuwe gevallen en 0,7 miljoen doden per jaar, meer dan 70% van die voorkomen in ontwikkelingslanden, met name in Oost-Aziatische landen [1]. Hoewel geneesbaar indien vroeg ontdekt, zijn de meeste GC patiënten met late stadium van de ziekte. Voor patiënten met operabele ziekte, zijn conventionele chirurgie en de combinatie chemokuren aangegeven. De totale 5-jaars overleving van patiënten GC minder dan 30% [1, 2]. Met name wordt GC vaak gepaard met peritoneale verspreiding en verspreiding naar regionale lymfeklieren en verre organen lymfatische en veneuze vaten [3]. Zo, het identificeren van moleculaire afwijkingen in GC kan ons begrip van de maag carcinogenese te verbeteren en ons te helpen verdelen patiënten in biologisch en klinisch relevante subgroepen, evenals het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën.

MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse van endogene, kleine, niet-coderende regulerende RNA's van ongeveer 20-25 nucleotiden die een negatieve genexpressie reguleren door remming van translatie of induceren mRNA degradatie tot baseparing met de 3 'niet-getranslateerde gebied (3'UTR) van target messenger RNAs (mRNAs) [4]. Veranderde expressie van miRNAs gerapporteerd bij vele kankers en leiden tot afwijkende expressie van doelgenen die maligne gedrag te beïnvloeden, zoals proliferatie, weerstand tegen apoptose en metastase [5-7]. Toenemende aanwijzingen dat gedereguleerde miRNAs (bijvoorbeeld, miR-17, miR-129, miR-148a en miR-378) bij aan maagkanker [8-10], die aangeven dat miRNAs kunnen worden gebruikt als diagnostische en prognostische biomarkers in GC .

De miR-29 familie (miR-29s) is een geconserveerde familie van miRNAs dat miR-29a /b /c omvat. Verminderde expressie van miR-29's is beschreven in verschillende kankers, waaronder GC [11-14]. Eerdere studies tonen aan dat miR-29s een dominante rol in GC celproliferatie, voortgang van de celcyclus, apoptose, en celmotiliteit [14, 15] spelen. Potentiële doelwitten van miR-29s bij te dragen aan de kwaadaardige GC fenotype omvatten Cdc42, CCND2 en MMP2 [14, 15]. Daarnaast hebben sommige studies miR-29s als bijdrage aan de regeling van DNA-methylatie geïdentificeerd door zich te richten DNMT3s bij longkanker [13]. Voorts verscheidene doelgenen, zoals TCL-1, CDK6, laminine-1 en MCL-1, zijn ook beschreven in andere kanker [16]. Met name, ondanks bewijs dat aantoont miRNA-29s kan functioneren als tumor suppressor genen, een belangrijke vraag met betrekking tot miRNA-29s meningsuiting nog steeds gedeeltelijk gescheiden. Wat zijn de mechanismen van controle van de miRNA-29s expressie in GC cellen? Vermeld is dat c-Myc betrokken bij miR-29a /b repressie [17]. Vaststellen van andere mechanismen onderdrukking van belang.

Het is bekend dat de transcriptionele silencing van tumorsuppressorgenen (GTS) van CpG eiland hypermethylatie is een gemeenschappelijk kenmerk van kanker. Interessant is vergelijkbaar met eiwit-coderende GTS, een aanzienlijk aantal miRNAs worden gereguleerd door promoter methylering [18-20]. Inderdaad, er is een toenemend aantal studies waaruit blijkt dat de tumor suppressor miRNAs, zoals miR-34b, miR-129 en miR-124, vaak tot zwijgen gebracht door middel van DNA-methylatie in GC [21-23] geweest. Op basis van de CpG eiland Searcher programma analyse toonde onze verwachting dat miRNA-29b /c bevat CpG eilanden in hun vermeende promotergebieden. Het is echter nog niet duidelijk of afwijkende DNA hypermethylatie verklaart de ontregeling van miR-29b /c. Verder is het onbekend of een feedbackregulering bestaat tussen miR-29b /c en DNMT3s. In feite is geen eerdere studie van de methylatie status van miR-29b /c in GC cellen onderzocht, en niemand heeft de relatie tussen de methylatie van miR-29b /c en het niveau van de expressie van DNMT3s verkend. In deze studie hebben we vastgesteld dat miR-29b /c onderdrukt de uitdrukking van DNMT3A door zich te richten zijn 3'UTR, die hebben bijgedragen tot het remmen van GC cel migratie en invasie. Anderzijds, DNMT3A neergereguleerd miR-29b /c via afwijkende hypermethylering van de promoter. Zo bestaat er een potentiële feedback loop tussen miR-29b /c en DNMT3A, waarin de down-regulatie van miR-29b /c schaft de onderdrukking van DNMT3A. Intussen is de up-regulatie van DNMT3A invloed op de expressie van miR-29b /c door promoter methylering. Deze bevindingen wijzen op een cross-talk tussen miR-29b /c en DNMT3A. Hun gebrek aan evenwicht en deregulering wordt veroorzaakt door een epigenetisch mechanisme dat betrokken kan zijn bij GC cel migratie en invasie kenmerken.

Materialen en methoden

Cell cultuur

GC cellijnen, met inbegrip AGS en BGC-823 werden verkregen van Cell Bank van de Chinese Academie van Wetenschappen en gehandhaafd in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U /ml penicilline en 100 mg /ml streptomycine (Invitrogen, Carlsbad, CA) in een bevochtigde incubator met 5% CO _{2 atmosfeer bij 37 ° C.}

weefselmonsters

50 paren GC weefsels en hun aangrenzende goedaardige weefselmonsters werden verzameld tussen 2011 en 2013 uit de Jiangning ziekenhuis van Nanjing. De klinische gegevens van de patiënten met GC is weergegeven in Tabel S1. De studie werd goedgekeurd door het Comité voor ethische beoordeling van onderzoek aan de Jiangning ziekenhuis van Nanjing in China, en de patiënten ondertekend informed consent formulieren. Alle weefselmonsters het werden verkregen van patiënten met GC. Zij zijn tijdens de operatie verzameld en onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof tot RNA en eiwitextractie.

omgekeerde transcriptiereactie en kwantitatieve real-time PCR (qPCR)

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de cellen en weefsels geoogst met behulp van Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) volgens de instructies van de fabrikant.

om miRNA expressie te detecteren, werd een stamlus RT-PCR uitgevoerd zoals eerder beschreven [24], en U6 kleine RNA's gebruikt als een interne controle. qPCR werd uitgevoerd met behulp van SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, China) volgens het protocol van de fabrikant. De relatieve expressie werd geëvalueerd door de vergelijking CT methode. De primer sequenties van elk gen worden getoond in tabel S2.

Western blot

Western blots werden uitgevoerd met behulp van anti-DNMT3A (Abcam, Cambridge, UK), anti-CDH1 (Abcam, Cambridge, UK), anti-vimentine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) en anti- β
actine antilichamen (Sigma, Ronkonkoma, NY, USA), en detectie werd uitgevoerd met Super Signal chemiluminescentie substraat (Pierce, Rockford, IL, USA).

Transfectie

miR-29b /c bootst /remmers en negatieve controle moleculen (scramble control mimic en remmer) werden gesynthetiseerd en gezuiverd door GenePharma Vennootschap (Shanghai, China). De sequenties worden getoond in Tabel S2. Ze werden getransfecteerd in de cellen in een eindconcentratie van 50 nM met gebruik van Lipofectamine-2000 transfectiereagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Het medium werd vervangen na 6 uur. De cellen werden gedurende 48 uur en geoogst voor analyse. Het percentage transfectie-efficiëntie werd bepaald door een evaluatie van de niveaus van miR-29b /c expressie of knockdown volgende transfecties (S1A en S1B figuur). Het protocol voor het vaststellen van de DNMT3A stabiele knock-down cellen is beschreven in onze eerdere werk [25]. De expressie van DNMT3A sterk afgenomen in de BGC-shDNTM3A en AGS-shDNTM3A cellen (Fig S1C) in vergelijking met de controlecellen.

Wondgenezing, migratie en invasie assays

Mobiliteitscel onderging de wondgenezing assay analyse zoals eerder is beschreven [26]. Een kras wond werd gegenereerd met een 200 ul pipetpunt op confluente celmonolagen in zes-well platen. De cellen werden daarna gewassen met vers medium aan drijvende cellen te verwijderen, en de verspreiding van de wondsluiting werd waargenomen na 48 uur en gefotografeerd onder een microscoop. Het potentieel voor migratie en invasie van de getransfecteerde cellen werd beoordeeld door een Transwell-assay. De cellen werden gekweekt tot 70% confluentie en getransfecteerd gedurende 24 uur met de miR-29b /c nabootst of controle bootst en miR-29b /c remmer of controle remmer. In de migratie assay werden de cellen gekweekt in 200 ml medium met 1% foetaal runderserum in de bovenste kamer van een niet-beklede Transwell insert. In de onderste kamer, 600 ml medium met 10% foetaal runderserum werd gebruikt als een chemoattractant celmigratie stimuleren. In de invasie assay, de bovenste kamer van Transwell inzetstukken werden bekleed met 50 ml 1,0 mg /ml Matrigel, en de cellen werden in de bovenste kamer van de Matrigel beklede Transwell insert (Millipore, USA). Na 24 uur incubatie werden de niet-migrerende of niet-binnendringende cellen voorzichtig verwijderd met een wattenstaafje. Alle cellen werden gekleurd met 0,1% kristalviolet kleuring en geteld in 5 velden onder een omgekeerde microscoop. De onafhankelijke experimenten werden driemaal herhaald.

bisulfiet genomische sequentie (BGS)

Genomisch DNA werd uit de cellen met behulp van het fenol-chloroform geëxtraheerd methode. Bisulfiet behandeling werd uitgevoerd door Universal CpGenome DNA Modificatie Kit (Millipore, USA) volgens de instructies van de fabrikant. PCR-producten voor bisulfiet sequencing werden gel-gezuiverd en gesubkloneerd in een pMD19-T-vector-systeem (Takara, Dalian, China). Ten minste tien kolonies werden gesequentieerd om de mate van methylering gaan op elke CpG plaats. De primers zijn weergegeven in tabel S2.

Luciferase reporter assay

Het protocol voor de luciferase reporter assay is eerder beschreven [14]. Het 3'UTR van menselijke DNMT3A werd met PCR geamplificeerd en gekloneerd tussen de Not I en Xba I plaatsen van pGL-3 (Promega, USA). BGC-823 cellen werden uitgeplaat bij een dichtheid van 5 x 10 ^{5 per putje in een 12-putjes plaat voor de transfecties. De cellen werden getransfecteerd met pGL-3 vuurvlieg luciferase reporters (1 pg per putje), pRL-TK (50 ng per putje) en miR-29 imiteert /remmers (50 nM) of negatieve controle imiteert /remmers (50 nM) met behulp Lipofectamine- 2000 transfectiereagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Luciferase activiteit werd getest 48 uur na de transfectie met het Dual-Luciferase Activity Assay System (Promega, USA). Alle experimenten werden uitgevoerd zoals drie onafhankelijke herhalingen.}

Statistische analyse

De onafhankelijke Student's
t-test werd gebruikt om de resultaten, uitgedrukt als het gemiddelde ± vergelijken sd tussen twee vooraf gekozen groepen. Correlaties tussen de variabelen te bepalen, Pearson
's correlatiecoëfficiënt werd berekend. Een P
-waarde van minder dan 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

miR-29b /c nodig en voldoende is voor GC celmigratie

eerdere studies suggereren dat miR-29b /c is van cruciaal belang voor GC cel invasie. Om verder te evalueren of miR-29b /c is verantwoordelijk voor GC celmigratie, een In vitro
scratch wondgenezing assay en Transwell assay werden uitgevoerd. Na tijdelijk transfecteren van de miR-29b /c nabootst of negatieve controle in de BGC-823 cellen, de wondgenezing assay bleek dat de cellen met de geforceerde expressie van miR-29b /c weergegeven een opmerkelijk trager herstel vergeleken met de controlecellen (Fig 1A). Ook de Transwell migratie assay bleek dat de overexpressie van miR-29b /c was geassocieerd met significant minder migratie dan de controles ( P
< 0,05, figuur 1B). Overigens met andere gegevens in HGC-207 en MGC-803 GC-cellen [14], de miR-29b /c overexpressie cellen bleek ook een aanzienlijke vermindering van invasieve vermogen in de Matrigel invasie assay ( P
<0,05, figuur 1C). Deze resultaten suggereren dat miR-29b /c is niet alleen belangrijk voor GC invasie maar ook voor celmigratie. De onderdrukkende effecten van miR-29b /c op GC celmigratie en invasie verder te bevestigen, werden de BGC-823-cellen die transiënt getransfecteerd met de miR-29b /c remmers of een negatieve controle. De schrapping van miR-29b /c aanzienlijk toegenomen de trekkende en invasieve mogelijkheden van de GC-cellen, die werd beoordeeld door de wondgenezing (figuur 1D) en een Transwell assay ( P Restaurant < 0,05, figuur 1E en Fig 1F). Gezamenlijk geven deze resultaten aan dat miR-29b /c effectief afgeschaft GC celmigratie en invasie, die dus bijgedragen aan het begin van de maligne progressie van GC.

DNMT3A een directe transcriptionele doel van miR-29b /c in GC

Om het onderliggende mechanisme van het effect van miR-29b /c op celmigratie en invasie begrijpen, onderzochten we de doelstellingen van miR-29b /c. DNMT3A 3'UTR is complementair aan miR-29b /c en is een direct doelwit-gen van miR-29b /c, dus we voerden een reporter assay in BGC-823 cellen. De DNMT3A mRNA 3'UTR werd in het stroomafwaartse gebied van een luciferase reporter gen uit de pGL-3 vector (namelijk DNMT3A 3'UTR-Luc). De constructen werden daarna gecotransfecteerd met pRL-TK en miR-29b /c nabootst of de negatieve controle bootst in de BGC-823 cellen. Zoals getoond in figuur 2A, is de relatieve luciferaseactiviteit significant verminderd bij de pGL-3 vectoren met DNMT3A 3'UTR ( P
< 0,05). Echter, de constructen gecotransfecteerd met miR-29b /c-remmer geen effect op de luciferase activiteit van de pGL-3 vectoren met DNMT3A 3'UTR opzichte van de constructen gecotransfecteerd met de negatieve controle remmer (figuur 2B). Om verder te valideren deze miRNA-doelwit interactie, kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR) en West-blots werden uitgevoerd om de regulering van DNMT3A door miR-29b /c bevestigen. We tijdelijk getransfecteerd de miR-29b /c nabootst of negatieve controle bootst in de BGC-823 cellen. De toegenomen miR-29b /c verminderde de DNMT3A uitdrukking in het mRNA (figuur 2C) en eiwit niveaus (Fig 2E, lane1-3). Omgekeerd, de miR-29b /c neerwaartse regulatie door zijn remmer verhoogde de DNMT3A expressie aan het mRNA (figuur 2D) en eiwit niveaus (Fig 2E, lane4-6). Tezamen zijn deze bevindingen wijzen erop dat DNMT3A is een directe transcriptie doelwit van miR-29b /c en negatief geassocieerd met miR-29b /c expressie in GC cellen.

miR-29b /c wordt onderdrukt door DNMT3A in een DNA-methylatie-afhankelijke manier

Gezien het feit dat afwijkende hypermethylering is van cruciaal belang voor miRNA down-regulatie, we speculeerden dat negatieve feedback bestaat tussen miR-29b /c en DNMT3A. Om deze hypothese te testen, de aanwezigheid van CpG eiland methylering in de miR-29b /c promotergebied werd geëvalueerd door een BGS analyse de DNMT3A knockdown cellen. Zoals getoond in figuur 3A, 7 afzonderlijke CpG posities in de CpG eilanden (5 kb stroomopwaarts van miR-29b /c) werden gesequenced om gemethyleerde cytosine residuen te identificeren. De frequentie van miR-29b /c promoter methylatie in DNMT3A-knockdown cellen was 34,2%, wat aanzienlijk lager is dan de controlecellen was (58,6%; figuur 3B). Dit resultaat geeft aan dat de transcriptionele silencing van miR-29b /c in GC cellen is geassocieerd met de aanwezigheid van CpG eiland hypermethylatie, hetgeen werd bevestigd door meting rijpe miR-29b /c Door qRT-PCR. Er was significant verhoogd miR-29b /c uitdrukking in het AGS-shDNMT3A en BGC-shDNMT3A cellen in vergelijking met hun controles (figuur 3C). Deze bevindingen wijzen op een belangrijke moleculaire basis voor miR29-b /c down-regulatie en ondersteunen de hypothese dat er overspraak tussen miR-29b /c en DNMT3A.

DNMT3A bevordert GC celmigratie

de moleculaire verbinding tussen miR-29b /c en DNMT3A de vraag opgeworpen DNMT3A betrokkenheid bij GC cel migratie. We verder toegepast in vitro
assays om de functionele veranderingen in cel gedrag na veranderde expressie van DNMT3A bepalen. De wondgenezing assay toonde een opmerkelijk trager herstel in de BGC-shDNMT3A cellen vergeleken met controlecellen (figuur 4A begin), maar slechts een bescheiden herstel in de AGS-shDNMT3A cellen vergeleken met controlecellen (figuur 4A, onder). Deze resultaten geven aan dat DNMT3A belangrijk is voor celbeweging. Aangezien celadhesiemoleculen zijn belangrijk voor celbeweeglijkheid, werden de expressie van CDH1 en vimentine onderzocht met qRT-PCR en Western blot. Knockdown van DNMT3A expressie significant verhoogd CDH1 expressie op zowel mRNA en eiwitniveaus, maar geen opmerkelijk effect op de expressie van vimentine (figuur 4B en 4C) hebben, wat suggereert dat CDH1 een doelstelling DNMT3A gemedieerde ontregeling van cel kan worden beweeglijkheid. Verder hebben wij een BGS-test op de CDH1-gen in de DNMT3A knockdown cellen. Zoals getoond in figuur 4D, het percentage gemethyleerd CpGs gelegen binnen CDH1 was lager in de DNMT3A uitgeputte cellen dan in de controlecellen (35,8% vs. 94,1%). Deze resultaten geven aan dat de abnormale expressie van DNMT3A leidt tot een epigenetische inactivatie van CDH1.

miR-29b /c is betrokken bij de onderdrukking van CDH1

Om het effect van gewijzigde buitenspiegels verder te onderzoeken 29b /c uitdrukking op CDH1, we tijdelijk getransfecteerd de miR-29b /c nabootst of negatieve controle na te bootsen in BGC-823 cellen. In vergelijking met de controles gedwongen expressie van miR-29b /c sterk toegenomen expressie van CDH1 op zowel mRNA en eiwitniveaus (Figuur 4E en 4F). Vervolgens worden de methylatiestatus van het promotorgebied van CDH1 werd onderzocht met een BGS assay in de miR-29b /c nabootst of negatieve controle bootsen transiënt getransfecteerde BGC-823 cellen. De resultaten toonden aan dat de frequentie van CDH1 promoter methylatie in de miR-29b /c overexpressie cellen was 5,2% en 12,9%, wat aanzienlijk lager is dan de gemeten in de controlecellen was (88,2%; figuur 4G). Deze gegevens waren consistent zodat DNMT3A knockdown bemiddelt de up-regulatie van CDH1 uitwijst dat de deregulering van miR-29b /c en DNMT3A betrokken bij GC celmigratie en invasie.

Verminderde expressie van miR-29b en miR-29c in GC weefsels

De expressie van miR-29b /c in 50 GC tumoren en gepaarde non-tumor weefsel werd door qRT-PCR onderzocht. Vergeleken met de gepaarde niet-tumorweefsels, de frequentie van miR-29b en miR-29c neerwaartse regulering (gedefinieerd als een groter dan tweevoudige afname) was 66% (33/50) en 60% (30/50), (Fig 5A en 5B). De gemiddelde voudige verandering van miR-29b en miR-29c was in de tumor weefsel beduidend lager dan in de niet-tumor weefsel ( P Restaurant < 0,01, figuur 5C en 5D). Om de klinische en betekenis van de miR-29b en miR-29c expressie patronen in GC het ontstaan ​​van tumoren te verkennen, werden de klinische kenmerken van GC patiënten geanalyseerd. Alle 43 patiënten geanalyseerd werden ingedeeld in twee groepen op basis van miR-29b en miR-29c expressie niveaus. Verminderde miR-29b sterk gecorreleerd met de mate van tumorcel differentiatie en invasie, terwijl verminderde miR-29c alleen gecorreleerd met tumorinvasie (tabel 1). Bovendien is de relatie tussen miR-29b /c expressie en DNMT3A expressie werd getest in 33 GC gevallen. Een associatie studie toonde aan dat DNMT3A expressie negatief was gecorreleerd met miR-29b ( R
= -0,640, P Restaurant < 0,01, figuur 5E) en miR-29c ( R
= -0,349, P Restaurant < 0,05, figuur 5F). Tezamen zijn deze gegevens blijkt dat miR-29b /c zou een belangrijke rol spelen in de progressie van maagkanker.

Discussie

De geconserveerde miR-29 familie, met inbegrip van miR-29a, buitenspiegels 29b en miR-29c, is betrokken bij verschillende kelder processen, zoals proliferatie, differentiatie, apoptose en metastase, waardoor ze een goed geanalyseerd familie van miRNAs in tumorigenese [16]. Eerdere studies hebben aangetoond dat verhoogde expressie van miR-29a wordt geassocieerd met een betere algehele overleving in fase II colonkanker patiënten [27] en de lagere miR-29b kan prostaatkanker metastase bevorderen door controle epitheliale-mesenchymale overgang signaalwegen [28] . Bovendien, miR-29c functioneert als een metastase suppressor dat longkanker celadhesie remt de extracellulaire matrix en migratie in vitro Kopen en in vivo
[29]. In GC, aanzienlijk verminderd niveaus van miR-29b en miR-29c, in het bijzonder, zijn waargenomen ten opzichte van miR-29a [14], wat suggereert dat miR-29b /c een belangrijke rol kunnen spelen. Aldus werd miR-29b /c geselecteerd voor analyse in deze studie. In deze studie hebben we aangetoond een verhoogde miR-29b /c onderdrukt de migratie en invasie van BGC-823-cellen onder toepassing van een wondgenezing assay en een Transwell-assay. Deze resultaten zijn consistent met andere gerapporteerde gegevens verkregen van SGC-7901, HGC-27 en MGC-803 GC-cellen [14, 15]. Aangezien miR-29b /c ook rollen in proliferatie en apoptose in GC, onderzochten we het vermogen van de celgroei en het niveau van apoptose in BGC-823 cellen. De resultaten toonden aan dat er geen verschil in proliferatie van 48 uur miR-29b /c nabootst of remmers getransfecteerde cellen, in vergelijking met de negatieve controle cellen ( P
> 0,05, S2A en S2B figuur). Bovendien Annexine-V-kleuring toonden geen dramatische verhoging van het niveau van apoptose in de miR-29b /c bootst-getransfecteerde cellen na 48 uur incubatie (Fig S2C). Bovendien, de celcyclus analyse toonde geen significante verschillen in G1, S, G2 /M fasen na behandeling met de miR-29b /c nabootst of negatieve controle signaalpeptidase 48 uur ( P
> 0,05, S2D fig). Deze gegevens suggereren dat miR-29b /c vertraagt ​​wondoppervlak herstel na 48 uur vooral als gevolg van de verminderde beweeglijkheid cel vaardigheden.

miRNAs hun functies uit te oefenen vooral door zich te richten de 3'UTRs van verschillende genen. Echter, de gedetailleerde moleculaire mechanismen van miR-29b /c met betrekking tot maligne GC ontwikkeling slecht begrepen. Met name miR-29b /c deelt dezelfde complementariteit naar sites in de 3'UTR van DNMT3A, die werd voorspeld door doelwit voorspelling programma's, waaronder TargetScan, Miranda en miRBase. Het is nog niet bekend of miR-29b /c regelt de abnormale methylatie van genen geassocieerd met metastase door interactie met DNMT3A tijdens de ontwikkeling van GC. Daarom hebben we een luciferase reporter test en vond dat een hoge DNMT3A expressie werd geassocieerd met een lage miR-29b /c expressie in GC cellen, wat aangeeft DNMT3A is een directe transcriptie doelwit van miR-29b /c. De moleculaire basis die leidt tot de verstoring van miR-29b /c in GC blijft onbekend. miR-29 proximale promotors bindingsplaatsen voor verschillende transcriptiefactoren, zoals c-Myc en CEBPA die bijdragen tot de deregulering van miR-29's [30, 31]. Echter, onderzoek naar de epigenetische regulatie van miRNA-29s is niet gemeld.

In eukaryotische cellen, zijn er drie enzymatisch actieve DNA-methyltransferase (DNMTs), DNMT1, DNMT3A en DNMT3B. De expressie van DNMT3A in GC aanzienlijk hoger dan die van DNMT3B [32, 33]. Voorts wordt slechts vergroot DNMT3A expressie significant geassocieerd met een kortere ziektevrije overleving periode GC [34], wat aangeeft DNMT3A speelt verder een belangrijke rol in maagkanker. Zo hebben we geprobeerd om te onderzoeken of negatieve feedback regelgeving bestaan ​​tussen miR-29b /c en DNMT3A. In deze studie, gebruikten we een test om de BGS DNA methylatie status van miR-29b /c in DNMT3A RNAi GC cellen te analyseren. Sterker nog, de verminderde miR-29b /c was deels te wijten aan DNMT3A-gemedieerde hypermethylering. Verder bevestigde we dat DNMT3A betrokken is bij het bevorderen van GC celmigratie via-down reguleren CDH1. Ondertussen hebben we toonde ook aan dat miR-29b /c is betrokken bij de onderdrukking van CDH1. Een kenmerk van kanker metastase is het verlies van expressie CDH1 [35], en Hypermethylering binnen de CDH1 promotorgebied wordt ook waargenomen in GC [36]. Aldus tonen onze resultaten aan dat zowel miR-29b /c en DNMT3A zijn geassocieerd met CDH1 downregulatie doorgaande DNMT3A gemedieerde promoter hypermethylering. De rol van andere DMNTs, bijvoorbeeld DNMT3B, bij het reguleren van miR-29b /c moet in toekomstige studies worden onderzocht.

In GC exemplaren, onderzochten we de expressie patroon van miR-29b /c in 50 paren GC weefsels. Verminderde miR-29b /c (fold-change cutoff: 2,0) was significant gecorreleerd met de differentiatie en invasie graad in GC, wat suggereert dat miR-29b /c speelt een cruciale rol in GC kwaadaardige onderhoud en direct toont de klinische betekenis van miR -29b /c in GC progressie. Kortom, onze studie blijkt dat er overspraak tussen miR-29b /c en DNMT3A kunnen zijn. Een onbalans van deze factoren kan worden betrokken bij GC migratie en invasie fenotypes zijn. Deze onevenwichtigheid kan low-level expressie van miR-29b /c onder meer onderdrukking van DNMT3A en een hoog niveau van DNMT3A zou afschaffing van de expressie van miR-29b /c door een epigenetisch mechanisme verder beïnvloedt. Deze bevindingen kan gunstig zijn voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor GC die gericht miR-29b /c en stroomafwaartse gen DNMT3A zijn.

Ondersteunende informatie
S1 Fig. Het percentage transfectie-efficiëntie werd verschaft door beoordeling van niveaus van miR-29b /c of DNMT3A.
(A en B) qRT-PCR werd uitgevoerd om de relatieve expressie van miR-29b /c detecteren BGC-823 cellen met bootst (A) of remmers (B) na 48 uur transfectie. (C) RT-PCR en Western-blots werden uitgevoerd om de doeltreffendheid van DNMT3A knockdown in BGC en AGS cellen detecteren. β
actine werd gebruikt als een laad controle
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123926.s001
(TIF)
S2 Afb. De rol van miR-29b /c in de BGC-823 cellen proliferatie, apoptose en celcyclus.
(A) de celgroeisnelheden van miR-29b /c overexpressie werden gedetecteerd door CCK-8 proliferatie assay. miR-29b /c overexpressie vertoonden geen opmerkelijk verschil na 48 uur in vergelijking met de negatieve controle cellen ( P Restaurant > 0,05). (B) De celgroeisnelheden van miR-29b /c remming werden gedetecteerd door CCK-8 proliferatie assay. De onderdrukking van miR-29b /c vertoonden geen significante veranderingen op 48 uur in vergelijking met de negatieve controle cellen ( P Restaurant > 0,05). (C) apoptoseassay toont geen dramatische inductie van apoptose door miR-29b /c overexpressie in 48 uur in vergelijking met de negatieve controle cellen. De biparametrische histogram toont cel in het begin (rechtsonder kwadrant) en de late apoptotische staten (kwadrant rechtsboven). (D) De celcyclus werd uitgevoerd door flowcytometrie BGC-823 cellen na miR-29b /c nabootst of negatieve controle bootst behandeling van 48 uur. De percentages van miR-29b /c overexpressie of controle cellen in de G1, S en G2 /M zijn weergegeven in het staafdiagram als het gemiddelde ± S.D.. van drie onafhankelijke experimenten. In vergelijking met controle cellen, was er geen significant effect op de celcyclus na miR-29b /c overexpressie
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123926.s002
(TIF)
S1 Method. groei en cel apoptoseassay
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123926.s003
(DOC)
S2 Method. . Celcyclus assay
doi: 10.1371 /journal.pone.0123926.s004
(DOC)
S1 Table. Klinische kenmerken van patiënten met maagkanker
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123926.s005
(DOC)
S2 Table. . MiRNA na te bootsen en remmer sequenties en primers die in deze studie
doi: 10.1371 /journal.pone.0123926.s006
(DOC)

Dankwoord

Wij danken Dr. Gang Chen van Nanjing Hospital voor het verzamelen van de monsters. Wij danken Prof. Sheng Zhong uit Capital Medische Universiteit voor het helpen om het manuscript te wijzigen.

• PLoS ONE: Chrysin Remt Tumor-Promoter Induced MMP-9 Expressie door het blokkeren van AP-1 via Onderdrukking van ERK en JNK Pathways bij maagkanker Cells
• PLoS ONE: Effect van de Uitroeiing van Helicobacter pylori op de expressie van FHIT, IL-8 en P73 in maagslijmvlies van eerstegraads familieleden van patiënten met maagkanker