PLOS ONE: detecção e caracterização de células de câncer metastático no mesogástrio de pacientes com câncer gástrico

Abstract

O câncer gástrico é a segunda principal causa de morte por câncer no mundo. Aqui, propomos um novo tipo de metástase de tumor designado como metástase V no câncer gástrico. Metástase V é definida como o aparecimento de células cancerosas no mesogástrio com tecido adiposo perigastric. Para detectar a sua incidência e caracterizar suas características patológicas clínica, grande análise de tecido corte transversal de mesogástrio de foram utilizados 74 pacientes. Metástase V foi detectado em 1 de 40 (2,5%) pacientes com câncer gástrico precoce, 8 de 34 (24%) pacientes com câncer gástrico avançado. A média da distância de metástases V da parede gástrica foi de aproximadamente 2,6 centímetros. Metástase V foi intimamente associada com a profundidade a invasão do tumor, juntamente com um número de metástases nos linfonodos positiva. O prognóstico dos pacientes com metástase V foi significativamente ( P Art < 0,05) pior do que aqueles com mesogástrio livre de células do tumor. Estes resultados indicam que usando análise de corte todo, metástase V pode ser detectada no mesogástrio de doentes com cancro gástrico, e também sugere que pode ser um factor de risco para a sobrevivência do paciente após a cirurgia radical

citação:. Xie D, Liu G, Osaiweran H, C Yu, Sheng M, Gao C, et ai. (2015) detecção e caracterização de células de câncer metastático no mesogástrio de gástricas pacientes com câncer. PLoS ONE 10 (11): e0142970. doi: 10.1371 /journal.pone.0142970

editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, ​​Espanha

Recebido: 28 de junho de 2015; Aceito: 17 de setembro de 2015; Publicação: 13 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Xie et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes . estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Este estudo foi apoiado pela National Science Foundation da China, conceder números: 81572861; 81201638; 81302309; 81372324.

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Embora realizado com intenção curativa e combinado com quimioterapia neoadjuvante, a cirurgia radical para gástrico avançado. câncer (a linfadenectomia D2) é geralmente seguido por recidiva local-regional [1]. Na verdade, cerca de 75-80% dos casos ainda acabar com recidiva local-regional em 2 anos após a cirurgia [2]. recidiva local-regional após gastrectomia curativa radical é a principal razão para o mau prognóstico do câncer gástrico [3].

Nas últimas três décadas, a TME (excisão mesorreto total) ou CME (completa excisão mesocólica) procedimentos cirúrgicos para câncer colorretal diminuíram as chances de recorrência local e aumento da sobrevida em 5 anos [4,5]. pesquisa cirúrgica sugeriu que as razões supostamente são melhores técnicas, cirurgiões qualificados com mais anos de prática, gerenciamento avançado de-operação peri, e dissecções completos de linfonodos. Por outro lado, ainda é difícil de entender completamente como os pacientes que receberam ressecção R0 com encenação de T2N0M0 e T3N0M0 também têm recorrências locais-regional, que podem variar de 10% a 30% [6]. Assim, não há causas exatas ou razão para isso foi rigorosamente mostrado.

A invasão direta, drenagem linfática, disseminação hematogênica e disseminação peritoneal são as quatro rotas clássicas através do qual recorrência loco-regional ou distante implantes de células de câncer gástrico pode seja determinado. Cada um destes percursos é localizado no interior da cavidade em particular. Por exemplo, a invasão directa e propagação peritoneal estão localizados na cavidade serosa; metástase hemática pode ser encontrado nas cavidades dos vasos sanguíneos; na metástase linfática, as células cancerosas estão localizados nas cavidades de vasos linfáticos e dos gânglios. No entanto, para além destas vias, as pessoas têm também relatado diferentes células de cancro metastático nos tecidos adiposos perigastric locais [7-11]. Uma vez que não conseguiu descrever a cavidade estes tecidos foram localizados em, metástase tem sido explicada como uma ocorrência casual, evento ocasional, ou um confundida com uma propagação serosa subjacente. A hipótese de "envelope" de mesogástrio foi proposto quando uma cavidade anteriormente não identificado, cercado ou envolto por fáscia adequada, foi descoberto com as células cancerosas localizadas e movendo-se nele [12]. Designamos o aparecimento destas células cancerosas no mesogástrio com tecido adiposo perigastric como metástase V [12]. Para confirmar a nossa hipótese, foram detectados ainda mais a incidência e caracterizado as características patológicas da metástase V utilizando grandes amostras de tecido de secção transversal obtidas a partir de mesogástrio doentes com cancro gástrico. Um total de 5.892 amostras mesogástrio seções, cada uma com uma espessura de 4 mm, a partir de 74 pacientes foram analisados ​​(Fig 1A e 1B).

Materiais e Métodos

Pacientes, espécimes, e ao grande análise de amostra de tecido transversal

Setenta e quatro pacientes que foram submetidos a cirurgia para câncer gástrico primário no Departamento de cirurgia Gastrointestinal, Hospital Tongji, Tongji Medical College, em Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia entre outubro de 2012 e janeiro 2014 foram incluídos neste estudo. Os pacientes consistiu de quarenta e dois trinta e dois pacientes do sexo feminino, com idade média de 52 (variação, 23-72 anos) masculino e feminino. Todos estes pacientes foram submetidos a laparoscopia assistida D2 + CME (completa excisão mesogástrio) gastrectomia radical com uma ressecção R0 curativo, e toda a operação foi realizada pelo Prof. Jianping Gong, chefe de cirurgia GI de Tongji Hospital, Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia. Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito para participar do estudo. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Tongji.

Os espécimes mesogástrio foram obtidos a partir de tecidos gástricos ressecados. Neste estudo, quatro regiões do mesogástrio foram incluídos, e cada mesogástrio chamado de embarcações de Esquerda gastroepiplóicos (mLGEV), mesogástrio de Embarcações gastroepiplóica direita (mRGEV), meosgastrium de embarcações de Direito gástrica (mRGV) e mesogástrio dos vasos gástrica esquerda (mLGV) respectivamente, de acordo com os principais vasos sanguíneos que alimentam (Fig 1A). Todos os espécimes ressecados foram fixados em 10% de formalina neutra tamponada durante pelo menos uma hora antes de qualquer manipulação da mesogástrio. Os espécimes foram então endireitado para identificar os respectivos pedículos de mesogástrio, e os locais do tumor primário (superior (U), meio (M), ou L partes inferiores (), anterior ou paredes posteriores, curvaturas maiores ou menores). A distância mais próxima entre o tumor primário e cada mesentério foi medida e registada (Figura 1A). Os mesogastriums foram extraídos em bloco a partir do estômago, endireitou-se e medido para o seu comprimento e largura. As amostras foram cortadas perpendicularmente à parede do estômago em intervalos de 1 cm e organizada de proximal para distal padrão marcado por algarismos romanos (Fig 1B). Cada tira foi cortada em cubos em paralelo à parede do estômago em intervalos de 1 cm. Os cubos foram então sequenciados nos padrões radiais marcados e numerados em algarismos padrão. Os cubos foram colocados em cassetes de embebimento, armazenados em 10% de formalina neutra tamponada e transferido para o laboratório para posterior processamento histopatologia e grandes cortes seriados. Um total de 5.892 secções, cada 4 um de espessura, foram removidos a partir dos 74 pacientes, com uma média de 80 blocos (gama, 13-136) por paciente. Todos os blocos foram submetidos a coloração com hematoxilina-eosina e imuno-histoquímica. A Tabela 1 mostra as características clínicas e patológicas de 74 pacientes do nosso estudo. dados clínico-patológicos foram analisados ​​segundo a 7ª edição do Staging Manual do cancro da AJCC.

Para análise de sobrevivência, um total de sessenta e sete pacientes que receberam gastrectomia laparoscópica D2 além de excisão mesogástrio completo com uma ressecção R0 curativa entre fevereiro 2009 a junho de 2012 foram incluídos. Toda a operação foi realizada pelo Prof. Jianping Gong. Após a ressecção cirúrgica, todos os pacientes foram submetidos a um follow-up, com o período de acompanhamento médio de análise sendo 47 meses para todos os pacientes. O programa de acompanhamento de vigilância pós-operatória constou de exame físico, química do sangue, incluindo CEA, tomografia computadorizada e ultra-som realizado a cada 3 meses para diagnosticar doenças recorrentes.

A imuno-histoquímica e definição de metástase V em mesogástrio

a imuno-histoquímica foi realizada utilizando o anticorpo AE1 /AE3, um anticorpo monoclonal que reage às células epiteliais tumorais de órgãos gastrointestinais, e tem sido provado ser um marcador altamente sensível para os cancros gástricos.

a imunocoloração foi realizada de acordo com o método de estreptavidina-biotina padrão. Resumidamente, as secções foram desparafinizadas e reidratadas, e a peroxidase endógena foi inibida com 0,3% H _{2O 2. Para a recuperação de antigénio, as secções foram fervidas em 0,01 M, pH 6,0 tampão de citrato de sódio durante 15 min num forno de microondas. Após bloqueio com soro de cabra normal a 5% durante 30 min, o anticorpo primário anti-citoqueratina AE1 /AE3 monoclonal (1: 100) foi agora no bloqueio de tampões e as secções foram incubadas a 4 ° C durante a noite. Peroxidase /DAB, coelho /Mouse, DAKO de Sistemas de Detecção de Envision ™ foram aplicados nas etapas seguintes. As secções foram contrastadas com hematoxilina de Mayer, desidratados numa série graduada de álcool, limpas em xileno, e montadas. Metástase V é definida como a presença de células cancerosas isoladas na mesogástrio que é descontínua da lesão primária e sem nódulos linfáticos detectados na mesma lâmina, tal como detectado por coloração HE e imunocoloração para citoqueratina AE1 /AE3.}

a imuno-histoquímica de análise de imagem

a intensidade do produto da reacção de e-caderina e DAB2IP imuno-histoquímica foi medida semi-quantitativamente usando software image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, CA, EUA). Este procedimento pode ser dividido em sete etapas distintas: 1. Criação e medição da área de interesse (AOI); 2. calibrar a densidade óptica; 3. aquisição, conversão e gravação de imagens; 4. executar o plano de fundo e coloração de fundo correção; 5.setting da AOI na imagem adquirida para medir a densidade óptica; 6.measuring densidade; macros 7.creating [13].

Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS 17.0. Os dados descritivos foram apresentados como média ± SD. O X ^{2, teste exato de Fisher foram ser usado para determinar a significância das diferenças entre as co-variáveis. As durações de sobrevivência foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier e foram analisados ​​pelo teste de log-rank para comparar as durações de sobrevivência cumulativos nos grupos de pacientes. A curva de sobrevivência foi calculada a partir da data da cirurgia. O modelo de riscos proporcionais de Cox foi usado para calcular os rácios perigos uni e multivariada para os parâmetros do estudo. Para todos os testes, um P-valor inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.}

Resultados e Discussão

detecção de metástases V

A metástase V foi detectada no 9 do total de 74 (12%) pacientes por H & e de coloração e imuno (Fig 1C), incluindo 1 de 40 (2,5%) pacientes com câncer gástrico precoce, 8 de 34 (24%) pacientes com câncer gástrico avançado (Tabela 2). Estas células cancerosas são isolados descontínua da lesão primária e sem nódulos linfáticos foi observada na mesma lâmina (Fig 1C). A clínica características patológicas de pacientes positivos Metástase V foram apresentados na Tabela 2. Destes, cinco tinham pouco diferenciado adenocarcinoma e quatro tinham moderadamente diferenciado adenocarcinoma. Em termos de profundidade de invasão do tumor, dois tiveram a penetração tumor da serosa, seis apresentaram uma invasão sub-serosa e um tinha uma penetração de sub-mucosa (Tabela 2). Embora oito metástase pacientes V-positivos tinham metástase em linfonodo positivo, paciente uma metástase V-positiva sem metástase ganglionar, também foi identificado.

Distribuição e distância de Metástase V

Para identificar a distribuição de metástase V, analisaram-se as relações entre a localização de metástases V e as lesões primárias do tumor, bem como a distância de metástases V a partir das paredes gástricas. Destes nove pacientes Metástase V-positivos, a localização de metástases V em relação ao tumor primário em cinco pacientes foram detectados na mLGV perto da artéria gástrica esquerda (linfonodo estação No. 7), a artéria hepática comum (nó de linfa No. 8 estação) e do tronco celíaco (linfonodo No. 9 estação) (Fig 2). Os quatro restantes foram encontrados no mRGEV perto dos nodos linfáticos infropyloric (No. 6 estação) (Fig 2). Curiosamente, as lesões de metástase V foram encontrados tanto em mLGV e mRGV perto dos gânglios linfáticos suprapyloric (estação) em um paciente (paciente 5 da figura 2).

A distância média de metástase V a partir gástrica parede era de aproximadamente 2,6 cm (variação, 1-8 cm) (Fig 1D). A gama de distâncias de metástases a partir de V nas paredes gástricas foi de 1-3 cm em 8 dos 9 pacientes esperam que um paciente (Paciente 8), no qual a distância foi de 8 cm. Isto pode ser devido ao mesogástrio na cavidade abdominal alongando para fora e mudando de uma forma tridimensional quando ressecado pelo cirurgião.

Correlação entre Metástase V e fatores clínicos

As características demográficas dos pacientes e as características patológicas de tumores com metástases V, ambos positivos e negativos, são mostrados na Tabela 3. a incidência de metástases V estava intimamente relacionado com a profundidade da invasão tumor primário. Metástase V foi mais frequente em tumores que invadem o subseroso (6/20 tumores; 30%) ou camada serosa (2/4 tumores; 50%) em comparação com tumores que invadem a camada submucosa (1/40 tumores; 2,5%), o que foi estatisticamente significativa (P = 0,001). Além disso, metástases em linfonodos foi também intimamente associado com metástase V. Metástase V foi mais frequente como o número de metástase ganglionar aumentou (N0: 1/45, 2,2%; N1: 4/18, 22,2%; N2: 1/6 , 16,7%; N3: 3/5, 60%; respectivamente, P = 0,001). Mal tumores diferenciados eram mais propensos a ter Metástase V, mas não é estatisticamente significativa (P = 0,489). Não houve diferenças significativas entre a metástase V-positivos e metástase V-negativos em termos de sexo, idade, tamanho do tumor, localização do tumor e subtipos histológicos (Tabela 3 e S1 Tabela).

Survival

com base em nossos dados de acompanhamento, o prognóstico de todos os pacientes com metástase V-positivos foi significativamente (P = 0,006) pior do que pacientes V-negativos metástase (Fig 3A). Além disso, analisamos o significado prognóstico da metástase V nas diferentes subgrupos de tumor (T2, T3 e T4) ou estágios clínicos (II e III). O prognóstico dos doentes com metástases V-positiva foi significativamente pior do que aqueles com metástases V-negativo no subgrupo T3 (P = 0,004; Figura 3B) ou em fase clínica II (P = 0,0005; Fig 3C), enquanto que não houve diferença significativa no prognóstico foi encontrada entre a metástase V-positivos e metástase V-negativos nos subgrupos T2, T4 ou em fase III (dados não mostrados). Também foram avaliados os fatores prognósticos que afectam a sobrevivência global. De acordo com uma análise univariada, o diâmetro tamanho (P = 0,02), a classificação Laurén (P = 0,01) e Metástase V (P = 0,002) foram significativamente correlacionados com a sobrevida do paciente (S2 Tabela). Em uma análise multivariada, Metástase V (P = 0,037) foi encontrado para ser fatores prognósticos independentes (S3 tabela).

DAB2IP e E-caderina é regulada para baixo na metástase V

A fim para avaliar o significado clínico dos resultados e desenvolver alvo terapêutico potencial para a metástase V, foi necessário investigar os mecanismos moleculares subjacentes. E-caderina é considerada como um importante marcador de EMT (transição epitelial-mesenquimal-a), conhecido como um processo crucial na biologia da metástase do cancro [14]. Os nossos estudos anteriores demonstraram que a perda de expressão DAB2IP EMT iniciado e promovido invasão tumoral e metástase [15]. Neste estudo, a metástase e sua mesogástrio tumor primário correspondente e tecido normal adjacente foram imunocoradas para DAB2IP e E-caderina. Os nossos resultados mostraram que a expressão de ambos DAB2IP e E-caderina diminuiu as metástases mesogástrio em comparação com os do tumor primário combinado e o tecido normal adjacente (figura 4), o que sugere que EMT DAB2IP-regulada pode desempenhar um papel na metástase V . Uma vez que a jusante da via Wnt DAB2IP mediada é a activação de factores de transcrição tais como a beta-catenina e p65, também detectada a expressão de beta-catenina e p65. Os nossos resultados mostraram que a expressão de ambos os beta-catenina e p65 aumentado (bem como de localização nuclear) na metástase mesogástrio comparada com a de tumor primário (S1 figura). Os mecanismos regulatórios exatos, no entanto, precisa ser mais investigada.

Discussão

Em nosso estudo, é evidente que as células cancerosas metastáticas residem nos tecidos adiposos em torno do estômago do paciente com câncer gástrico. Estas células metastáticas de cancro gástrico mostrou três características principais: (1). eles estão localizados em tecidos adiposos e separados a partir do tumor primário; (2). não havia estruturas de vaso sanguíneo, nódulos linfáticos ou de outros vasos em torno destas células metastáticas (Fig 1C); (3). os tecidos adiposos foram envolvidos por fáscia adequada. Estas características demonstram que este tipo de metástase era diferente dos quatro tipos clássicos de metástase, incluindo invasão direta, propagação serosa, metástase linfática ou disseminação hematogênica. Desde que foi um novo caminho, que o designou, para o momento, como metástase V [12]. As células cancerosas metastáticas costuma se espalhar em diferentes cavidades por forças diferentes, por exemplo, metástase hematogênica se espalha em cavidades dos vasos sanguíneos impulsionado pela circulação do fluxo de sangue, linfonodo metástases se espalha nas cavidades linfáticos impulsionado pela circulação do fluxo linfático, enquanto infiltração direta e os spreads serosa estão nas cavidades serosas que mostra um spread autónoma livre ou movimento. Nossa dados anteriores sugeriram que Metástase V foi observada estar se espalhando no interior da cavidade fascia adequada, e os dados deste estudo sugere ainda que EMT DAB2IP mediada pode estar envolvido na metástase V se espalhando através de tecidos de gordura (Fig 4).

a metástase V foi estreitamente relacionado com profundidade de invasão do tumor na parede do estômago. Os nossos dados mostram que a maioria dos casos de metástases ocorreu em V T3 ou tumores T4A, embora alguns ocorreu também nos tumores T1 (Tabela 2). Metástase V também foi correlacionada com metástases linfáticas. gânglios linfáticos encenação N1-N3 apresentaram percentuais maiores de Metástase V de N0, e apesar de N0 teve casos de metástase V (Tabela 3). Além disso, o prognóstico dos doentes com tumores Metastasis V-positivas foi significativamente pior do que aqueles tumores com metástases V-negativas, especialmente em T3 ou fase II (Figura 3). Devido ao número limitado de pacientes no estudo corrente, uma amostra maior de pacientes coorte devem ser inscritos para análise posterior. Estes resultados sugerem que a detecção de metástases V tem uma relevância de mau prognóstico em pacientes que são submetidos a uma ressecção curativa. Desde D2 gastrectomia radical só pode limitadamente melhorar a sobrevida de pacientes com câncer gástrico avançado, detecção de metástases V dentro do mesogástrio ressecado deve ser um método eficaz para a seleção de pacientes para posterior quimioterapia terapêutica ou outras terapias-alvo. A rota exata ou mecanismo de metástase V não é clara. Supõe-se que, quando o tumor primário invade a parede gástrica, até certo ponto, as células tumorais cair fora do local primário possível devido ao mecanismo de EMT DAB2IP-regulada e, em seguida distribuídos entre os tecidos de gordura no interior da cavidade fáscia adequada de mesogástrio que se situa entre o estômago e o mesentério [12].

Metástase V não é limitada apenas ao cancro gástrico mas também pode existir em muitos outros tipos de cancro proveniente de vários tecidos, incluindo o cancro rectal, o adenoma nefrogénica, et ai [16,17 ]. Em nosso estudo, houve uma incidência de 24% de metástase V no câncer gástrico avançado, sendo esse percentual pode ser esperado para aumentar quando seções transversais maiores de um slide por 0,5 ou 0,25 cm são feitas.

Embora outros demonstraram, por meio de grandes secções em série de mesogástrio de curvaturas maior e menor, que a incidência de nódulos de tumor em mesogástrio pode ser tão elevada como 8% [11], as características patológicas e incidência de metástases V não está completamente estudada. Em primeiro lugar, com base na anatomia embrionária, o omento maior eo omento menor não são totalmente mesogástrio. Mesogástrio deve possuir duas características: uma é que ele deve ser localizado ao longo da borda de estômago, a outra é que deve incluir os principais vasos sanguíneos do mesentério que os ligam aos órgãos ligados. Em nosso estudo, quatro regiões do mesogástrio foram ressecados por laparoscopia assistida D2 + CME (completa excisão mesogástrio) gastrectomia radical, e cada região foi nomeado mLGEV, mRGEV, mLGV, mRGV respectivamente (Fig 1A). Analisamos ainda mais a localização de metástases V dentro de diferentes regiões do mesogástrio. Nossos dados mostraram que mLGV e mRGEV são mais frequentemente detectado com Metástase V do que outros mesogástrio (Fig 2), o que implica a importância clínica dessas duas partes durante a gastrectomia radical. Um estudo mais aprofundado sobre a distância de Metástase V das paredes gástricas sugeriu o intervalo ou duração do mesogástrio a ser ressecado durante a cirurgia radical (Fig 1D).

Tem sido bem conhecido na prática, que a cirurgia radical para o câncer deve incluir ressecções em bloco dos tecidos tumorais e vizinhos primários. No entanto, é difícil de entender os limites exatos de ressecção em bloco levando a uma linfadenectomia mais completo a ser realizado. O modelo de metástase V dentro mesogástrio que está envolvido pela fáscia adequada propõe um limite preciso e direção patológica que não pode ser coberta pelo modelo de metástase linfática. Além disso, os nossos resultados são clinicamente significativa porque a metástase através desta via requer invariavelmente a excisão cirúrgica como o tratamento de escolha. Dado que a recidiva local-regional pode ser intimamente associada com metástase V, completa excisão mesogástrio (CME) deve ser realizado juntamente com gastrectomia e D2 linfonodo dissecação para reduzir a incidência de recidiva local-regional no câncer gástrico [18]. Um ensaio clínico aleatório (NCT01978444) está actualmente em curso em nosso departamento de avaliar o significado clínico da excisão cirúrgica de metástases V.

Informações de Apoio
S1 Table. Correlação entre Metástase V e subtipos histológicos (N = 74)
doi: 10.1371. /Journal.pone.0142970.s001
(DOCX)
S2 Table. A análise univariada de fatores que afetam a sobrevida global em 67 pacientes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0142970.s002
(DOCX)
S3 Tabela. A análise multivariada de fatores que afetam a sobrevida global em 67 pacientes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0142970.s003
(DOCX)
S1 Fig. . Expressão de p65 e β-catenina em mucosa normal gástrica, tumores gástricos primários e metástases V dentro do mesogástrio
coloração IHC representativas para p65 e β-catenina a partir do mesmo paciente
doi:. 10.1371 /journal.pone. 0142970.s004
(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos Xiaolan Li para apoio técnico e Sanpeng Xu para análise patológica. Agradecemos também a Ernest Johann pela assistência editorial.

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