PLoS ONE: intratumor IL-17-positieve mestcellen zijn de voornaamste bron van de IL-17 die voorspellend is voor overleving bij maagkanker Patients

Abstract

Interleukine-17 (IL-17) is dominant in tumorweefsel onderdrukt en effectieve anti-tumor immuunrespons. Echter blijven de bron van de verhoogde tumor infiltrerende IL-17 en zijn bijdrage tot tumorprogressie in menselijke maagkanker slecht begrepen. In deze studie hebben we ingeschreven 112 maagkankerpatiënten, immunofluorescentie werd gebruikt om de colocalization van CD3, CD4, CD56, CD20, CD68 evalueren en mestceltryptase (MCT) met IL-17. Immunohistochemie werd gebruikt om de verdeling van microvaatjes dichtheid (CD34), CD66b ^{+, CD68 + evalueren en FoxP3 + cellen in verschillende microanatomical gebieden. Prognostische waarde werd bepaald door Kaplan-Meier-analyse en een Cox regressie model. De resultaten toonden aan dat mestcellen, maar niet T-cellen of macrofagen, waren de overheersende celtype produceren van IL-17 bij maagkanker. Significante positieve correlaties werden gedetecteerd tussen dichtheden van mestcel-afgeleid IL-17 en microvaten, neutrofielen, en regulatoire T-cellen (Tregs). Bovendien zijn vonden we dat de meeste vasculaire endotheliale cellen die interleukine-17 receptor (IL-17R). Kaplan-Meier analyse bleek dat verhoging intratumorale geïnfiltreerd mestcellen en IL-17 + cellen alsmede MCT + IL-17 + cellen waren significant geassocieerd met slechtere overleving. Deze bevindingen gaven aan dat mestcellen waren de belangrijkste bron van IL-17 bij maagkanker en intratumorale IL-17 kan infiltratie tumorprogressie bevorderd door het versterken van angiogenese in de tumor micro-omgeving door de hartlijn van IL-17 /IL-17R. IL-17-positieve mastcellen vertoonden een prognostische factor bij maagkanker, wat aangeeft dat immunotherapie gericht mestcellen een effectieve aanpak ter beheersing intratumorale IL-17 infiltratie kan zijn en derhalve omgekeerd immunosuppressie in de tumor micro-omgeving vergemakkelijkt kanker immunotherapie.}

Citation: Liu X, Jin H, Zhang G, Lin X, Chen C, Zon J, et al. (2014) intratumor IL-17-positieve mestcellen zijn de voornaamste bron van de IL-17 die voorspellend is voor overleving bij maagkankerpatiënten. PLoS ONE 9 (9): e106834. doi: 10.1371 /journal.pone.0106834

Editor: Xin-Yuan Guan, de Universiteit van Hong Kong, China

Ontvangen: 12 mei 2014; Aanvaard: 1 augustus 2014; Gepubliceerd: 8 september 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. De auteurs bevestigen dat alle gegevens waarop de bevindingen zijn volledig beschikbaar zonder beperking. Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. XSL werd gesteund door de toekenning van de National Science Foundation of China (81273254 /H1006), http://www.nsfc.gov. cn /. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

in de afgelopen decennia is steeds meer aandacht besteed aan het mechanisme (s) te ontsnappen immunosurveillance in de tumor micro-omgeving en in het bijzonder de relatie tussen ontsteking en immunosuppressie. Een van de belangrijkste componenten van het immuunsysteem bij ontsteking geassocieerd met kanker is onlangs erkend interleukine-17 (IL-17). IL-17 heeft pleiotrope functies en meerdere doelen die meestal zijn bestudeerd in muizenmodellen, maar steeds gekoppeld aan menselijke ziekten [1] - [5]. IL-17 geïdentificeerd in diverse tumoren, waaronder borstkanker [6], maagkanker [7], [8], colorectale kanker [9], carcinogeen-geïnduceerde huidkanker [10], intrahepatische cholangiocarcinoom [11] en hepatocellulaire carcinoma [12]. IL-17-producerende cellen geleidelijk het aantal in de tumor micro-omgeving tijdens tumorontwikkeling en worden gecorreleerd met slechte overleving in kankergerelateerde patiënten.

Het is lang beschouwd als de belangrijkste cellulaire bron van IL-17 is CD4 ^{+ T-lymfocyten (Th17 cellen). Onlangs zijn veel studies gericht op IL-17 hebben aangetoond dat IL-17 productie niet beperkt is tot Th17 lymfocyten, maar ook in diverse adaptieve en aangeboren immuuncellen, waaronder γδT cellen, NKT-cellen, NK-cellen, mestcellen en granulocyten [3], [13].}

Maagkanker is een van de meest voorkomende soorten kanker en een belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [14]. Meer dan 1 miljoen nieuwe patiënten de diagnose maagkanker elk jaar wereldwijd, 42,5% van hen zijn in China. Traditionele therapeutische strategieën, met inbegrip van chirurgie, chemotherapie en radiotherapie zijn de belangrijkste behandelingen voor maagkanker. Recentelijk immunotherapie van maligniteiten is in beeld [15] gebracht - [17]. Echter, tumor geassocieerde immuunsuppressie is een grote uitdaging voor immunotherapie, omdat de cytotoxische activiteit van effectieve T-cellen en natuurlijke killer cellen verzwakt. Gedurende tumorontwikkeling, wordt tumor immunosuppressie vaak geassocieerd met excessieve en ongecontroleerde ontsteking in de tumor micro [18]. Het is bekend dat meerdere infiltreren ontstekingscellen tumoren, zoals mestcellen, macrofagen subtypes, neutrofielen, en T en B lymfocyten, een kenmerk van kanker-geassocieerde ontsteking [19].

In de huidige studie onderzochten we de cellulaire bron van IL-17, distributie, functionele betekenis en voorspellende waarde van IL-17-producerende cellen in 112 patiënten met maagkanker. Wij geven nieuwe inzichten in de mogelijke mechanisme (s) van IL-17 in de tumor micro-omgeving bij patiënten met maagkanker door het evalueren van de verhouding tussen IL-17-producerende cellen en ontstekingsmediatoren. Ons doel is om meer informatie die nuttig kan zijn voor het ontwerpen van efficiëntere kanker immuuntherapie dat IL-17 doelwit.

Materialen en methoden

Ethics statement

Voorafgaand aan het onderzoek , geïnformeerde toestemming werd verkregen van elke patiënt. Passende toestemming werd verleend door de ethische commissie van de Eerste Affiliated Hospital, Medical College, Zhejiang University.

Patiënt monsters

In totaal 112 patiënten die tussen februari 2009 en maart 2010 in ons ziekenhuis werden geïncludeerd . Patiënten die voldeden aan de volgende criteria geselecteerd: a) diagnose maagkanker gebaseerd op pathologie; b) ontvangen effectieve resectie. De uitsluitingscriteria waren patiënten die tekenen van metastasen op afstand, het bewijs van gelijktijdige auto-immuunziekte, HIV of syfilis en patiënten die anti-kanker therapie ontvangen voor de operatie gehad. De criteria van effectieve resectie werden gedefinieerd als resectie zonder residuele tumor (R0) of microscopische residuele tumor (R1) volgens de 7 ^{e editie van het American Joint Committee on Cancer van. Na curatieve resectie, kregen de patiënten adjuvante chemotherapie gebaseerd op 5-flurouracil en platina volgens de pathologische TNM classificatie. Patiënten werden gevolgd-up met 3-6 maanden interval, met inbegrip van analyses van hun perifere bloed voor tumormarkers en echografie en verbeterde CT elke 6 maanden, endoscoop om de 12 maanden. Klinische kenmerken van de patiënten worden weergegeven in tabel 1.}

immunohistochemie en immunofluorescentie

Routine hematoxyline en eosine kleuring werd uitgevoerd om de pathologische diagnose te bevestigen, intratumorale gebied werd gedefinieerd als minder dan 2 cm grenzend aan de marge van de maag tumor, terwijl normale gebied werd gedefinieerd als ten minste 5 cm grenzend aan de rand van de maag tumor.

Immunohistochemie

Immunohistochemie werd uitgevoerd zoals beschreven in onze vorige studie [20]. Primaire antilichamen werden geit anti-IL-17 (R &D Systems, UK), muis anti-CD66b (BD Pharmingen, USA), muis anti-CD68 (Abcam, USA), muis anti-Foxp3 (Abcam, USA), en muizen anti-CD34 (Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotech, China). Voor de negatieve controle werd het primaire antilichaam vervangen door fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).

Immunofluorescentie

Voor immunofluorescentie dergelijke wijze gebruikt, behalve dat endogene peroxidase activiteit werd geblokkeerd en niet primaire Ab gebruikt was een antilichaam cocktail. Geit anti-IL-17 en geit anti-IL-17R (beide van R &D Systems, USA) werden gebruikt om gedetecteerd IL-17 ^{+ cellen en IL-17R-expressie. Een panel van antilichamen die reactief zijn met CD3, CD20, CD34, CD56, c-kit (muis monoklonale, allen van Peking Zhongshan Golden Bridge Biotech, China), CD4 (muis monoklonale, Leica, Duits), CD66 (muis monoklonale, BD Pharmingen, USA), CD68, Foxp3 en mestceltryptase (MCT) (muizenmonoklonaal, allen van Abcam, USA) werden gebruikt. Na incubatie overnacht bij 4 ° C, secties onderging incubatie met een mengsel van secundaire antilichamen: Alexa Fluor 488/568-geconjugeerd ezel-anti-muis of Cy3 /Alexa Fluor 488-geconjugeerd ezel anti-geit of Alexa Fluor 488 ezel anti-konijn ( alle van Invitrogen, USA) bij 37 ° C gedurende 1 uur. Glaasjes werden gemonteerd met Vectashield met DAPI (Vector Laboratories, USA) en gevisualiseerd met behulp van een fluorescentie imaging microscoop (Olympus BX51, Japan) gekoppeld aan een CCD camera (Nikon DS-Ri1). De beelden werden geanalyseerd met de NIS-elementen BR 3,2 software.}

Negatieve controles waarin PBS werd gebruikt in plaats van de primaire antilichamen, werden voor elke markering.

kwantificeren immunokleuring parameters

De gegevens werden verkregen door het handmatig tellen van positief gekleurde cellen in 10 representatieve gebieden van normale en intratumoral regio's die onder 400 × high-power vergroting. Specifiek, vasculaire endotheliale cellen of clusters van bruin-gekleurde cellen werden geïdentificeerd als microvaatjes indien ze duidelijke grenzen met aangrenzende structuren [21]. Dichtheden werden bepaald door het berekenen van het gemiddelde aantal positief gekleurde cellen per high power microscopische veld (HPF). Dubbele kleuring werd bepaald door het handmatig tellen van positieve cellen in 10 high-power velden; de verhoudingen van IL-17 tot expressie brengende cellen per oppervlaktemarker berekend. Alle analyses werden uitgevoerd door twee onafhankelijke geblindeerde waarnemers (GE Z en XK L), en de gemiddelde tellingen van de twee waarnemers werden gebruikt in de volgende analyse.

Statistische analyse

De mediaanwaarden van CD34 ^{+, CD66b +, CD68 +, FoxP3 + en mestceltryptase (MCT +) en IL-17 + cellen werden gebruikt als cut offs de subgroepen definiëren onze resultaten. t-test van Student werd gebruikt om infiltratie van diverse immuuncelsubklassen vergelijken in tumorweefsel en overeenkomstige normale weefsel. Chi-kwadraat test werd gebruikt om het verband tussen IL-17-producerende cellen en klinische en pathologische kenmerken beoordelen. Correlaties tussen microvaatjes dichtheid (CD34), neutrofielen (CD66b), macrofagen (CD68), regulatoire T-cellen (FoxP3), en IL-17 producerende cellen werden beoordeeld met behulp van Pearson of Spearman correlatiecoëfficiënt. Algehele overleving werd gedefinieerd als het interval tussen de datum van de operatie en de datum van overlijden of laatste follow-up, afhankelijk van wat eerder voorgedaan. Overlevingsfunctie schattingen zijn berekend met de Kaplan-Meier-methode. Een Cox proportional hazards model werd gebruikt om het effect van IL-17-producerende cellen op overleving te beoordelen. Een tweezijdige p-waarde < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant te geven. Alle statistische analyses werden uitgevoerd onder toepassing van GraphPad Prism (versie 5.00 voor Windows,. GraphPad Software, San Diego, CA, USA) en SPSS. (Versie 16,0;. SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software}

Resultaten

Studiepopulatie

kenmerken van patiënten worden weergegeven in tabel 1. in totaal 78 mannen en 34 vrouwen werden geïncludeerd. De leeftijd van de studiepopulatie varieerde 33-89 (gemiddelde 60) jaar. Van de 112 patiënten met maagkanker, H. pylori-infectie de status was positief voor 65 patiënten, terwijl 47 was negatief. 110 patiënten kregen R0 resectie en 2 patiënten kregen R1 resectie. Pathologische TNM classificaties waren gebaseerd op de 7 ^{e editie van de Amerikaanse Joint Committee van on Cancer: 33 patiënten hadden geen lymfeklier metastase, terwijl 21 waren N1, 22 waren N2, en 36 waren N3. 1 patiënt was voor Tis, 23 patiënten was voor stadium I en 25, 63 patiënten met stadia II, III, respectievelijk. 3 (2,7%) van de patiënten lost to follow-up en 39 (34,8%) van de patiënten overleden tijdens de observatieperiode. De mediane follow-up tijd was 51 maanden, variërend 39-57 maanden en de totale overleving (OS) tarieven waren 83,0% na 1 jaar, 71,4% na 3 jaar en 65,7% na 4 jaar, respectievelijk.}

IL-17 is voornamelijk tot expressie MCT + mestcellen

Random monsters van 20 patiënten uit de cohort werden gebruikt om de distributie en fenotype van IL-17-producerende cellen in intratumorale gebied evalueren en de bijbehorende normale weefsels (Fig.1). We hebben cytoplasmatische IL-17 kleuring in cellen met een fenotype eivormig, zoals eerder [13] beschreven en in cellen van een onregelmatige vorm. Bovendien vonden we dat de IL-17 tot expressie brengende cellen waren frequenter in intratumorale weefsels dan normale weefsels. Het IL-17 ^{+ cellen identificeren intratumor weefsels voerden we colocalization experimenten en berekend de hoeveelheid IL-17 + cellen in elke subset. Eerst voerden we colocalization van c-kit, een extra mestcel marker met mestceltryptase (MCT), de resultaten bleek dat alle MCT + cellen die c-kit (Fig. S1) dat aangeeft dat MCT kan zijn gebruikt om geïdentificeerde mestcellen representatief. In cellen van het fenotype eivormige, selecteerden we een aantal T cellen, B cellen en NK cel merkers: specifiek, CD3, CD4, CD20 en CD56, en beoordeelde het colokalisatie met IL-17. Er werden echter CD20 + IL-17 + en CD56 + IL-17 + cellen geïdentificeerd, zij zelden (< 1%; figuur 2, rechts boven panelen). Hoewel af en toe een CD3 + IL-17 + en CD4 + IL-17 + cellen werden waargenomen, de gemiddelde percentages van IL-17 + cellen in beide subsets waren 12,4% ( 2,2-34,1%) en 8,4% (0-26,7%; Fig.2, linksboven panelen; tabel 2) vervolgens onderzochten we het fenotype van IL-17 + cellen met een onregelmatige vorm; macrofagen zijn gesuggereerd als potentiële bron van IL-17 productie [22]. Consistent hiermee tot 18,5% van de IL-17-producerende cellen bij maagkanker weefsels waren macrofagen (Fig.2, linksonder; Tabel 2). De meerderheid van IL-17-cellen bleef geïdentificeerd. Te bepalen of mestcellen waren een extra bron van IL-17 productie in maagkanker, voerden wij colocalization van IL-17 en mestceltryptase (MCT). We vonden dat de meerderheid van IL-17 + cellen colocalized met MCT + cellen. (40-60% van IL-17 + cellen; Fig.2, rechter paneel; Tabel 2)}

Distributie van MCT ^{+ IL-17 + cellen en correlatie met klinisch-pathologische kenmerken}

Om te bevestigen dat de mast-cel-afgeleide IL-17 was een belangrijke cellulaire bron van IL 17 in de maagkanker micro-omgeving, voerden we immunofluorescentie dubbel-kleuring van intratumor en normaal monster weefsels van de 112 patiënten. De meerderheid van IL-17 ^{+ cellen dubbel gekleurd met sterk MCT (14-68,1% van IL-17 tot expressie brengende cellen) in intratumorale weefsels (Fig. 3A). We vonden dat de dichtheden van MCT + mestcellen en IL-17 + cellen in intratumorale weefsels bleken significant hoger dan in normale weefsels (MCT + _{T versus MCT + N, 10,02 ± 4,06 versus 8,66 ± 3,29, p = 0,0023, IL-17 + T versus IL-17 + N, 8,16 ± 3,89 vs. 7,18 ± 3,48, p = 0,0165; fig. 3B). Bovendien is de dichtheid van MCT + IL-17 + cellen in intratumorale weefsels was significant hoger dan in normale weefsels (4,55 ± 2,48 vs 3,93 ± 2,24, p = 0,0154; fig. 3B).}}

Om significante associaties tussen de klinisch-pathologische kenmerken en MCT ^{+ IL-17 + cellen, de chi-kwadraat-test of fisher's exact test werd gebruikt (weergegeven in tabel 1) te identificeren. Echter, MCT + IL-17 + cellen in de intratumor weefsels niet correleren met de klinische kenmerken beoordeeld, met inbegrip van H. pylori-infectie-status, grootte van de tumor, de mate van differentiatie en classificatie van TNM.}

Verhoogde intratumor MCT ^{+ cel, IL-17 + cel en MCT + IL-17 + celdichtheden werden gecorreleerd met een slechte algehele overleving}

aan univariate analyse (Tabel 3), de conventionele clinicopathologische voorzien voorspellend slechte algehele overleving (OS) werden slecht gedifferentieerde tumoren en geavanceerde TNM. Voor verdere analyse werden aantallen MCT ^{+ cellen, IL-17 + cellen en MCT + IL-17 + -cellen verdeeld in twee groepen: boven en onder de mediaan waarden. Kaplan-Meier survival curves werden bereid met behulp van de log-rank test om verder te onderzoeken van de associatie met OS. Patiënten met hoge aantallen intratumor infiltreren MCT + cellen en IL-17 + cellen hadden een slechtere OS dan die met lagere aantallen van MCT + cellen (p = 0,004) en IL-17 + cellen (p = 0,014, Fig. 4B). Bovendien, patiënten met hogere aantallen MCT + IL-17 + cellen hadden een kortere overleving duur dan die met lagere aantallen van MCT + IL-17 + cellen (p = 0,018, Fig. . 4C)}

Variabelen van P < 0,1 in univariate analyses werden opgenomen in een multivariate Cox proportionele risico-analyse, vonden we dat zowel intratumor MCT-positieve cellen (HR = 2,057; 95% BI: 1,048-4,037; p = 0,036) en TNM stadium (HR = 3,832; 95% BI: 1,679-8,745; p = 0,001) waren onafhankelijke prognostische factoren (tabel 3). Aangeeft dat patiënten met hogere aantallen intratumorale MCT-positieve cellen werden bijna 2,1 keer meer kans om te sterven dan die met lagere aantallen van deze cellen.

immunohistochemische kenmerken en het verband tussen MCT + IL-17 + celdichtheid en immunochemische variabelen

IL-17 is een bekende pro-inflammatoire factor, die tumorgroei door bevordering angiogenese en werven neutrofielen, en rekrutering van andere inflammatoire en immuun celsoorten kunnen bevorderen. Om het potentieel mechanisme (s) van IL-17 accumulatie verkennen in de tumor micro-omgeving met een slechte prognose. We voerden immunohistochemie voor diverse ontstekingsmediatoren, in het bijzonder, microvessel dichtheid, neutrofielen, macrofagen, en regulatoire T-cellen in de totale onderzoekspopulatie ( n
= 112). Representatieve gebieden van CD34 ^{+ microvaatjes, CD66b + neutrofielen, CD68 + macrofagen en FoxP3 + regulerende T-lymfocyten in intratumorale en normaal weefsel zijn getoond in Fig. 5A. De dichtheden van intratumor CD34 + microvaten (p = 0,0030), CD66b + neutrofielen (p < 0,0001), CD68 + macrofagen (p < 0,0001) en FoxP3 + regulerende T-lymfocyten (p <0,0001) significant hoger dan in normale weefsels (figuur 5B)}

Vervolgens analyseerden we de correlatie tussen intratumorale MVD neutrofielen dichtheid, macrofagen dichtheid regulatoire T celdichtheid, en de dichtheid van IL.. 17 ^{+ cellen, in het bijzonder MCT + IL-17 + cellen. De resultaten toonden een significante correlatie tussen MVD en IL-17 + cellen (r = 0,4040, p = 0,0001), terwijl significant, maar zwak, werden correlaties tussen IL-17 + cellen en neutrofielen (r = 0,2135, p = 0,0238) en Tregs (r = 0,2963, p = 0,0017) (gegevens niet getoond). Echter, wij verder geanalyseerd de correlatie tussen MCT + IL-17 + cellen en die ontstekingsmediatoren. Een sterkere significante correlatie gevonden tussen MCT + IL-17 + cellen en MVD (r = 0,4396, p < 0,0001). De correlaties tussen MCT + IL-17 + cellen en neutrofielen (r = 0,2578, p = 0,0061) en Tregs (r = 0,2898, p = 0,0021) waren vergelijkbaar met die van IL-17 + cellen (getoond in figuur 6).}

colocalization tussen IL-17R en diverse inflammatoire en immuuncellen

om het mechanisme (s) het nauw verband tussen IL staand 17 producerende cellen en MVD, en andere inflammatoire en immuuncellen. Colocalization voerden we experimenten om de expressie van IL-17R in vasculaire endotheelcellen, neutrofielen, macrofagen en regulatoire T-cellen te evalueren (willekeurig geselecteerd, n = 20). Onze resultaten laten zien dat de meeste vasculaire endotheliale cellen die IL-17R (6-58% van vasculaire endotheelcellen, Fig.7) in intratumor weefsels. In overeenstemming met onze hypothese, nauwelijks neutrofielen en regulatoire T-cellen werden gedetecteerd uitdrukken IL-17R. Interessant, vonden we de expressie van IL-17R in het oppervlak van tumorcellen. (Afb. S2).

Discussie

Immune escape speelt een belangrijke rol in het ontstaan ​​en de ontwikkeling van kanker. Bemiddelaars en cellulaire effectoren van het immuunsysteem zijn belangrijke onderdelen van een immunosuppressief tumoromgeving. De rol van interleukine-17 als een pro-inflammatoire factor is de aandacht recentelijk aangetrokken kanker, autoimmuunziekten en immunodeficiëntie ziekten. CD4 ^{+ Th17 cellen werden lang beschouwd als de enige cellulaire bron van IL-17 in het menselijk tumor micro [23] zijn. Echter, toenemend bewijs aangetoond dat verschillende celtypen kunnen produceren IL-17 [3], [24]. Mestcellen een belangrijke cellulaire component van het aangeboren immuunsysteem, zijn erkend als een belangrijke cellulaire bron van IL-17. Inderdaad, kunnen zij produceren en /of uitscheiden bepaalde cytokines en chemokines die bijdragen aan immuunsysteem en ontsteking, waaronder rekrutering van leukocyten en vasculaire celproliferatie. Recentelijk is aangetoond dat mestcellen infiltreren in de tumor micro-omgeving via de SCF /c-kit signaling pathway, wat leidt tot exacerbatie van ontsteking en immuunsuppressie [25]. Mast cel afkomstige IL-17 werd onderzocht bij verschillende auto-immuunziekten, zoals reumatoïde artritis [13], psoriasis [26] en spondylarthritis [27], waarbij mestcellen een belangrijke cellulaire bron van IL-17, en toonde een sterke correlatie met pathogenese en ziekteprogressie. Echter bleef de bron van de verhoogde tumor infiltrerende IL-17-niveau en de bijdrage aan de progressie van de tumor, en het onderliggende mechanisme (s), slecht begrepen.}

In deze studie hebben we geconstateerd dat IL-17 tot expressie brengende cellen in menselijke maagkanker monsters vertoonden twee fenotypes. Sommigen hadden een relatief normale fenotype, eivormig /plasmacytoide vormen, maar sommigen hadden meer onregelmatige vormen. Bovendien vonden we dat IL-17 ^{+ lymfocyten omvatte slechts -10% van de IL-17 tot expressie brengende cellen, in tegenstelling tot voorgaande studies in humane tumor microenvironments [7], [23]. Onlangs, Bo Wang et al. [28] vonden dat mestcellen, maar niet T-cellen of macrofagen, waren de overheersende expressie van IL-17 in esophageal plaveiselcelcarcinoom weefsels. Interessant, vonden we ook dat de meerderheid van IL-17 + cellen colocalized met MCT + cellen (14-68,1% van IL-17 + cellen), hetgeen aangeeft dat mestcellen waren de voornaamste cellulaire bron van IL-17 in menselijke maagkanker. Verschillende studies hebben aangetoond dat IL-17 schaadt immuunsurveillance en stimuleert angiogenese en carcinogenese in tumoren [1], [29], wat suggereert dat de ontsteking milieu aangedreven door niveaus van endogeen IL-17 kan bijdragen aan tumorprogressie. Onze bevindingen suggereerden dat het niveau van IL-17-cellen tot expressie was hoger in tumorweefselmonsters dan de overeenkomstige normale weefselmonsters en de mast cel-afgeleide IL-17 was overvloedig in menselijke maagkanker. Kaplan-Meier-analyse toonde aan dat intratumorale IL-17 + cellen en intratumoral MCT + IL-17 + cellen werden gecorreleerd met slechtere overleving in de menselijke maag-kankerpatiënten.}

Het precieze mechanisme (s) verantwoordelijk voor de associatie tussen de toenemende niveaus van IL-17 in de tumor micro-omgeving en de progressie van de tumor blijven (s) onduidelijk. Een studie gemeld dat IL-17 tumorontwikkeling promoten door de rekrutering van myeloide suppressor cellen (MDSCs), zoals CD11b ^{+ Gr1 + cellen, de tumoromgeving [30]. Inmiddels hebben verschillende studies aangetoond dat IL-17 de groei van vasculaire endotheelcellen kunnen versterken en beïnvloeden de angiogene voortgang door het verhogen van de uitscheiding van cytokinen, zoals TNF-α, IL-8 en VEGF [29], [31], waaronder een studie die IL-17-gemedieerde paracriene worden gerapporteerd bevordert tumor resistentie tegen anti-angiogene therapie [32]. Consistent hiermee onze resultaten toonden een significante correlatie tussen MVD en IL-17 + cellen. Het is bekend dat mestcellen vasculaire proliferatie kan stimuleren [33] In onze studie vonden we een significante correlatie tussen MVD en MCT + IL-17 + cellen, wat aantoont dat deze IL-17 producerende mestcellen hebben een sterkere invloed op het bevorderen van angiogenese. Bovendien vonden we dat de meeste vasculaire endotheliale cellen die IL-17R, interessanter, we vonden dat maagkanker cellen waren positief voor IL-17R. Eerdere studies hebben gemeld dat IL-17R-expressie geassocieerd met tumor maligniteit [34], [35]. Het combineren van deze resultaten, kan IL-17 infiltratie tumorprogressie bevorderd door het versterken van angiogenese in de tumor micro-omgeving door de hartlijn van IL-17 /IL-17R, functie op vasculaire endotheelcellen en tumorcellen. Een ander mogelijk mechanisme ligt in de rekrutering van ontstekingscellen door IL-17, zoals neutrofielen en macrofagen. Er is aangetoond dat IL-17 bevordert tumorprogressie door directe effecten op de rekrutering van neutrofielen [36], [37]. In ons onderzoek intratumorale IL-17 + cellen en MCT + IL-17 + cellen vertoonden beide zwakke maar significante correlatie met het aantal neutrofielen intratumor, terwijl intratumorale macrofagen vertoonde geen significantie. Hoewel nauwelijks neutrofielen werden gevonden uiten van IL-17R. -Mast afgeleid IL-17 kan een belangrijke rol spelen bij de rekrutering van neutrofielen door CXC chemokines, zoals CCL2, zoals eerder [38] beschreven. Bewijs van diverse kankers blijkt dat het aandeel van regulatoire T cellen (Tregs) wordt verhoogd in tumorweefsel bij patiënten met multipele tumoren [39], [40]. Vermeld is dat Tregs rekrutering een belangrijke rol bij de vaststelling van een VEGF-rijke tumor micro en toenemende tumorangiogenese [41] had. Eerdere studie heeft de regulerende rol van mestcellen, dat ze interageren met conventionele CD4 + T-cellen op IL-10 producerende genereren regulatoire T-cellen door de hartlijn van ICOSL /ICOS [42] beschreven. Ganeshan et al. [43] gemeld dat Tregs daadwerkelijk verbeteren, in plaats van remmen mast celproductie van IL-6, een pleiotrope cytokine, waarvan is aangetoond dat het een cruciale rol speelt in de regulatie van de balans tussen IL-17-producerende cellen en FoxP3 + regulatoire T-cellen. Aldus kan intense verbanden tussen Tregs en IL-17 producerende mestcellen. In onze studie, de correlatie tussen IL-17 + cellen en Tregs was zwak, maar significante, alsmede de MCT + IL-17 + cellen. Deze resultaten toonden aan dat IL-17 producerende mestcellen kan de differentiatie en accumulatie van Tregs induceren door het afscheiden van verschillende cytokinen en chemokinen, die verder moeten worden toegelicht.}

Voor zover wij weten is dit het eerste verslag van de fenotype en distributie van intratumorale IL-17-producerende cellen en hun klinische belang, en met name de prognostische waarde van intratumorale mestcel-afgeleide IL-17 bij maagkanker. Onze gegevens tonen aan dat de meeste IL-17-producerende cellen waren mestcellen, terwijl IL-17 ^{+ lymfocyten waren zeldzaam. Bovendien vonden we dat intratumorale IL-17 + cellen en intratumorale MCT + IL-17 + cellen werden gecorreleerd met slechtere overleving. Echter, het mechanisme (s) van mestcellen infiltratie in de tumor micro-omgeving en het specifieke mechanisme tussen de overexpressie van IL-17 en de inflammatoire en immuuncellen blijven grotendeels onbekend. Bovendien is de onderscheidende functie opgeslagen en uitscheiding van IL-17 moest nog worden toegelicht. Aldus prospectieve studies gericht mest celrecrutering en IL-17 productie in de maag tumor micro nodig om de voorspellende waarde van intratumorale mast cel-afgeleide IL-17 verder.}

Ondersteunende informatie
Figuur beoordelen S1.
colocalization tussen c-kit en mestceltryptase (MCT)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0106834.s001
(TIF)
Figuur S2.
colocalization tussen IL-17R (groen) en neutrofielen, macrofagen, regulatoire T-cellen (oranje)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0106834.s002
(TIF)

Dankwoord

Wij danken Lin Zhou, Haiyang Xie en Xiaowen Feng in de Key Lab van de gecombineerde Multi-Organ Transplantation, Ministerie van volksgezondheid, First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University voor technische ondersteuning in immunohistochemie en immunofluorescentie.

• PLoS: Het remmende effect van Pseudolaric Acid B op maagkanker en multidrug resistance via Cox-2 /PKC-α /P-gp Pathway
• PLoS ONE: miR-30b, stads Geregeld bij maagkanker, Bevordert apoptose en onderdrukt tumorgroei door zich te richten plasminogeenactivatorremmer-1