PLoS ONE: Cellule intratumorale IL-17-positivo Mast sono la fonte maggiore di IL-17 che è predittiva di sopravvivenza in cancro gastrico Patients

Estratto

L'interleuchina-17 (IL-17) è prevalente in tessuto tumorale e sopprime risposte immunitarie efficaci antitumorali. Tuttavia, la fonte del maggiore del tumore infiltrante-IL-17 e il suo contributo alla progressione tumorale nel carcinoma gastrico umano sono ancora poco chiare. In questo studio, abbiamo arruolato 112 pazienti affetti da cancro gastrico, immunofluorescenza è stato utilizzato per valutare la colocalizzazione di CD3, CD4, CD56, CD20, CD68, e triptasi mastocitaria (MCT) con IL-17. L'immunoistochimica è stato utilizzato per valutare la distribuzione della densità dei microvasi (CD34), CD66b ^{+, CD68 +, e + cellule FOXP3 in diverse aree microanatomical. Valore prognostico è stato determinato mediante analisi di Kaplan-Meier e un modello di regressione di Cox. I risultati hanno mostrato che i mastociti, ma non le cellule T o macrofagi, sono stati il ​​tipo di cellula predominante la produzione di IL-17 nel cancro gastrico. correlazioni positive significative sono state rilevate tra densità di mast cellule derivate da IL-17 e microvasi, neutrofili e cellule T regolatorie (Tregs). Futhermore, abbiamo scoperto che la maggior parte delle cellule endoteliali vascolari che esprimono il recettore dell'interleuchina-17 (IL-17R). L'analisi di Kaplan-Meier ha rivelato che l'aumento cellule intratumorale infiltrato albero e IL-17 + cellule, così come MCT + IL-17 + cellule, sono risultati significativamente associati con peggiore sopravvivenza generale. Questi risultati indicano che i mastociti sono la principale fonte di IL-17 nel cancro gastrico, e intratumorale IL-17 possono infiltrazione hanno promosso progressione tumorale aumentando l'angiogenesi nel microambiente tumorale attraverso l'asse di IL-17 /IL-17R. mastociti IL-17-positivi hanno mostrato un fattore prognostico nel carcinoma gastrico, che indica che l'immunoterapia mira mastociti potrebbe essere una strategia efficace per controllare intratumorale IL-17 infiltrazioni, e di conseguenza inversione immunosoppressione nel microambiente tumorale, facilitando l'immunoterapia del cancro.}

Visto: Liu X, Jin H, Zhang G, Lin X, Chen C, Sun J, et al. (2014) Le cellule intratumorale IL-17-positivo Mast sono la fonte maggiore di IL-17 che è predittiva di sopravvivenza in pazienti affetti da cancro gastrico. PLoS ONE 9 (9): e106834. doi: 10.1371 /journal.pone.0106834

Editor: Xin-Yuan Guan, l'Università di Hong Kong, Cina |

Ricevuto: 12 maggio 2014; Accettato: 1 Agosto 2014; Pubblicato: 8 settembre 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

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Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

nel corso degli ultimi decenni, sempre maggiore attenzione è stata prestata al meccanismo (s) di sfuggire immunosorveglianza nel microambiente tumorale e, in particolare, il rapporto tra infiammazione e immunosoppressione. Uno dei componenti più importanti del sistema immunitario in infiammazione associata con cancro è stata recentemente riconosciuta come l'interleuchina-17 (IL-17). IL-17 è dotato di funzioni pleiotropici e obiettivi multipli che sono stati per lo più esplorati in modelli murini, ma sempre più legata a malattie umane [1] - [5]. IL-17 è stata identificata in vari tumori, tra cui il cancro al seno [6], cancro gastrico [7], [8], il cancro del colon-retto [9], cancerogeno indotto il cancro della pelle [10], colangiocarcinoma intraepatico [11], e epatocellulare Il carcinoma [12]. IL-17-cellule che producono gradualmente aumentano di numero nel microambiente tumorale durante lo sviluppo del tumore e sono correlati con scarsa sopravvivenza in pazienti affetti da cancro-correlata.

E 'stato a lungo considerato che la principale fonte cellulare di IL-17 è CD4 ^{+ linfociti T (cellule Th17). Recentemente, molti studi rivolti IL-17 hanno dimostrato che IL-17 non è limitato ai linfociti Th17, ma si trova anche in una varietà di cellule immunitarie adattative e innate, comprese le cellule γδT, cellule NKT, cellule NK, mastociti, e granulociti [3], [13].}

cancro gastrico è uno dei tipi di cancro più comuni e una delle principali cause di morte per cancro in tutto il mondo [14]. Più di 1 milione di nuovi pazienti con diagnosi di cancro gastrico, ogni anno in tutto il mondo, il 42,5% dei quali sono in Cina. strategie terapeutiche tradizionali, tra cui la chirurgia, chemioterapia e la radioterapia sono i principali trattamenti per il cancro gastrico. Recentemente, l'immunoterapia dei tumori è stato messo a fuoco [15] - [17]. Tuttavia, immunosoppressione associata al tumore è una sfida importante per l'immunoterapia, perché indebolisce l'attività citotossica delle cellule T efficaci e le cellule natural killer. Durante lo sviluppo del tumore, immunosoppressione tumore è comunemente associato con l'infiammazione eccessiva e incontrollata nel microambiente tumorale [18]. E 'ben noto che più cellule infiammatorie infiltrano i tumori, tra cui mastociti, macrofagi, neutrofili sottotipi, così come i linfociti T e B, un segno distintivo di infiammazione associata al cancro [19].

Nel corso di studio , abbiamo esaminato le fonti cellulari di iL-17, la distribuzione, rilevanza funzionale, e il valore predittivo di iL-17-cellule che producono in 112 pazienti con carcinoma gastrico. Noi forniamo nuove intuizioni nel meccanismo potenziale (s) di IL-17 nel microambiente tumorale nei pazienti con cancro gastrico, valutando il rapporto tra IL-17-cellule produttrici e mediatori infiammatori. Il nostro obiettivo è quello di fornire ulteriori informazioni che possono essere utili per la progettazione di immunoterapie tumorali più efficaci che l'obiettivo di IL-17.

Materiali e Metodi

Etica dichiarazione

Prima di ricerca , il consenso informato è stato ottenuto da ogni paziente. autorizzazione appropriata è stata concessa dal comitato etico del primo ospedale affiliato, Medical College, Università di Zhejiang.

I campioni dei pazienti

In totale, 112 pazienti tra febbraio 2009 e marzo 2010 nel nostro ospedale sono stati arruolati . I pazienti che hanno incontrato sono stati selezionati i seguenti criteri: a) diagnosticato come cancro gastrico sulla base di patologia; b) ha ricevuto la resezione efficace. I criteri di esclusione erano pazienti che avevano evidenza di metastasi a distanza, evidenza di malattia concomitante autoimmune, l'HIV, o la sifilide e pazienti che hanno ricevuto la terapia antitumorale prima dell'intervento chirurgico. I criteri di resezione efficace sono stati definiti come la resezione senza tumore residuo (R0) o tumore residuo microscopico (R1), secondo il 7 ^{edizione del Joint della commissione per il cancro. Dopo la resezione curativa, i pazienti hanno ricevuto chemioterapia adiuvante sulla base di 5-flurouracil e platino secondo la classificazione patologica TNM. I pazienti sono stati seguiti fino a 3-6 mesi di intervallo, tra cui saggi del loro sangue periferico per i marcatori tumorali e l'ecografia e la TC ogni 6 mesi, endoscopio ogni 12 mesi. Le caratteristiche cliniche dei pazienti sono mostrate nella Tabella 1.}

immunoistochimica e immunofluorescenza

Routine ematossilina e eosina è stata eseguita per confermare la diagnosi patologica, intratumorale regione è stata definita come meno di 2 cm al confine con il margine di del tumore allo stomaco, mentre la regione normale è stato definito come almeno 5 cm che si affacciano sul margine del tumore allo stomaco.

l'immunoistochimica

l'immunoistochimica è stata eseguita come descritto nel nostro precedente studio [20]. Gli anticorpi primari sono stati capra anti-IL-17 (R & D Systems, UK), il mouse anti-CD66b (BD Pharmingen, Stati Uniti d'America), topo anti-CD68 (Abcam, Stati Uniti d'America), topo anti-FoxP3 (Abcam, USA), e topo anti-CD34 (Pechino Zhongshan Golden Bridge Biotech, Cina). Per il controllo negativo, l'anticorpo primario è stato sostituito con PBS (PBS).

immunofluorescenza

Per immunofluorescenza, metodi simili sono stati utilizzati, salvo che l'attività della perossidasi endogena non era bloccato e la primario Ab utilizzato era un cocktail di anticorpi. Capra anti-IL-17 e di capra anti-IL-17R (sia dal R & D Sistemi, USA) sono stati utilizzati per IL-17 + cellule ^{rilevate e l'espressione di IL-17R. Un pannello di anticorpi reattivi con CD3, CD20, CD34, CD56, c-kit (monoclonale del mouse, il tutto da Pechino Zhongshan Golden Bridge Biotech, Cina), CD4 (monoclonale di topo, Leica, tedesco), CD66 (monoclonale di topo, BD Pharmingen, stati Uniti d'America), CD68, FoxP3 e triptasi mastocitaria (MCT) (monoclonale del mouse, il tutto da Abcam, USA) sono stati utilizzati. Dopo incubazione overnight a 4 ° C, le sezioni sono stati sottoposti a incubazione con una miscela di anticorpi secondari: Alexa Fluor 488/568-coniugato asino anti-topo o Cy3 /Alexa Fluor 488 coniugato asino anti-capra o Alexa Fluor 488 asino anti-coniglio ( il tutto da Invitrogen, USA) a 37 ° C per 1 h. I vetrini sono stati montati con Vectashield contenente DAPI (Vector Laboratories, USA) e visualizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza (Olympus BX51, Giappone) accoppiato ad una telecamera CCD (Nikon DS-Ri1). Le immagini sono state analizzate utilizzando il software NIS-Elements BR 3.2.}

controlli negativi, in cui PBS è stato usato al posto degli anticorpi primari, sono stati inclusi per ogni indicatore.

La quantificazione dei parametri immunostaining

I dati sono stati ottenuti mediante il conteggio manuale delle cellule positivamente colorate in 10 settori rappresentativi delle regioni normali e intratumorale sotto 400 × ingrandimenti ad alta potenza. In particolare, le cellule endoteliali vascolari o gruppi di cellule brune macchiati sono stati identificati come microvasi solo se avevano confini chiari con le strutture adiacenti [21]. Densità stati determinati calcolando il numero medio di cellule colorate positivamente per campo microscopico alta potenza (HPF). Doppia colorazione è stata determinata mediante conteggio manuale delle cellule positive in 10 campi ad alta potenza; Sono state calcolate le proporzioni di IL-17-esprimenti cellule per marcatore di superficie. Tutte le analisi sono state effettuate da due osservatori indipendenti, in cieco (GE Z e XK L), e la conta media dei due osservatori sono stati utilizzati nel seguente analisi.

L'analisi statistica

I valori mediani di CD34 ^{+, CD66b +, CD68 +, FoxP3 +, e triptasi mastocitaria (MCT +) e IL-17 cellule + sono stati utilizzati come cut off per definire i sottogruppi nei nostri risultati. t-test di Student sono stati usati per confrontare infiltrazione di diversi sottoinsiemi di cellule immunitarie nel tessuto tumorale e tessuto normale corrispondente. test chi-quadro è stato utilizzato per valutare la relazione tra IL-17-cellule produttrici e le caratteristiche clinico-patologici. Le correlazioni tra densità dei microvasi (CD34), neutrofili (CD66b), macrofagi (CD68), cellule T regolatorie (FOXP3), e le cellule IL-17-produzione sono stati valutati utilizzando il coefficiente di correlazione di Pearson o Spearman di. La sopravvivenza globale è stata definita come l'intervallo tra la data di chirurgia e la data di morte o all'ultimo follow-up, a seconda di quale si è verificato in precedenza. stime funzione di sopravvivenza sono state calcolate utilizzando il metodo di Kaplan-Meier. Un rischio proporzionale di Cox modello è stato utilizzato per valutare l'effetto di IL-17-cellule che producono sulla sopravvivenza globale. A due lati valore p < 0,05 è stato considerato per indicare la significatività statistica. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism (versione 5.00 per Windows;. GraphPad Software, San Diego, CA, USA) e SPSS. (Versione 16.0;. SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software}

Risultati

Studio popolazione

Le caratteristiche dei pazienti sono riportate nella Tabella 1. in totale, 78 maschi e 34 femmine sono stati arruolati. L'età della popolazione in studio variava da 33 a 89 (60) anni mediana. Dei 112 pazienti affetti da cancro gastrico, H. pylori stato di infezione è stato positivo per 65 pazienti, mentre il 47 è stato negativo. 110 pazienti hanno ricevuto R0 resezione e 2 pazienti hanno ricevuto R1 resezione. Patologiche classificazioni TNM sono stati sulla base del 7 ^{edizione del Joint del comitato sul cancro: 33 pazienti avevano metastasi linfonodali, mentre 21 sono stati N1, N2 erano 22, e 36 erano N3. 1 paziente apparteneva a Tis, 23 pazienti appartenevano alla fase I, e 25, 63 pazienti II, III, rispettivamente a tappe. 3 (2.7%) pazienti persi al follow-up e 39 (34,8%) pazienti sono deceduti durante il periodo di osservazione. Il follow-up mediano è stato di tempo di 51 mesi, che vanno da 39 a 57 mesi e il tasso di sopravvivenza globale (OS) sono stati 83,0% a 1 anno, il 71,4% a 3 anni e il 65,7% a 4 anni, rispettivamente.}

iL-17 è stata espressa prevalentemente da MCT + mastociti

campioni casuali di 20 pazienti provenienti da tutta la coorte sono stati usati per valutare la distribuzione e il fenotipo delle cellule-17 che producono iL nella regione intratumorale e il corrispondente tessuti normali (fig.1). Abbiamo trovato citoplasmatica IL-17 colorazione nelle cellule con fenotipo ovoidale, come precedentemente descritto [13], in cellule di forma più irregolare. Inoltre, abbiamo scoperto che le cellule IL-17 che esprimono erano più frequenti nei tessuti intratumorale di tessuti normali. Per identificare le cellule IL-17 ^{+ nei tessuti intratumorale, abbiamo effettuato esperimenti di colocalizzazione e calcolata la percentuale di IL-17 cellule + in ogni sottogruppo. In primo luogo, abbiamo effettuato colocalizzazione di c-kit, un indicatore di mastociti aggiuntivo, con triptasi mastocitaria (MCT), i risultati hanno mostrato che tutti MCT + cellule che esprimono c-kit (Fig. S1), indicando che MCT potrebbe essere utilizzato per mastociti identificati rappresentativo. Nelle cellule del fenotipo ovoidale, abbiamo selezionato un certo numero di cellule T, cellule B, e marcatori di cellule NK: in particolare, CD3, CD4, CD20, CD56 e, e valutato la loro colocalizzazione con IL-17. Tuttavia, sono stati identificati CD20 + IL-17 + e CD56 + IL-17 + cellule, anche se raramente (< 1%; Fig.2, pannelli alto a destra). Anche se occasionale CD3 + IL-17 + e CD4 + IL-17 + cellule sono stati osservati, le percentuali medie di-17 IL cellule + in entrambi i sottogruppi sono state 12,4% ( 2,2-34,1%) e 8,4% (0-26,7%; Fig.2, pannelli in alto a sinistra; Tabella 2) Abbiamo poi studiato il fenotipo di iL-17 + cellule di forma irregolare; macrofagi sono stati proposti come potenziali fonti di produzione di IL-17 [22]. Coerentemente con questo, fino al 18,5% delle cellule IL-17-producono nei tessuti di cancro gastrico erano macrofagi (Fig.2, pannello in basso a sinistra; tabella 2). Tuttavia, la maggior parte di IL-17-cellule produttrici rimasto non identificato. Per determinare se mastociti sono stati una fonte aggiuntiva di IL-17 nel carcinoma gastrico, abbiamo effettuato colocalizzazione di IL-17 e triptasi mastocitaria (MCT). Abbiamo trovato che la maggior parte di IL-17 + cellule colocalizzava con MCT + cellule. (40-60% del-17 IL cellule +; Fig.2, pannello in basso a destra; Tabella 2)}

distribuzione di MCT ^{+ IL-17 + e correlazione con le caratteristiche clinico-patologici}

Per confermare che mast-cellule derivate da IL-17 è stata una delle principali fonti cellulare di IL- 17 nel microambiente cancro gastrico, abbiamo effettuato immunofluorescenza doppia colorazione dei tessuti intratumorale e campioni normali dai 112 pazienti. La maggioranza di IL-17 ^{+ cellule doppio macchiato fortemente con MCT (14-68,1% di IL-17 cellule che esprimono) nei tessuti intratumorale (Fig. 3A). Abbiamo scoperto che la densità di MCT + mastociti e + cellule IL-17 nei tessuti intratumorale sono stati trovati ad essere significativamente più alto rispetto ai tessuti normali (MCT + _{T vs. MCT + N, 10,02 ± 4,06 vs 8,66 ± 3,29, p = 0,0023; IL-17 + T contro IL-17 + N, 8.16 ± 3.89 vs. 7,18 ± 3,48, p = 0,0165; Fig. 3B). Inoltre, la densità di MCT + IL-17 + cellule in tessuti intratumorale era significativamente più alta di quella nei tessuti normali (4,55 ± 2,48 vs 3,93 ± 2,24, p = 0,0154; Fig. 3B).}}

Per identificare le associazioni significative tra le caratteristiche clinico-patologiche e MCT ^{+ iL-17 + cellule, il test chi-quadro o il test esatto di Fisher è stato utilizzato (indicati nella tabella 1). Tuttavia, MCT + IL-17 + cellule nei tessuti intratumorale non correlano con qualsiasi caratteristica clinica valutata, tra cui H. pylori stato di infezione, le dimensioni del tumore, grado di differenziazione e classificazione di TNM.}

Aumento intratumorale MCT ^{+ cellulare, IL-17 + cellulare, e MCT + IL-17 + densità di cellulari sono stati correlati con scarsa sopravvivenza globale}

All'analisi univariata (Tabella 3), il clinico-convenzionale presenta predittivo di scarsa sopravvivenza globale (OS) sono stati i tumori scarsamente differenziati, e lo stadio TNM avanzata. Per ulteriori analisi, numeri di MCT ^{+ cellule, IL-17 + cellule, e MCT + IL-17 + cellule sono state divise in due gruppi: al di sopra e al di sotto dei valori medi. curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier è stato redatto utilizzando il log-rank test per indagare ulteriormente l'associazione con sistema operativo. I pazienti con un numero elevato di intratumorale infiltranti MCT + cellule e-17 Il cellule + avevano un sistema operativo più poveri rispetto a quelli con numeri più bassi di MCT + cellule (p = 0,004) e di IL-17 cellule + (p = 0,014, Fig. 4B). Inoltre, i pazienti con i numeri più alti di MCT + IL-17 + cellule avevano la durata di sopravvivenza più breve rispetto a quelli con numeri più bassi di MCT + IL-17 + cellule (p = 0.018, fig. . 4C)}

Le variabili di P < 0.1 in analisi univariata sono stati inclusi in un multivariata analisi di Cox, abbiamo scoperto che sia le cellule intratumorale MCT-positivi (HR = 2.057; 95% cI: 1.048-4.037; p = 0,036) e lo stadio TNM (HR = 3,832; IC 95%: 1,679-8,745; p = 0.001) erano fattori prognostici indipendenti (Tabella 3). Indicando che i pazienti con più alto numero di cellule MCT-positivo intratumorale erano quasi 2,1 volte più probabilità di morire rispetto a quelli con numeri più bassi di queste cellule.

caratteristiche immunoistochimica e l'associazione tra MCT + IL-17 + densità cellulare e variabili immunochimiche

IL-17 è un noto fattore pro-infiammatoria, che potrebbe favorire la crescita del tumore, stimolando l'angiogenesi e di reclutamento neutrofili, così come l'assunzione di altri tipi di cellule infiammatorie e immunitarie. Per esplorare il potenziale meccanismo (s) di accumulo di IL-17 nel microambiente tumorale con prognosi infausta. Abbiamo eseguito immunoistochimica di vari mediatori infiammatori, in particolare, la densità dei microvasi, neutrofili, macrofagi e linfociti T regolatori di tutta la popolazione in studio ( n
= 112). campi rappresentativi di CD34 ^{+ microvasi, CD66b + neutrofili, CD68 + macrofagi, e FoxP3 + linfociti T regolatorie in intratumorale e tessuto normale sono mostrati in figura. 5A. Le densità di intratumorale CD34 + microvasi (p = 0,0030), CD66b + neutrofili (p < 0,0001), CD68 + macrofagi (p < 0,0001) e FoxP3 + normativi linfociti T (p < 0.0001) erano significativamente più alti rispetto a quelli nei tessuti normali (Fig 5B)}

in seguito, abbiamo analizzato la correlazione tra MVD intratumorale, la densità dei neutrofili, la densità dei macrofagi, la densità delle cellule T regolatorie, e la densità di IL-.. 17 + cellule ^{, in particolare MCT + IL-17 cellule +. I risultati hanno mostrato una correlazione significativa tra MVD e IL-17 + cellule (r = 0,4040, p = 0,0001), mentre significativo, ma debole, le correlazioni sono state trovate tra IL-17 + cellule e neutrofili (r = 0,2135, p = 0,0238) e Tregs (r = 0,2963, p = 0,0017) (dati non mostrati). Tuttavia, abbiamo analizzato ulteriormente la correlazione tra MCT + IL-17 + cellule e quei mediatori infiammatori. Una correlazione significativa più forte è stata trovata tra MCT + IL-17 cellule + e MVD (r = 0,4396, p < 0,0001). Tuttavia, le correlazioni tra MCT + IL-17 + cellule e neutrofili (r = 0,2578, p = 0,0061) e Tregs (r = 0,2898, p = 0,0021) erano simili a quella di IL-17 + (mostrato in Fig.6).}

Colocalizzazione tra iL-17R e varie cellule infiammatorie e immunitarie

al fine di esplorare il meccanismo (s) sotto la stretta relazione tra IL- 17 producono cellule e MVD, così come altre cellule infiammatorie e immunitarie. Abbiamo condotto esperimenti colocalizzazione per valutare l'espressione di IL-17R in vascolari endoteliali cellule, neutrofili, macrofagi e linfociti T regolatori (casuale selezionato, n = 20). I nostri risultati hanno dimostrato che la maggior parte delle cellule endoteliali vascolari esprimono IL-17R (6-58% di cellule endoteliali vascolari; Fig.7) nei tessuti intratumorale. Coerentemente con la nostra ipotesi, appena sono stati rilevati neutrofili e linfociti T regolatori che esprimono IL-17R. È interessante notare, abbiamo trovato espressione di IL-17R nella superficie delle cellule tumorali. (Fig. S2).

Discussione

fuga immunitario svolge un ruolo chiave nella genesi e lo sviluppo del cancro. I mediatori ed effettori cellulari del sistema immunitario sono componenti importanti di un ambiente tumorale immunosoppressivo. Il ruolo di interleuchina-17, come fattore pro-infiammatoria, ha attirato l'attenzione di recente in tumori, malattie autoimmuni e malattie da immunodeficienza. CD4 ^{+ cellule Th17 sono stati a lungo pensato di essere l'unica fonte cellulare di IL-17 nel microambiente tumorale umano [23]. Tuttavia, una crescente evidenza ha dimostrato che vari tipi di cellule possono produrre IL-17 [3], [24]. I mastociti, un importante componente cellulare del sistema immunitario innato, sono stati riconosciuti come un'importante fonte cellulare di IL-17. Infatti, possono produrre e /o secernere una varietà di citochine e chemochine che contribuiscono alla difesa immunitaria e infiammazione, compreso il reclutamento dei leucociti e la proliferazione cellulare vascolare. Recentemente, è stato dimostrato che i mastociti infiltrano nel microambiente tumorale attraverso il percorso di segnalazione SCF /c-kit, con conseguente esacerbazione di infiammazione e immunosoppressione [25]. Mast derivato dalle cellule IL-17 è stata studiata in diverse malattie autoimmuni, tra cui l'artrite reumatoide [13], la psoriasi [26], e spondilartrite [27], in cui mastociti sono una delle principali fonti cellulari di IL-17, e ha mostrato una forte correlazione con la progressione della patogenesi e la malattia. Tuttavia, la fonte del maggiore IL-17 livello tumore infiltrante e il contributo alla progressione del tumore, così come il meccanismo di base (s), rimanevano poco conosciuti.}

Nel presente studio, abbiamo osservato che le cellule IL-17 che esprimono in campioni di cancro gastrico umano esposte due fenotipi. Alcuni avevano un fenotipo relativamente regolare, forme ovoidali /plasmacitoidi, ma alcuni avevano le forme più irregolari. Inoltre, abbiamo trovato che IL-17 ^{+ linfociti compresi solo ~ 10% delle cellule IL-17-esprimono, in contrasto con gli studi precedenti in microambienti tumorali umane [7], [23]. Recentemente, Bo Wang et al. [28] hanno riscontrato che i mastociti, ma non cellule T o macrofagi, sono stati il ​​tipo predominante che esprime IL-17 nei tessuti di carcinoma delle cellule squamose dell'esofago. È interessante notare, abbiamo anche scoperto che la maggior parte dei 17-IL cellule + colocalized con MCT + cellule (14-68,1% del-17 IL cellule +), indicando che i mastociti sono stati la fonte cellulare predominante di IL-17 nei tumori gastrici umani. Diversi studi hanno dimostrato che IL-17 ostacola sorveglianza immunitaria e promuove l'angiogenesi e carcinogenesi nei tumori [1], [29], suggerendo che l'ambiente infiammazione guidato da livelli endogeni IL-17 può contribuire alla progressione tumorale. I nostri risultati suggeriscono che il livello di IL-17-cellule che esprimono era maggiore nei campioni di tessuto tumorale rispetto ai corrispondenti campioni di tessuto normale e che mastociti derivato IL-17 era più abbondante nei tumori gastrici umani. L'analisi di Kaplan-Meier ha rivelato che 17 IL-+ cellule intratumorale e MCT intratumorale + IL-17 + cellule sono stati correlati con una sopravvivenza peggiore in pazienti affetti da cancro gastrico umano.}

Il meccanismo preciso (s) sottostante l'associazione tra livelli crescenti di iL-17 nella progressione tumorale microambiente tumorale e rimanere (s) chiaro. Uno studio ha riportato che l'IL-17 promuovere lo sviluppo del tumore attraverso il reclutamento di cellule derivate mieloidi soppressore (MDSCs), come CD11b ^{+ Gr1 + cellule, per l'ambiente tumorale [30]. Nel frattempo, diversi studi hanno dimostrato che l'IL-17 può migliorare la crescita delle cellule endoteliali vascolari e influenzare il progresso angiogenica aumentando la secrezione di citochine, quali TNF-α, IL-8 e VEGF [29], [31], tra cui uno studio che ha riportato rete paracrino IL-17-mediata promuove la resistenza del tumore alla terapia anti-angiogenica [32]. Coerentemente con questo, i nostri risultati hanno indicato una correlazione significativa tra MVD e IL-17 + cellule. E 'stato ben stabilito che i mastociti potrebbero stimolare la proliferazione vascolare [33], nel nostro studio, abbiamo trovato una correlazione più significativa tra MVD e MCT + IL-17 + cellule, dimostrando che queste IL-17 la produzione mastociti hanno forte effetto sulla promozione dell'angiogenesi. Inoltre, abbiamo trovato che la maggior parte delle cellule endoteliali vascolari che esprimono IL-17R, cosa ancor più interessante, abbiamo scoperto che le cellule di cancro gastrico sono stati positivi per IL-17R. Studi precedenti hanno riportato che l'espressione di IL-17R è stato associato con malignità del tumore [34], [35]. Combinando questi risultati, IL-17 infiltrazione può essere promosso progressione tumorale aumentando l'angiogenesi nel microambiente tumorale attraverso l'asse di IL-17 /IL-17R, funzione sulle cellule endoteliali vascolari e cellule tumorali. Un altro possibile meccanismo consiste nel reclutamento di cellule infiammatorie di IL-17, come i neutrofili e macrofagi. E 'stato dimostrato che l'IL-17 promuove la progressione del tumore attraverso effetti diretti sul reclutamento dei neutrofili [36], [37]. Nel nostro studio, intratumorale IL-17 + cellule e MCT + IL-17 + cellule entrambi hanno mostrato correlazioni deboli, ma significativi, con il numero di neutrofili intratumorale, mentre i macrofagi intratumorale hanno mostrato alcun significato. Anche se, a mala pena i neutrofili sono stati trovati esprimono IL-17R. Mast-derivato IL-17 potrebbe svolgere un ruolo chiave nel reclutamento di neutrofili da chemochine CXC, come CCL2, come descritto in precedenza [38]. Prove da vari tipi di cancro dimostra che la percentuale di cellule T regolatorie (Tregs) è aumentato nel tessuto tumorale nei pazienti con più tumori maligni [39], [40]. E 'stato riportato che Tregs reclutamento ha avuto un ruolo chiave nella creazione di un microambiente tumorale ricco di VEGF e aumentando l'angiogenesi tumorale [41]. precedente studio ha riportato il ruolo regolatore dei mastociti in cui essi interagiscono con CD4 convenzionale + cellule T per generare la produzione di IL-10 cellule T regolatorie attraverso l'asse di ICOSL /ICOS [42]. Ganeshan et al. [43] hanno riportato che Tregs realmente migliorare, piuttosto che inibire, la produzione dei mastociti di IL-6, una citochina pleiotropica, che ha dimostrato di giocare un ruolo chiave nella regolazione dell'equilibrio tra le cellule di IL-17-produttrici e FoxP3 + cellule T regolatorie. Così, possono esistere correlazioni intensi tra Tregs e mastociti IL-17-produttori. Nel nostro studio, la correlazione tra IL-17 + cellule e Tregs era debole, ma significativo, così come la MCT + IL-17 cellule +. Questi risultati hanno dimostrato che la produzione di IL-17 mastociti potrebbero indurre la differenziazione e l'accumulo di Tregs secernendo diversi di citochine e chemochine, che devono essere ulteriormente chiariti.}

A nostra conoscenza, questo è il primo rapporto della fenotipo e distribuzione di intratumorale iL-17-cellule che producono e la loro rilevanza clinica, e in particolare il valore prognostico di intratumorale mast cell-derived iL-17 nel cancro gastrico. I nostri dati dimostrano che la maggior parte-17 che producono IL cellule erano mastociti, mentre IL-17 ^{+ linfociti erano rari. Inoltre, abbiamo scoperto che IL-17 cellule intratumorale + e MCT intratumorale + IL-17 + cellule sono stati correlati con una sopravvivenza peggiore. Tuttavia, il meccanismo (s) di infiltrazione mastocitaria nel microambiente tumorale e il meccanismo specifico tra la sovraespressione di IL-17 e le cellule infiammatorie e immunitarie sono generalmente poco noti. Inoltre, la funzione distintiva di memorizzati e secretoria IL-17 ancora bisogno di essere illustrato. Così, sono necessari per valutare il valore predittivo di intratumorale mast-cellule derivate ulteriormente.}

informazioni di supporto
Figura IL-17 studi prospettici incentrati sul reclutamento dei mastociti e IL-17 nel microambiente tumorale stomaco S1.
Colocalizzazione tra c-kit e triptasi mastocitaria (MCT)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0106834.s001
(TIF)
Figura S2.
Colocalizzazione tra IL-17R (verde) e neutrofili, macrofagi, cellule T regolatorie (arancione)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0106834.s002
(TIF)

Riconoscimenti

ringraziamo Lin Zhou, Haiyang Xie e Xiaowen Feng nel laboratorio chiave di combinata multi-trapianto di organi, Ministero della Salute pubblica, primo Ospedale Affiliato, Facoltà di Medicina, Università di Zhejiang per il supporto tecnico in immunoistochimica e immunofluorescenza.

• PLoS ONE: l'effetto inibitorio di pseudolaric Acid B sul cancro gastrico e la resistenza ai farmaci tramite Cox-2 /PKC-α /P-gp Pathway
• PLoS ONE: miR-30b, Down-regolamentata in cancro gastrico, promuove apoptosi e sopprime la crescita tumorale di mira plasminogeno-1