PLOS ONE: Desregulamentação entre miR-29b /c e DNMT3A está associado com epigenética silenciamento do gene CDH1, afetando migração e invasão celular em gástrica Cancer

Abstract

A desregulamentação da família miR-29 e 3A DNA metiltransferase (DNMT3A) está associada a câncer gástrico (GC). Enquanto aumenta a evidência indica miR-29b /c poderia regular a metilação do DNA, visando DNMT3A, é atualmente desconhecido se o silenciamento epigenético de miR-29b /c via hipermetilação do promotor em GC é causada pela expressão anormal de DNMT3A. Assim, objetivou-se avaliar se existe regulação cross-talk entre miR-29b /c e DNMT3A e se ela está associada com um fenótipo maligno em GC. Em primeiro lugar, a cicatrização de feridas e ensaios Transwell revelou que o miR-29b /c suprime a metástase do tumor em GC. Um ensaio de repórter de luciferase demonstrado que DNMT3A é um alvo directo de miR-29b /c. Usamos sequenciamento genômico bissulfito para analisar o estado de metilação do DNA de miR-29b /c. A percentagem de CpG metilados foi significativamente diminuída em células empobrecido-dnmt3a em comparação com os controlos. Além disso, o envolvimento das DNMT3A na promoção da migração celular de GC estava associada à repressão mediada por metilação do promotor de CDH1. Em 50 amostras de tecido GC clínicos emparelhados, diminuição miR-29b /c foi significativamente correlacionada com o grau de diferenciação e invasão das células e foi negativamente correlacionada com a expressão DNMT3A. Em conjunto, os nossos resultados preliminares sugerem que o seguinte processo pode ser envolvido na tumorigénese GC. miR-29b /c suprime a DNMT3A gene a jusante, e, por sua vez, o miR-29b /c é suprimida por DNMT3A em uma maneira dependente da metilação do DNA. A desregulação de ambos de miR-29b /C e DNMT3A leva ao silenciamento epigenético de CDH1 e contribui para o fenótipo de metástases em GC. Esta constatação revela que o ADN associado silenciamento-metilação de miR-29b /c é crítico para o desenvolvimento de GC e, consequentemente, pode ser um alvo terapêutico

citação:. Cui H, Wang L, P Gong, Zhao C, Zhang S , Zhang K, et al. (2015) Desregulamentação entre miR-29b /c e DNMT3A está associado com epigenética silenciamento do gene CDH1, afetando migração e invasão celular em câncer gástrico. PLoS ONE 10 (4): e0123926. doi: 10.1371 /journal.pone.0123926

Editor do Academic: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, United States |

Recebido: 04 de setembro de 2014; Aceito: 09 de março de 2015; Publicação: 15 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Cui et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (Grant No. 81.171.915, No. 91.229.107 e nº 81472548), http: //www .nsfc.gov.cn /. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (CG) é o segundo tumor maligno mais fatal no mundo inteiro. É responsável por um total de aproximadamente 1 milhão de novos casos e 0,7 milhões de mortes por ano, mais de 70% das quais ocorrem nos países em desenvolvimento, especialmente nos países do Leste Asiático [1]. Apesar de curável, se detectado precocemente, a maioria dos pacientes do GC são diagnosticadas com doença em estágio final. Para pacientes com doença operável, quimioterapias cirurgia e combinação convencionais são indicados. No entanto, a taxa de sobrevivência de 5 anos de pacientes GC geral é inferior a 30% [1, 2]. Notavelmente, GC é muitas vezes acompanhada de disseminação peritoneal e metástases em linfonodos regionais e órgãos distantes através dos vasos linfáticos e venosos [3]. Assim, a identificação de aberrações moleculares em GC pode melhorar a nossa compreensão da carcinogênese gástrica e nos ajudar a subdividir os pacientes em subgrupos biologicamente e clinicamente relevante, bem como desenvolver novas estratégias terapêuticas.

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de endógeno, pequena, não-codificante RNAs reguladores de cerca de 20-25 nucleótidos que regulam negativamente a expressão do gene através da inibição da tradução ou induzindo degradação do mRNA através de emparelhamento de bases com a região 3 'não traduzida (3'UTR) de RNAs-alvo de mensageiro (ARNm) [4]. os níveis de expressão alterada de miARNs têm sido relatados em muitos cancros e resultar na expressão aberrante de genes alvo que influenciam o comportamento maligno, tais como a proliferação, a resistência à apoptose e metástase [5-7]. A evidência crescente que mostra miARNs desregulados (por exemplo, o miR-17, o miR-129, miR-148a, e miR-378) contribuem para a carcinogénese gástrica [8-10], que indicam que miARN pode ser utilizado como biomarcador de diagnóstico e de prognóstico em GC .

A família miR-29 (mIR-29) é uma família conservada de miRNAs que inclui miR-29a /b /c. Redução da expressão de miR-29 foi descrita em vários cancros, incluindo GC [11-14]. Estudos anteriores demonstraram que o miR-29 desempenham um papel dominante na proliferação de células de GC, progressão do ciclo celular, apoptose e a motilidade celular [14, 15]. potenciais alvos de miR-29 contribuem para o fenótipo maligno GC incluem Cdc42, CCND2 e MMP2 [14, 15]. Além disso, alguns estudos têm identificado miR-29 como contribuintes para a regulação da metilação do DNA, visando DNMT3s no cancro do pulmão [13]. Além disso, vários genes alvo, tais como a TCL-1, CDK6, laminina-1 e LCM-1, também têm sido relatados em outro câncer [16]. Notavelmente, apesar das evidências demonstrando miRNA-29 pode funcionar como genes supressores de tumores, uma questão-chave relacionada à expressão de miRNA-29 ainda permanecem parcialmente por resolver. Quais são os mecanismos de controle da expressão de miRNA-29 em células de GC? Tem sido relatado que c-Myc está envolvido na miR-29a /b repressão [17]. Identificando os mecanismos de supressão adicionais é de interesse.

Sabe-se que o silenciamento transcricional de genes supressores tumorais (ETG) por CpG island hipermetilação é uma característica comum de carcinogénese. Curiosamente, semelhante ao ETG de codificação de proteínas, um número substancial de miARNs são regulados por metilação do promotor [18-20]. De facto, tem havido um número crescente de estudos que mostram que miARNs supressores de tumor, tais como o miR-34b, o miR-129 e miR-124, são frequentemente silenciado por metilação do DNA em GC [21-23]. Com base na análise programa CpG Ilha pesquisador, a nossa previsão mostrou que miARN-29b /c contém ilhas de CpG nas suas regiões promotoras putativos. No entanto, ainda não é claro se a hipermetilação aberrante de DNA responsável pela desregulação do miR-29b /c. Além disso, desconhece-se se existe uma regulação de realimentação entre o miR-29b /C e DNMT3s. Na verdade, nenhum estudo anterior examinou o estado de metilação de miR-29b /C em células de GC, e nenhum exploraram a relação entre a metilação do miR-29b /C e os níveis de expressão de DNMT3s. Neste estudo, descobrimos que miR-29b /c suprimida a expressão de DNMT3A, visando a sua 3'UTR, o que contribuiu para inibir a migração de células GC e invasão. Por outro lado, DNMT3A regulada negativamente miR-29b /c através de hipermetilação aberrante do promotor. Assim, existe um ciclo de realimentação de potencial entre o miR-29b /C e DNMT3A, em que a sub-regulação de miR-29b /c abole a supressão de DNMT3A. Enquanto isso, a sobre-regulação de DNMT3A afecta a expressão de miR-29b /c por metilação do promotor. Estes achados sugerem um cross-talk entre miR-29b /c e DNMT3A. Seu desequilíbrio e desregulamentação é causa por um mecanismo epigenético que pode estar envolvida na migração e invasão características celulares GC.

Materiais e Métodos

cultura celular

linhas celulares GC, incluindo AGS e BGC-823, foram obtidos a partir da Cell Bank da Academia chinesa de Ciências e mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U /ml de penicilina e 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) numa incubadora humidificada com 5% de CO _{2 atmosfera a 37 ° C.}

As amostras de tecido

50 pares de tecidos de GC e a sua adjacente amostras de tecido não-cancerosas foram coletados entre 2011 e 2013 a partir do Hospital Jiangning de Nanjing. A informação clínica dos pacientes com GC é mostrado na Tabela S1. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Revisão Ética de Pesquisa do Hospital Jiangning de Nanjing na China, e os pacientes assinaram termo de consentimento informado. Todas as amostras de tecido foram obtidas a partir de pacientes com GC. Eles foram recolhidas durante a cirurgia e imediatamente congelados em azoto líquido até a extracção de ARN e proteína.

Inverter reacção de transcrição e quantitativa PCR em tempo real (qPCR)

O ARN total foi extraído a partir das células e tecidos colhidos usando Trizol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

para detectar a expressão de miARN, uma haste-laçada de RT-PCR foi realizada como descrito anteriormente [24], e pequenos RNAs foram U6 usado como um controlo interno. qPCR foi realizado utilizando SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, China) de acordo com o protocolo do fabricante. A expressão relativa foi avaliada pelo método comparativo CT. As sequências dos iniciadores de cada gene são mostrados na Tabela S2.

Western blot

As transferências de Western foram realizadas utilizando anticorpos anti-DNMT3A (Abcam, Cambridge, UK), anti-CDH1 (Abcam, Cambridge, UK), anti-vimentina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) e anti -actina β
anticorpos (Sigma, Ronkonkoma, NY, USA), e a detecção foi realizada com substrato quimioluminescência Super Signal (Pierce, Rockford, IL, EUA).

a transfecção

miR-29b /c imita /inibidores e moléculas de controlo negativo (controlo precipitação mímico e inibidor) foram sintetizados e purificados pela Companhia GenePharma (Xangai, China). As sequências são mostradas na Tabela S2. Eles foram transfectados para as células a uma concentração final de 50 nM utilizando Lipofectamine-2000 reagente de transfecção (Invitrogen, Carlsbad, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. O meio foi mudado após 6 horas. As células foram cultivadas durante 48 horas e colhidas para análise. O por cento de eficiência da transfecção foi determinada por uma avaliação dos níveis de expressão de miR-29b /c ou knockdown seguinte transfecções (S1A e S1B FIG). O protocolo para determinar a DNMT3A knockdown células estável tem sido descrito no nosso trabalho anterior [25]. A expressão de DNMT3A diminuído drasticamente nas células BGC-shDNTM3A e AGS-shDNTM3A (S1C FIG) em comparação com as células controle.
Ensaios

cicatrização de feridas, migração e invasão

mobilidade celular foi submetido a a análise ensaio de cicatrização da ferida tal como descrito anteriormente [26]. Uma ferida zero foi gerado utilizando uma ponta de pipeta de 200 uL nas monocamadas de células confluentes em placas de seis poços. As células foram então lavadas com meio fresco para remover as células flutuantes, e foi observada a propagação do fechamento da ferida ao fim de 48 horas e fotografadas sob um microscópio. O potencial para a migração e invasão das células transfectadas foram avaliados por um ensaio Transwell. As células foram cultivadas até 70% de confluência e transfectadas durante 24 horas com o miR-29b /c imita ou imita de controlo, e o inibidor de miR-29b /inibidor ou controlo C. No ensaio de migração, as células foram cultivadas em 200 ml de meio com soro fetal de bovino a 1% na câmara superior de uma pastilha não-revestido Transwell. Na câmara inferior, de 600 mL de meio com soro bovino fetal a 10% foi utilizado como um quimioatractivo para estimular a migração de células. No ensaio de invasão, a câmara superior das inserções Transwell foram revestidas com 50 ml de 1,0 mg /ml de Matrigel, e as células foram plaqueadas na câmara superior do inserto Transwell revestida Matrigel (Millipore, EUA). Após 24 horas de incubação, as células não invasoras não migra ou foram removidos cuidadosamente com um cotonete. Todas as células foram coradas com 0,1% de coloração com violeta de cristal e contadas em 5 campos sob um microscópio invertido. As experiências independentes foram repetidas três vezes.

sequenciação genómica bissulfito (BGS)

O ADN genómico foi extraído das células usando o método de fenol-clorofórmio. tratamento com bissulfito foi realizada pelo CpGenome Universal DNA Modification Kit (Millipore, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Os produtos de PCR para sequenciação bissulfito foram purificados em gel e subclonado no vector de um sistema pMD19-T (Takara, Dalian, China). Pelo menos dez colónias foram sequenciados para avaliar o grau de metilação de CpG em cada local. Os iniciadores estão listados na Tabela S2.

repórter luciferase ensaio

O protocolo para o ensaio repórter da luciferase foi descrito anteriormente [14]. A 3'UTR do DNMT3A humana foi amplificado por PCR e clonado entre os sítios Not I e Xba I do PGL-3 (Promega, EUA). As células BGC-823 foram plaqueadas a uma densidade de 5 x 10 ^{5 por poço numa placa de 12 poços antes das transfecções. As células foram transfectadas com PGL-3 repórteres de luciferase de pirilampo (1 ug por poço), pRL-TK (50 ng por poço) e miR-29 imita /inibidor (50 nM) ou controlo imita /inibidores negativos (50 nm) utilizando Lipofectamine- 2,000 reagente de transfecção (Invitrogen, Carlsbad, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. A actividade de luciferase foi testado 48 horas após a transfecção usando o Ensaio de Actividade Sistema Dual-Luciferase (Promega, EUA). Todos os experimentos foram realizados como três repetições independentes.}

A análise estatística

O Student independente do t
-test foi utilizado para comparar os resultados, que são expressos como o ± médios SD entre quaisquer dois grupos de pré-seleccionados. Para determinar correlações entre as variáveis, 's Pearson
coeficiente de correlação foi calculado. A P
-valor foi considerado estatisticamente significativo inferior a 0,05.

Resultados

miR-29b /c é necessária e suficiente para a migração celular GC

estudos anteriores implicam que o miR-29b /c é crítica para a invasão de células de GC. Para melhor avaliar se o miR-29b /c é responsável pela migração de células GC, um foram realizados in vitro
zero cicatrização de ensaio e ensaio Transwell. Após transientemente transfectar as miR-29b /c imita ou um controlo negativo para as células BGC-823, a ferida ensaio curando mostrou que as células com a expressão forçada de miR-29b /c apresentado uma recuperação significativamente mais lenta em comparação com as células de controlo (Fig 1A). Do mesmo modo, o ensaio de migração Transwell mostrou que a sobre-expressão de miR-29b /C foi significativamente associado com menor migração do que os controlos ( P
< 0,05, Figura 1B). Além disso, consistente com outros dados em MGC-803 células de GC HGC-207 e [14], as células miR-29b /c superexpressão também revelou uma redução significativa na capacidade invasiva no ensaio Matrigel invasão ( P <
; 0,05, Figura 1C). Estes resultados sugerem que o miR-29b /c não é apenas importante para a invasão de células de GC, mas também para a migração celular. Para confirmar ainda mais os efeitos supressores de miR-29b /c na migração celular e invasão de GC, as células BGC-823 foram transientemente transfectadas com os inibidores de miR-29b /c ou um controlo negativo. A supressão de miR-29b /C aumentou significativamente as capacidades migratórias e invasivos de células de GC, que foi avaliado pela cicatrização de feridas (Figura 1D) e um ensaio Transwell ( P
< 0,05, Figura 1E e Fig 1F). Colectivamente, estes resultados indicam que o miR-29b /c aboliu eficazmente a migração celular e invasão de GC, o que, por conseguinte, contribuíram para as fases iniciais da progressão maligna de GC.

DNMT3A é um alvo transcricional directo do miR-29b /c em GC

Para compreender o mecanismo subjacente ao efeito de miR-29b /c sobre a migração e invasão celular, investigamos os alvos de miR-29b /c. DNMT3A 3'UTR é complementar a miR-29b /c e é um gene alvo direto de miR-29b /c, portanto, foi realizado um ensaio de repórter em células BGC-823. O ARNm DNMT3A 3'UTR foi inserido na região a jusante de um gene repórter da luciferase a partir do vector pGL-3 (ou seja DNMT3A 3'UTR-Luc). As construções foram depois co-transfectados com os imitadores de controlo negativo para as células BGC-823 pRL-TK e os miR-29b /c imita ou. Como mostrado na Fig 2A, a actividade de luciferase relativa foi significativamente reduzida nos vectores de PGL-3 com a DNMT3A 3'UTR ( P
< 0,05). No entanto, as construções de co-transfectadas com o inibidor /c miR-29b não afectou a actividade de luciferase dos vectores de PGL-3 com a DNMT3A 3'UTR em comparação com as construções de co-transfectadas com o inibidor de controlo negativa (Figura 2B). Para validar ainda mais esta interacção miARN alvo, RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) e transferências de Western foram realizadas para confirmar a regulação da DNMT3A por miR-29b /c. Nós transfectadas transitoriamente as miR-29b /c imita ou imita controlo negativo nas células BGC-823. O aumento do miR-29b /C reduziu a expressão DNMT3A no ARNm (Figura 2C) e os níveis de proteína (Figura 2E, lane1-3). Por outro lado, o miR-29b /c down-regulação por seu inibidor aumentou a expressão DNMT3A no mRNA (Fig 2D) e os níveis de proteína (Fig 2E, lane4-6). Colectivamente, estes resultados indicam que DNMT3A é um alvo da transcrição direta de miR-29b /c e está negativamente associado com miR-29b /c expressão em células de GC.

miR-29b /c é suprimida por DNMT3A em um DNA dependente de metilação forma

Dado que a hipermetilação aberrante é fundamental para miRNA infra-regulação, nós especulamos que existe feedback negativo entre o miR-29b /c e DNMT3A. Para testar esta hipótese, a presença de metilação de CpG ilha na região promotora do miR-29b /c foi avaliado por uma análise BGS nas células knockdown-dnmt3a. Como mostrado na Fig 3A, 7 locais CpG individuais dentro das regiões ilha CpG (5 kb a montante do miR-29b /c) foram sequenciados para identificar resíduos de citosina metilados. A frequência de miR-29b /c metilação do promotor em células DNMT3A-knockdown foi de 34,2%, que foi significativamente menor do que as células de controlo (58,6%; Fig 3B). Este resultado indica que o silenciamento transcricional de miR-29b /C em células GC está associada com a presença de CpG hipermetilação ilha, que foi confirmada pela medição madura miR-29b /c por qRT-PCR. Não foi aumentada significativamente miR-29b /c expressão nas células AGS-shDNMT3A e BGC-shDNMT3A comparados com os controles (Fig 3C). Estes resultados indicam uma base molecular importante para miR29-b /c infra-regulação e apoiar a hipótese de que há cross-talk entre miR-29b /c e DNMT3A.

DNMT3A promove a migração de células GC

a ligação molecular entre miR-29b /c e DNMT3A levantou a questão do envolvimento DNMT3A na migração de células GC. Nós ainda aplicada in vitro
ensaios para determinar as alterações funcionais no comportamento das células seguintes expressão alterada de DNMT3A. O ensaio de cicatrização da ferida demonstraram uma recuperação significativamente mais lenta nas células BGC-shDNMT3A em comparação com as células de controlo (Fig 4A, em cima), mas apenas uma modesta recuperação nas células AGS-shDNMT3A em comparação com as células de controlo (Fig 4A, parte inferior). Estes resultados indicam que DNMT3A é importante para a mobilidade celular. Dado que as moléculas de adesão celular são importantes para a motilidade celular, a expressão de CDH1 e vimentina foram examinados por qRT-PCR e Western blot. Knockdown de expressão DNMT3A aumentou significativamente a expressão CDH1 em ambos os níveis de mRNA e proteína, mas não teve um efeito notável sobre a expressão de vimentina (Figura 4B e 4C), sugerindo que CDH1 pode ser um alvo de desregulação DNMT3A-mediada de células motilidade. Além disso, foi realizado um ensaio BGS no gene CDH1 nas células knockdown-dnmt3a. Como mostrado na Fig 4D, a percentagem de CpG metilados localizados dentro CDH1 foi menor nas células empobrecido-dnmt3a do que nas células de controlo (35,8% vs 94,1%). Estes resultados indicam que a expressão anormal de DNMT3A leva a um silenciamento epigenético de CDH1.

miR-29b /c está envolvida na supressão da CDH1

Para investigar adicionalmente o efeito de miR- alterada 29b expressão /c no CDH1, nós transfectadas transitoriamente as miR-29b /c imita ou controle negativo imitar em células BGC-823. Comparado com os controlos, a expressão forçada de miR-29b /C aumentou significativamente a expressão de CDH1, tanto o ARNm e os níveis de proteína (FIG 4E e 4F). Subsequentemente, o estado de metilação da região promotora de CDH1 foi examinada utilizando um ensaio de BGS nas miR-29b /c imita ou controlo negativo imitam transientemente transfectadas células BGC-823. Os resultados mostraram que a frequência de CDH1 promotor metilação nas células superexpressão /c miR-29b foi de 5,2% ou 12,9%, que foi significativamente menor do que o nível medido nas células de controlo (88,2%; Figura 4G). Estes dados eram consistentes com o resultado de que DNMT3A knockdown medeia a sobre-regulação de CDH1 e demonstra que a desregulação de miR-29b /C e DNMT3A estão envolvidos na migração celular e invasão de GC.

A diminuição da expressão de miR-29b e 29c-miR em tecidos GC

A expressão de miR-29b /C em 50 tumores GC e tecidos não tumorais emparelhados foi examinada por qRT-PCR. Em comparação com os tecidos não tumorais emparelhados, a frequência de miR-29b e 29c-miR sub-regulação (definida como uma redução maior do que duas vezes) foi de 66% (33/50) e 60% (30/50), respectivamente (Figura 5A e 5B). A variação média da dobra de miR-29b e miR-29c foi significativamente inferior nos tecidos de tumor do que nos tecidos não tumorais ( P
< 0,01, Figura 5C e 5D). Para explorar o significado clínico-patológico dos miR-29b e miR-29C padrões de expressão em tumorigênese GC, as características clínicas dos pacientes do GC foram analisados. Todos os 43 pacientes analisados ​​foram classificados em dois grupos de acordo com miR-29b e níveis de expressão de miR-29C. Diminuição miR-29b fortemente correlacionada com o grau de diferenciação de células tumorais e invasão, ao passo que diminuiu o miR-29c única correlacionado com a invasão do tumor (Tabela 1). Além disso, a relação entre o miR-29b /expressão de c e DNMT3A expressão foi testada em 33 casos de GC. Um estudo de associação mostraram que a expressão DNMT3A foi negativamente correlacionada com miR-29b ( R
= -0,640, P Art < 0,01, Fig 5E) e miR-29c ( R
= -0,349, P Art < 0,05, Fig 5F). Colectivamente, estes dados indicam que o miR-29b /c pode desempenhar um papel importante na progressão da carcinogênese gástrica.

Discussão

A família miR-29 conservada, incluindo miR-29a, miR- 29b e miR-29c, está implicada em vários processos de adega, tais como a proliferação, diferenciação, apoptose e metástases, tornando-se uma família bem analisadas de miARNs na tumorigénese [16]. Estudos anteriores demonstraram que o aumento da expressão de miR-29a está associada a melhores taxas de sobrevida global em fase II, os doentes com cancro do cólon [27] e menores níveis de miR-29b poderia promover metástase de câncer de próstata regulando as vias de transição sinalização epiteliais-mesenquimais [28] . Além disso, as funções de miR-29C como um supressor de metástase que inibe a adesão de células do cancro do pulmão para a matriz extracelular e migração in vitro
e in vivo
[29]. Em GC, reduziram significativamente os níveis de miR-29b e miR-29C, em particular, têm sido observadas em comparação com o miR-29a [14], sugerindo que o miR-29b /C pode desempenhar um papel mais importante. Assim, miR-29b /c foi selecionado para análise neste estudo. No presente estudo, mostrou um aumento de miR-29b /c suprime a migração e a invasão de células BGC-823, utilizando um ensaio de cicatrização da ferida e um ensaio Transwell. Estes resultados são consistentes com outros dados relatados obtidos a partir SGC-7901, HGC-27 e MGC-803 células de GC [14, 15]. Dado que miR-29b /c também desempenham um papel na proliferação e apoptose em GC, avaliamos a capacidade do crescimento celular e os níveis de apoptose celular em células BGC-823. Os resultados mostraram que não há diferença na proliferação em 48 horas para miR-29b /c imita ou células transfectadas com inibidores, em comparação com as células de controlo negativo ( P
> 0,05, S2A e Fig S2B). Além disso, Anexina-V coloração não demonstrou aumento dramático nos níveis de apoptose nas células miR-29b /c imita-transfectadas após 48 horas de incubação (Fig S2C). Além disso, a análise do ciclo celular não apresentaram diferenças significativas em G1, S, G2 /M fases após o tratamento com os miR-29b /c imita ou imita controlo negativo para 48 horas ( P Art > 0,05, S2D FIG). Estes dados sugerem que miR-29b /c retarda ferida recuperação da área em 48 horas, principalmente por causa das habilidades motilidade celular diminuiu.

miRNAs exercem suas funções, principalmente, visando os 3'UTRs de diferentes genes. No entanto, os mecanismos moleculares detalhados de miR-29b /c relacionados com o desenvolvimento de GC maligna são mal compreendidos. Notavelmente, miR-29b /c compartilha a mesma complementaridade a sites na 3'UTR de DNMT3A, que foi predito por programas de previsão de alvo, incluindo TargetScan, Miranda e miRBase. Ainda não se sabe se o miR-29b /c regula a metilação anormal de genes associados com a metástase através da interacção com DNMT3A durante o desenvolvimento de GC. Por isso, foi realizado um ensaio de repórter luciferase e descobriu que uma expressão alta DNMT3A foi associada com baixa miR-29b /c expressão em células de GC, indicando DNMT3A é um alvo da transcrição direta de miR-29b /c. No entanto, a base molecular que leva ao desequilíbrio de miR-29b /C em GC permanece desconhecida. miR-29 promotores proximais têm sítios de ligação para vários fatores de transcrição, tais como c-Myc e CEBPA, que contribuem para a desregulamentação de miR-29 [30, 31]. No entanto, a investigação sobre a regulação epigenética de miRNA-29 não tem sido relatada.

Nas células eucarióticas, há três metiltransferases de ADN enzimaticamente activas (DNMTs), DNMT1, dnmt3a e DNMT3B. A expressão de DNMT3A em GC é significativamente mais elevada do que a de DNMT3B [32, 33]. Além disso, apenas o aumento da expressão DNMT3A está significativamente associado com um período mais curto sobrevida livre de doença em GC [34], o que indica DNMT3A desempenha papéis mais importantes na carcinogênese gástrica. Assim, teve como objetivo investigar se existem regulamentos de realimentação negativa entre miR-29b /c e DNMT3A. Neste estudo, foi utilizado um ensaio BGS analisar o estado de metilação do DNA de miR-29b /c em células DNMT3A RNAi GC. De fato, a diminuição do miR-29b /c foi parcialmente devido à hipermetilação DNMT3A mediada. Além disso, confirmou que DNMT3A está envolvido na promoção da migração celular GC via CDH1-regulação para baixo. Enquanto isso, também mostraram que o miR-29b /c está envolvida na supressão da CDH1. Uma característica da metástase do cancro é a perda de expressão CDH1 [35], e dentro hipermetilação da região promotora do CDH1 também é observada em GC [36]. Assim, nossos resultados demonstram que tanto miR-29b /c e DNMT3A estão associados com CDH1 down-regulação através de hipermetilação do promotor mediada por DNMT3A. O papel de outros DMNTs, por exemplo DNMT3B, na regulação do miR-29b /c deve ser analisada em estudos futuros.

Nos espécimes GC, examinamos o padrão de miR-29b /c expressão em 50 pares de tecidos CG. Diminuição miR-29b /c (dobre-a mudança de corte: 2,0) foi significativamente correlacionada com o grau de diferenciação e invasão no GC, o que sugere que o miR-29b /c desempenha um papel crítico na manutenção maligna GC e demonstra diretamente o significado clínico da miR -29b /c em progressão GC. Em resumo, o nosso estudo revela que pode haver interferência entre o miR-29b /C e DNMT3A. Um desequilíbrio desses fatores podem estar envolvidos na migração de GC e invasão fenótipos. Este desequilíbrio pode incluir a expressão de baixo nível de miR-29b /c poderiam suprimir a supressão de DNMT3A e altos níveis de DNMT3A afecta ainda mais a expressão do miR-29b /c por um mecanismo epigenético. Esses achados podem ser benéficos para o desenvolvimento de novas opções de tratamento para o GC que visam miR-29b /c e sua DNMT3A gene a jusante.

Informações de Apoio
S1 Fig. A percentagem de eficiência de transfecção foi fornecida por avaliação dos níveis de miR-29b /c ou DNMT3A.
(A e B) de qRT-PCR foi realizada para detectar a expressão relativa de miR-29b /C em BGC-823 células com imita (A) ou inibidores (B) após 48 horas de transfecção. (C) RT-PCR e Western blot foram realizados para detectar a eficácia de DNMT3A knockdown em células BGC e AGS. β
actina foi usado como um controle de carga
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123926.s001
(TIF)
S2 Fig. O papel de miR-29b /C no ciclo de proliferação de células BGC-823, e apoptose celular.
(A) As taxas de crescimento de células de miR-29b /c sobre-expressão foram detectados por ensaio de proliferação de CCK-8. miR-29b /c superexpressão mostrou nenhuma diferença notável em 48 horas em comparação com células de controlo negativo ( P
> 0,05). (B) As taxas de crescimento de células de miR-29b /c inibição foram detectados por ensaio de proliferação de CCK-8. A supressão de miR-29b /c não mostraram alterações significativas às 48 horas em comparação com células de controlo negativo ( P Art > 0,05). ensaio (C) que mostra a apoptose sem indução de apoptose pela dramática miR-29b /c sobre-expressão em 48 horas em comparação com células de controlo negativo. O histograma biparametric mostra célula no início (quadrante inferior direito) e os estados apoptóticos tardias (quadrante superior direito). (D) O ensaio do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo em células BGC-823 depois de miR-29b /c imita ou tratamento imita controlo negativo durante 48 horas. As percentagens de miR-29b /C ou sobre-expressão de controlo em células G1, S e G2 /M estão apresentados no gráfico de barras como a média ± D.P.. de três experiências independentes. Em comparação com células de controlo, não houve efeito significativo sobre o ciclo celular após miR-29b /c superexpressão
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123926.s002
(TIF)
S1 Method. o crescimento celular e ensaio de apoptose
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123926.s003
(DOC)
Método S2. . Do ciclo celular ensaio
doi: 10.1371 /journal.pone.0123926.s004
(DOC)
Tabela S1. As características clínicas de pacientes com câncer gástrico
doi: 10.1371. /journal.pone.0123926.s005
(DOC)
S2 tabela. . MiRNA imitar e inibidor de sequências e iniciadores utilizados neste estudo
doi: 10.1371 /journal.pone.0123926.s006
(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Gang Chen de Nanquim Hospital para a recolha de amostras. Agradecemos Prof. Sheng Zhong, da Universidade Medical Capital para ajudar a modificar o manuscrito.

• PLOS ONE: Chrysin inibe Tumor Induzido por Promotor MMP-9 Expressão de Bloqueio de AP-1 via Supressão de ERK e JNK Pathways em células de câncer gástrico
• PLOS ONE: Efeito da Erradicação da Helicobacter pylori em níveis de expressão de FHIT, IL-8 e P73 na Mucosa Gástrica de parentes de primeiro grau de pacientes com câncer gástrico