PLOS ONE: Avreglering mellan MIR-29b /c och DNMT3A förknippas med Epigenetisk Tysta av CDH1 Gene, som påverkar cellmigration och invasion i Gastric Cancer

Abstrakt

avregleringen av Mir-29 familjen och DNA-metyltransferas 3A (DNMT3A) är associerad med gastrisk cancer (GC). Medan allt fler bevis tyder på MIR-29b /c kunde reglera DNA-metylering genom att rikta DNMT3A, är det för närvarande okänt om epigenetisk tysta MIR-29b /c via promotor hypermethylation i GC orsakas av onormal uttryck för DNMT3A. Således, syftar vi att utvärdera om överhörning reglering existerar mellan MIR-29b /c och DNMT3A och om det är förenat med en malign fenotyp i GC. Först, sårläkning och Transwell-analyser visade att MIR-29b /c trycker tumörmetastas i GC. En luciferas reporter analys visade att DNMT3A är ett direkt mål för MIR-29b /c. Vi använde bisulfit genomisk sekvensering för att analysera DNA-metylering status MIR-29b /c. Procentandelen metylerade CpG minskade signifikant i DNMT3A utarmade celler jämfört med kontrollerna. Vidare medverkan av DNMT3A främja GC cell migration i samband med promotorn metylering-medierad repression av CDH1. I 50 parade kliniska GC vävnadsprover, minskat MIR-29b /c var signifikant korrelerad med graden av differentiering och invasionen av celler och negativt korrelerad med DNMT3A uttryck. Tillsammans våra preliminära resultat tyder på att följande processen kan vara inblandade i GC tumörbildning. MIR-29b /c trycker nedströms genen DNMT3A, och i sin tur, är miR-29b /c tryckas genom DNMT3A i en DNA-metylering beroende sätt. Avregleringen av båda MIR-29b /c och DNMT3A leder till den epigenetiska tysta CDH1 och bidrar till metastaser fenotyp i GC. Denna upptäckt visar att DNA-metylering associerade tysta MIR-29b /c är avgörande för GC utveckling och därmed kan vara ett terapeutiskt mål

Citation. Cui H, Wang L, Gong P, Zhao C, Zhang S , Zhang K, et al. (2015) Avreglering mellan MIR-29b /c och DNMT3A förknippas med Epigenetisk Tysta av CDH1 Gene, som påverkar cellmigration och invasion i magcancer. PLoS ONE 10 (4): e0123926. doi: 10.1371 /journal.pone.0123926

Academic Redaktör: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA

Mottagna: 4 september 2014. Accepteras: 9 mars 2015, Publicerad: 15 april 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet: Alla relevanta uppgifter är inom pappers- och dess stödjande information filer

Finansiering:. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (Grant nr 81.171.915, nr 91.229.107 och nr 81.472.548), http: //www .nsfc.gov.cn /. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer (GC) är den näst mest dödliga malignitet i världen. Den står för sammanlagt cirka 1 miljon nya fall och 0,7 miljoner dödsfall årligen, över 70% av som förekommer i utvecklingsländerna, särskilt i östasiatiska länder [1]. Även botas om de upptäcks tidigt, de flesta GC patienter diagnosen sent skede av sjukdomen. För patienter med operabel sjukdom, är konventionell kirurgi och kombinations kemoterapier anges. Emellertid är den totala 5-års överlevnad på GC patienter yngre än 30% [1, 2]. Noterbart är GC ofta åtföljs av peritoneal spridning och metastaser till regionala lymfkörtlar och avlägsna organ genom lymfatiska och venösa kärl [3]. Således kan identifiera molekylära avvikelser i GC förbättra vår förståelse av gastric cancer och hjälpa oss dela patienter i biologiskt och kliniskt relevanta undergrupper, samt utveckla nya behandlingsstrategier.

MicroRNAs (miRNA) är en klass av endogena, små, icke-kodande reglerande RNA på cirka 20-25 nukleotider som negativt reglerar genuttryck genom att hämma translation eller förmå mRNA nedbrytning genom baspaming med 3 'otranslaterad region (3'UTR) av mål budbärar-RNA (mRNA) [4]. Förändrade expressionsnivåer av miRNA har rapporterats i många cancerformer och resultera i avvikande uttryck av målgener som påverkar malignt beteende, såsom proliferation, resistens mot apoptos och metastaser [5-7]. Ökande bevis visar att avreglerade miRNA (t.ex. MIR-17, MIR-129, MIR-148a, och MIR-378) bidrar till gastric cancer [8-10], som tyder på att miRNA kan användas som diagnostiska och prognostiska biomarkörer i GC .

Mir-29 familjen (MIR-29s) är en konserverad familj av miRNA som innehåller MIR-29a /b /c. Minskat uttryck av MIR-29s har beskrivits i flera cancerformer, inklusive GC [11-14]. Tidigare studier visar att MIR-29s spelar en dominerande roll i GC celltillväxt, cellcykelprogression, apoptos och cellrörlighet [14, 15]. Potentiella mål för MIR-29s som bidrar till den maligna GC fenotypen inkluderar Cdc42, CCND2 och MMP2 [14, 15]. Dessutom har vissa studier identifierade MIR-29s som bidragsgivare till regleringen av DNA-metylering genom att rikta DNMT3s i lungcancer [13]. Dessutom har flera målgener, såsom TCL-1, CDK6, laminin-1, och MCL-1, också rapporterats i andra cancer [16]. Noterbart är trots bevis miRNA-29s kan fungera som tumörsuppressorgener, en viktig fråga som rör miRNA-29s uttryck fortfarande delvis olöst. Vilka är mekanismerna för kontroll av miRNA-29s uttryck i GC-celler? Det har rapporterats, att c-Myc är involverad i MIR-29a /b repression [17]. Identifiera ytterligare undertryckningsmekanismer är av intresse.

Det är känt att den transkriptionella tysta tumörsuppressorgener (GTS) av CpG-ö hypermetylering är ett vanligt kännetecken för karcinogenes. Intressant nog liknar proteinkodande GTS, ett väsentligt antal miRNA regleras av promotor metylering [18-20]. I själva verket har det funnits ett ökande antal studier som visar att tumörhämmande miRNA, såsom MIR-34b, MIR-129, och MIR-124, ofta tystas genom DNA-metylering i GC [21-23]. Baserat på programanalys CpG Island Searcher visade vår förutsägelse att miRNA-29b /c innehåller CpG-öar i deras förmodade promotorregioner. Det är dock ännu inte klart om avvikande DNA hypermethylation står för dysreglering av MIR-29b /c. Dessutom är det okänt huruvida en återkopplingsreglering föreligger mellan miR-29b /c och DNMT3s. I själva verket har ingen tidigare studie undersökte metylering status MIR-29b /c i GC-celler, och ingen har undersökt sambandet mellan metylering av MIR-29b /c och uttrycksnivåer av DNMT3s. I denna studie fann vi att MIR-29b /c trycks uttrycket av DNMT3A genom att rikta sin 3'UTR, vilket bidrog till att hämma GC cell migration och invasion. Å andra sidan, DNMT3A nedreglerade miR-29b /c via aberrant hypermethylation av promotorn. Det föreligger således en potentiell återkopplingsslinga mellan miR-29b /c och DNMT3A, i vilket nedreglering av MIR-29b /c upphäver undertryckande av DNMT3A. Samtidigt påverkar uppreglering av DNMT3A uttrycket av MIR-29b /c av promotor metylering. Dessa resultat tyder på en överhörning mellan miR-29b /c och DNMT3A. Deras obalans och avreglering är orsak med en epigenetisk mekanism som kan vara inblandade i GC cell migration och invasion egenskaper.

Material och metoder

Cellodling

GC cellinjer, inklusive AGS och BGC-823, erhölls från Cell Bank of Chinese Academy of Science och hölls i RPMI-1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U /ml penicillin och 100 mg /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) i en fuktad inkubator med 5% CO _{2 atmosfär vid 37 ° C.}

Vävnadsprover prover~~POS=HEADCOMP

50 par GC vävnader och deras angränsande godartade vävnadsprover samlades in mellan 2011 och 2013 från Jiang Hospital of Nanjing. Den kliniska informationen av patienterna med GC visas i S1 tabell. Studien godkändes av kommittén för etikprövning av forskning vid Jiang sjukhus i Nanjing i Kina, och patienterna tecknat informerat samtycke former. Alla vävnadsprover erhölls från patienter med GC. De samlades under operation och omedelbart snabbfrystes i flytande kväve tills RNA och protein extraktion.

omvänd transkriptionsreaktion och kvantitativ realtids-PCR (qPCR) Review

Totalt RNA extraherades från cellerna och vävnader skördas med Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) enligt tillverkarens anvisningar.

för att detektera miRNA uttryck, var en stam-loop RT-PCR utfördes såsom tidigare beskrivits [24], och U6 små RNA var används som en intern kontroll. qPCR utfördes med användning av SYBR förblandning Ex Taq (Takara, Dalian, Kina) enligt tillverkarens protokoll. Det relativa uttrycket utvärderades genom jämförande CT-metoden. Primersekvenserna för varje gen visas i S2 Tabell.

Western blot

Western blöts utfördes med användning av anti-DNMT3A (Abcam, Cambridge, UK), anti-CDH1 (Abcam, Cambridge, UK), anti-Vimentin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) och anti- β
aktin antikroppar (Sigma, Ronkonkoma, NY, USA), och detekterings utfördes med Super Signal kemiluminiscens substrat (Pierce, Rockford, IL, USA).

transfektion

mIR-29b /c härmar /hämmare och negativa kontroll molekyler (scramble kontroll härma och hämmare) syntetiserades och renades av GenePharma Company (Shanghai, Kina). Sekvenserna visas i S2 tabell. De transfekterades in i cellerna i en slutkoncentration av 50 nM med användning av Lipofectamine-2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) enligt tillverkarens protokoll. Mediet byttes efter 6 timmar. Cellerna odlades under 48 timmar och skördades för analys. Den procentuella transfektionseffektivitet bestämdes genom en utvärdering av halterna av MIR-29b /c uttryck eller knockdown efter transfektioner (S1A och S1B FIG). Protokollet för att fastställa DNMT3A stabila knockdown celler har beskrivits i vårt tidigare arbete [25]. Uttrycket av DNMT3A minskade dramatiskt under de BGC-shDNTM3A och AGS-shDNTM3A celler (S1C FIG) jämfört med kontrollcellerna.

sårläkning, migration och invasionsanalyser

Cell rörlighet utsattes för sårläkningsanalysanalys såsom beskrivits tidigare [26]. En repa sår genererades med hjälp av en 200 mikroliter pipettspets på sammanflytande cellmonoskikt i sex brunnar. Cellerna tvättades sedan med färskt medium för att avlägsna flytande celler, och spridningen av sårtillslutning observerades efter 48 timmar och fotograferades under ett mikroskop. Potentialen för migration och invasion av de transfekterade cellerna utvärderades av en Transwell-analys. Cellerna odlades till 70% konfluens och transfekterades i 24 timmar med Mir-29b /c härmar eller kontroll härmar, och MIR-29b /c-hämmare eller kontroll hämmare. I analys migration, odlades cellerna i 200 ml medium med 1% fetalt bovint serum i den övre kammaren av en icke-belagd transwell insert. I den nedre kammaren, var 600 ml medium med 10% fetalt bovint serum används som ett kemoattraherande för att uppmuntra cellmigration. I invasionen analysen var den övre kammaren av Transwell skär belagda med 50 ml av 1,0 mg /ml Matrigel, och cellerna ströks ut i den övre kammaren av Matrigel-belagda transwell insats (Millipore, USA). Efter 24-h inkubation avlägsnades de icke-migrerande eller icke-invaderande celler försiktigt bort med en bomullspinne. Alla cellerna färgades med användning av 0,1% kristallviolett färgning och räknades i 5 fält under ett inverterat mikroskop. De oberoende experiment upprepades tre gånger.

bisulfit genomisk sekvensering (BGS) Review

Genomiskt DNA extraherades från cellerna med användning av fenol-kloroform-metoden. Bisulfit behandling genomfördes av CpGenome Universal DNA Modification Kit (Millipore, USA) enligt tillverkarens instruktioner. PCR-produkter för bisulfit sekvense var gelrenades och subklonades in i en pMD19-T-vektor-system (Takara, Dalian, Kina). Minst tio kolonier sekvenserades för att bedöma graden av metylering vid varje CpG plats. Primrarna är listade i S2 tabell.

Luciferase reporter assay

Protokollet för luciferas reportern analysen har beskrivits tidigare [14]. 3'UTR av humant DNMT3A PCR-amplifierades och klonades in mellan Not I och Xba I-ställena av pGL-3 (Promega, USA). BGC-823 celler ströks ut med en densitet av 5 x 10 ^{5 per brunn i en 12-brunnar före transfektioner. Cellerna transfekterades med pGL-3 eldflugeluciferas reportrar (1 | ig per brunn), pRL-TK (50 ng per brunn) och miR-29 härmar /inhibitor (50 nM) eller negativa kontroll härmar /hämmare (50 nM) med användning Lipofectamine- 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) enligt tillverkarens protokoll. Luciferasaktivitet testades 48 timmar efter transfektion med användning av Dual-Luciferas Activity Assay System (Promega, USA). Alla experiment utfördes som tre oberoende replikat.}

Statistisk analys

Den oberoende Studentens t
-test användes för att jämföra resultaten, som uttrycks som medelvärdet ± sd mellan två förvalda grupper. För att bestämma korrelationer mellan variablerna, Pearson
s korrelationskoefficient beräknades. En P
-värde mindre än 0,05 ansågs statistiskt signifikant.

Resultat

MIR-29b /c krävs och tillräcklig för GC cellmigration

tidigare studier tyder på att mIR-29b /c är avgörande för GC cellinvasion. För att ytterligare utvärdera huruvida MIR-29b /c är ansvarig för GC cellmigration, en In vitro
scratch sårläknings analys och Transwell-analysen genomfördes. Efter övergående transfektion Mir-29b /c härmar eller negativ kontroll i BGC-823 celler, sårläknings analysen visade att cellerna med tvångs uttrycket av MIR-29b /c visas en märkbart långsammare återhämtning jämfört med kontrollcellerna (fig 1A). På samma sätt, migration analysen Transwell visade att överuttryck av MIR-29b /c var associerat med betydligt mindre migration än kontrollerna ( P Hotel < 0,05, Fig 1B). Dessutom överensstämmer med andra uppgifter i HGC-207 och MGC-803 GC-celler [14], Mir-29b /c överuttryck celler visade också en signifikant minskning av invasiv förmåga i Matrigel invasionen analysen ( P Hotel < 0,05, Fig 1C). Dessa resultat tyder på att MIR-29b /c är inte bara viktigt för GC cellinvasion utan även för cellmigration. För att ytterligare bekräfta undertryckande effekterna av MIR-29b /C på GC cellmigration och invasion, var BGC-823-celler transfekterades med Mir-29b /c-hämmare eller en negativ kontroll. Borttagandet av MIR-29b /c signifikant ökad flytt och invasiva kapaciteten hos GC-celler, som bedömdes av sårläkning (Fig 1D) och en Transwell-analys ( P Hotel < 0,05, Fig 1E och fig 1F). Sammantaget indikerar dessa resultat att MIR-29b /c effektivt avskaffas GC cellmigration och invasion, som därför har bidragit till de tidiga stadierna av den elakartade utvecklingen av GC.

DNMT3A är en direkt transkriptionell mål av MIR-29b /c GC

för att förstå mekanismen bakom effekten av mIR-29b /c på cellmigrering och invasion, undersökte vi målen för mIR-29b /c. DNMT3A 3'UTR är ett komplement till MIR-29b /c och är en direkt målgen av MIR-29b /c, vilket vi genomfört en reporteranalys i BGC-823 celler. Den DNMT3A mRNA 3'UTR sattes in i nedströmsregionen av en luciferas reportergen från pGL-3-vektorn (nämligen DNMT3A 3'UTR-Luc). Konstruktionerna sedan samtransfekterades med pRL-TK och Mir-29b /c härmar eller negativa kontroll härmar in i BGC-823 celler. Som visas i figur 2A, var den relativa luciferasaktiviteten signifikant reducerad i PGL-3 vektorer med DNMT3A 3'UTR ( P Hotel < 0,05). Däremot ville konstruktioner samtransfekterade med Mir-29b /c-hämmare inte påverka luciferasaktiviteten av PGL-3 vektorer med DNMT3A 3'UTR jämfört med konstruktionerna samtransfekterade med den negativa kontrollen inhibitor (Fig 2B). För att ytterligare bekräfta denna miRNA-mål interaktion, var kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) och Western-blottar utfördes för att bekräfta regleringen av DNMT3A av MIR-29b /c. Vi transfekterades tillfälligt Mir-29b /c härmar eller negativa kontroll härmar i BGC-823 celler. Den ökade MIR-29b /c minskade DNMT3A uttryck på mRNA (Fig 2C) och proteinnivåer (Fig 2E, lane1-3). Omvänt, Mir-29b /c nedreglering av dess inhibitor ökade DNMT3A uttryck vid mRNA (Fig 2D) och proteinnivåer (Fig 2E, lane4-6). Tillsammans står dessa fynd tyder på att DNMT3A är en direkt transkriptionell mål av MIR-29b /c och negativt samband med MIR-29b /c uttryck i GC-celler.

MIR-29b /c undertrycks av DNMT3A i en DNA-metylering beroende sätt

Med tanke på att avvikande hypermetylering är avgörande för miRNA nedreglering, spekulerade vi att negativ återkoppling finns mellan mIR-29b /c och DNMT3A. För att testa denna hypotes var närvaron av CpG-ö-metylering i Mir-29b /c-promotorregionen utvärderas av en BGS analys i DNMT3A-knockdown celler. Som visas i figur 3A, 7 enskilda CpG platser inom CpG öregioner (5 kb uppströms från Mir-29b /c) sekvenserades för att identifiera metylerade cytosin rester. Frekvensen av MIR-29b /c promotor metylering i DNMT3A-knockdown celler var 34,2%, vilket var betydligt lägre än kontrollcellerna (58,6%, fig 3B). Detta resultat indikerar att transkriptionstyst Mir-29b /c i GC-celler är associerad med förekomsten av CpG-ö hypermethylation, vilket bekräftades genom att mäta mogna MIR-29b /c av QRT-PCR. Det var signifikant ökad MIR-29b /c uttryck i AGS-shDNMT3A och BGC-shDNMT3A celler jämfört med sina kontroller (Fig 3C). Dessa fynd tyder på en viktig molekylära grunden för miR29-b /c nedreglering och stödjer hypotesen att det finns överhörning mellan MIR-29b /c och DNMT3A.

DNMT3A främjar GC cell migration

den molekylära samband mellan mIR-29b /c och DNMT3A tog upp frågan om DNMT3A inblandning i GC cell migration. Vi tillämpade vidare In vitro
analyser för att fastställa de funktionella förändringar i cellens beteende efter förändrad expression av DNMT3A. Sårläknings analysen visade en märkbart långsammare återhämtning i BGC-shDNMT3A celler jämfört med kontrollcellerna (Figur 4A, Top), men endast en blygsam återhämtning i AGS-shDNMT3A celler jämfört med kontrollcellerna (Figur 4A, botten). Dessa resultat indikerar att DNMT3A är viktigt för cellrörlighet. Med tanke på att celladhesionsmolekyler är viktiga för cellrörlighet fick ett uttryck för CDH1 och Vimentin granskas av QRT-PCR och Western blot. Knockdown av DNMT3A uttryck ökade signifikant CDH1 uttryck på både mRNA och proteinnivåer, men inte har en anmärkningsvärd effekt på uttrycket av Vimentin (fig 4B och 4C), vilket tyder på att CDH1 kan vara ett mål för DNMT3A-medierad dysreglering av cell motilitet. Dessutom genomförde vi en BGS analys på CDH1 genen i DNMT3A-knockdown celler. Såsom visas i fig 4D, den procentuella andelen av metylerade CpG belägna inom CDH1 var lägre i de DNMT3A utarmade celler än i kontrollceller (35,8% kontra 94,1%). Dessa resultat tyder på att onormalt uttryck av DNMT3A leder till en epigenetisk tysta CDH1.

MIR-29b /c är inblandad i undertryckandet av CDH1

För att ytterligare undersöka effekten av förändrade MIR 29b /c uttryck på CDH1, transfekterades vi Mir-29b /c härmar eller negativ kontroll härma i BGC-823 celler. Jämfört med kontrollerna, tvångs uttrycket av MIR-29b /c avsevärt ökat uttryck av CDH1 både mRNA och proteinnivåer (Fig 4E och 4F). Därefter metylering status av promotorregionen av CDH1 undersöktes med hjälp av en BGS analys i Mir-29b /c härmar eller negativ kontroll efterliknar transfekterades BGC-823 celler. Resultaten visade att frekvensen av CDH1 promotor metylering i Mir-29b /c överuttryck celler var 5,2% eller 12,9%, vilket var betydligt lägre än den nivå som uppmätts i kontrollcellerna (88,2%, fig 4G). Dessa data överensstämde med resultatet att DNMT3A knockdown förmedlar uppreglering av CDH1 och visar att avregleringen av MIR-29b /c och DNMT3A är involverade i GC cell migration och invasion.

Minskad expression av mIR-29b och mIR-29c i GC vävnader

uttrycket av mIR-29b /C i 50 GC tumörer och parade icke-tumörvävnader undersöktes av QRT-PCR. Jämfört med de parade icke-tumörvävnader, frekvensen av MIR-29b och MIR-29c nedreglering (definierat som mer än två-faldig minskning) var 66% (33/50) och 60% (30/50), respektive (figur 5A och 5B). Den genomsnittliga faldig förändring av MIR-29b och MIR-29c var signifikant lägre i tumörvävnad än i de icke-tumörvävnader ( P Hotel < 0,01, Fig 5C och 5D). För att undersöka klinisk-patologisk betydelse Mir-29b och MIR-29c uttrycksmönster i GC tumörbildning, var de kliniska egenskaperna hos GC patienter analyserades. Samtliga 43 patienter analyserades kategoriseras i två grupper enligt MIR-29b och MIR-29c uttrycksnivåer. Minskade miR-29b starkt korrelerad med graden av tumörcellsdifferentiering och invasion, medan minskade miR-29c endast korrelerad med tumörinvasion (tabell 1). Vidare var förhållandet mellan MIR-29b /c uttryck och DNMT3A uttryck testas i 33 GC fall. En sammanslutning studie visade att DNMT3A uttryck negativt korrelerad med MIR-29b ( R
= -0,640, P Hotel < 0,01, Fig 5E) och MIR-29c ( R
= -0,349, P Hotel < 0,05, Fig 5F). Sammantaget indikerar dessa data att MIR-29b /c kan spela en viktig roll i utvecklingen av gastric cancer.

Diskussion

Den konserverade MIR-29 familjen, inklusive MIR-29a, MIR 29b och mIR-29c, är inblandad i flera källar processer, såsom proliferation, differentiering, apoptos och metastaser, vilket gör dem väl analyserade familj av miRNA i tumörbildning [16]. Tidigare studier har visat att ökat uttryck av MIR-29a är associerad med bättre övergripande överlevnad i etapp II koloncancerpatienter [27] och lägre nivåer av MIR-29b kan främja prostatacancer metastaser genom att reglera epitelceller-mesenkymala övergång signalvägar [28] . Dessutom, MIR-29c fungerar som en metastas suppressor som hämmar lungcancer celladhesion till den extracellulära matrisen och migration In vitro Mössor och In vivo
[29]. I GC betydligt sänkta nivåer av MIR-29b och MIR-29c, i synnerhet, har observerats jämfört med MIR-29a [14], vilket tyder på att MIR-29b /c kan spela en viktigare roll. Således var MIR-29b /c ut för analys i denna studie. I den aktuella studien, visade vi en ökad MIR-29b /c dämpar migration och invasion av BGC-823-celler med hjälp av en sårläkande analys och en Transwell-analys. Dessa resultat överensstämmer med andra rapporterade data som erhållits från SGC-7901, HGC-27 och MGC-803 GC-celler [14, 15]. Med tanke på att MIR-29b /c också spela roller i proliferation och apoptos i GC bedömde vi förmågan av celltillväxt och nivåerna av cell apoptos i BGC-823 celler. Resultaten visade att det inte finns någon skillnad i spridning på 48 timmar för MIR-29b /c härmar eller hämmare-transfekterade celler, jämfört med de negativa kontrollcellerna ( P Hotel > 0,05, S2A och S2B Fig). Vidare Annexin-V-färgning visade ingen dramatisk ökning av nivåerna av apoptos i Mir-29b /c härmar-transfekterade celler efter 48 timmars inkubation (S2C FIG). Dessutom visade cellcykelanalysen inga signifikanta skillnader i G1, S, G2 /M faser efter behandling med Mir-29b /c härmar eller negativa kontroll härmar för 48 timmar ( P Hotel > 0,05, S2D Fikon). Dessa data tyder på att MIR-29b /c saktar sårområdet återhämtning på 48 timmar främst på grund av den minskade cellrörlighet förmågor.

miRNAs utöva sina uppgifter i huvudsak genom att rikta de 3'UTRs av olika gener. Men de detaljerade molekylära mekanismerna för MIR-29b /c rör malignt GC utveckling dåligt kända. Noterbart är MIR-29b /c-aktier samma komplement till platser i 3'UTR av DNMT3A, som förutsågs av mål förutsägelse program, inklusive TargetScan, Miranda och miRBase. Det är ännu inte känt om MIR-29b /c reglerar onormal metylering av gener associerade med metastaser genom att interagera med DNMT3A under utvecklingen av GC. Därför genomförde vi en luciferas reporter analys och fann att en hög DNMT3A uttryck i samband med låg MIR-29b /c uttryck i GC-celler, vilket indikerar DNMT3A är en direkt transkriptionell mål av MIR-29b /c. Men den molekylära grunden som leder till obalans i MIR-29b /ci GC förblir okänd. MIR-29 proximala promotorerna har bindningsställen för flera transkriptionsfaktorer, såsom c-Myc och CEBPA, som bidrar till avregleringen av MIR-29s [30, 31]. Emellertid har forskning om epigenetisk reglering av miRNA-29s inte rapporterats.

I eukaryota celler, finns det tre enzymatiskt aktiva DNA-metyltransferaser (DNMTs), DNMT1, DNMT3A och DNMT3B. Uttrycket av DNMT3A i GC är signifikant högre än den för DNMT3B [32, 33]. Dessutom ökade endast DNMT3A uttryck signifikant associerade med en kortare sjukdomsfri överlevnad period i GC [34], vilket tyder på DNMT3A spelar mer viktiga roller i gastric cancer. Således, syftar vi att undersöka om negativ återkoppling regler existerar mellan MIR-29b /c och DNMT3A. I denna studie använde vi en BGS analys för att analysera DNA-metylering status MIR-29b /ci DNMT3A RNAi GC celler. Faktum är att den minskade MIR-29b /c var delvis på grund av DNMT3A-medierad hypermetylering. Dessutom bekräftade vi att DNMT3A är involverad i att främja GC cell migration via nedreglering CDH1. Samtidigt visade vi också att MIR-29b /c är involverad i undertryckande av CDH1. Ett kännetecken för cancermetastaser är förlusten av CDH1 expression [35], och hypermetylering inom CDH1 promotorregionen är också observerats i GC [36]. Således, våra resultat visar att både MIR-29b /c och DNMT3A är förknippade med CDH1 nedreglering genom DNMT3A-medierad promotor hypermethylation. Den roll som andra DMNTs, exempelvis DNMT3B i reglering av MIR-29b /c behöver undersökas i framtida studier.

I GC prover, undersökte vi uttrycksmönstret för MIR-29b /C i 50 par GC vävnader. Minskad MIR-29b /c (fold-change cutoff: 2,0) var signifikant korrelerad med differentieringen och invasion examen i GC, vilket tyder på att MIR-29b /c spelar en avgörande roll i GC maligna underhåll och direkt visar kliniska betydelsen av miR -29b /ci GC progression. Sammanfattningsvis avslöjar vår studie att det kan finnas överhörning mellan miR-29b /c och DNMT3A. En obalans av dessa faktorer kan vara involverade i GC migration och invasion fenotyper. Denna obalans kan inkludera låg nivå uttryck av MIR-29b /c kunde avskaffa undertryckande av DNMT3A och höga nivåer av DNMT3A ytterligare påverkar uttrycket av MIR-29b /c av en epigenetisk mekanism. Dessa fynd kan vara till nytta för utvecklingen av nya behandlingsalternativ för GC som riktar MIR-29b /c och dess nedströms gen DNMT3A.

Bakgrundsinformation
S1 Fig. Den procentuella transfektion effektivitet lämnades genom utvärdering av nivåer av MIR-29b /c eller DNMT3A.
(A och B) QRT-PCR utfördes för att detektera det relativa uttrycket av MIR-29b /c i BGC-823 celler med härmar (A) eller hämmare (B) efter 48 timmars transfektion. (C) RT-PCR och Western-blottar utfördes för att detektera effektivitet DNMT3A knockdown i BGC och AGS-celler. β
aktin användes som en laddningskontroll
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s001
(TIF) Review S2 Fig. Rollen av MIR-29b /c i BGC-823 celler spridning, apoptos och cellcykeln.
(A) celltillväxttakten för MIR-29b /c överuttryck detekterades genom CCK-8 proliferationsanalys. MIR-29b /c uttryck visade ingen anmärkningsvärd skillnad på 48 timmar jämfört med negativa kontrollceller ( P Hotel > 0,05). (B) Celltillväxttakten för MIR-29b /c inhibition detekterades genom CCK-8 proliferationsanalys. Undertryckandet av MIR-29b /c visade inga signifikanta förändringar vid 48 timmar jämfört med negativa kontrollceller ( P Hotel > 0,05). (C) Apoptos assay visar ingen dramatisk induktion av apoptos genom MIR-29b /c uttryck vid 48 timmar jämfört med negativa kontrollcellerna. Den biparametriska histogrammet visar cell i början (nedre högra kvadranten) och sena apoptotiska stater (övre högra kvadranten). (D) Cellcykeln utfördes genom flödescytometri på BGC-823-celler efter MIR-29b /c härmar eller negativ kontroll härmar behandling under 48 timmar. Procentandelarna av MIR-29b /c överuttryck eller kontrollceller i G1, är S, och G2 /M visas i stapeldiagrammet som medelvärdet ± standardavvikelse. av tre oberoende experiment. Jämfört med kontrollceller, det fanns ingen signifikant effekt på cellcykeln efter MIR-29b /c uttryck
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s002
(TIF) Review S1 metod. Celltillväxt och apoptos-analys
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s003
(DOC) Review S2 metod. . Cellcykel analys
doi: 10.1371 /journal.pone.0123926.s004
(DOC) Review S1 tabell. Kliniska egenskaper hos patienter med magcancer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123926.s005
(DOC) Review S2 tabell. . MiRNA härma och inhibitor sekvenser och primrar som används i denna studie
doi: 10,1371 /journal.pone.0123926.s006
(DOC) Review

Bekräftelser

Vi tackar Dr. Gang chen från Nanjing Jiang sjukhuset för att samla in prover. Vi tackar Prof. Sheng Zhong från Capital Medical University för att hjälpa att ändra manuskriptet.

• PLOS ONE: Chrysin hämmar tumör Promoter-inducerad MMP-9 uttryck genom att blockera AP-1 via bekämpande av ERK och JNK banor i Gastric cancerceller
• PLOS ONE: Effekt av utrotning av Helicobacter pylori på uttrycksnivåer av FHIT, IL-8 och P73 i magslemhinna av första graden av magcancer patienter