PLoS ONE: Обнаружение и определение характеристик клеток метастатического рака в мезогастрит от больных раком желудка

Абстрактный
<р> Рак желудка является второй ведущей причиной смерти от рака во всем мире. Здесь мы предлагаем новый тип метастазирования опухоли, обозначенный как метастаз V при раке желудка. Метастазы V определяется как появление раковых клеток в мезогастрит с жировой тканью окружающий пищеварительный тракт. Для того, чтобы определить его частоту и характеризуют его клинические патологические особенности, большое поперечное сечение анализ в ткани мезогастрит от использовали 74 пациентов. Метастазы V был обнаружен у 1 из 40 (2,5%) больных с ранними стадиями рака желудка, 8 из 34 (24%) пациентов с распространенным раком желудка. Среднее расстояние метастазирования V от стенки желудка составляла примерно 2,6 см. Метастазы V была тесно связана с глубиной инвазии опухоли, наряду с целым рядом положительных метастазов лимфатических узлов. Прогноз пациентов с метастазами V значительно ( P
&л; 0,05) хуже, чем те, с опухолью бесклеточной мезогастрит. Эти данные показывают, что с помощью анализа в целом сечения, Метастазы V могут быть обнаружены в мезогастрит желудочных больных раком, а также предполагает, что это может быть фактором риска для выживаемости пациентов после радикальной операции
<р> Образец цитирования:. Се D, Лю L, Osaiweran Н, Ю. С, Шэн F, Гао С. и др. (2015) Обнаружение и определение характеристик клеток метастатического рака в мезогастрит от больных раком желудка. PLoS ONE 10 (11): e0142970. DOI: 10.1371 /journal.pone.0142970
<р> Редактор: Alfons Navarro, Университет Барселоны, Испания
<р> Поступила 28 июня, 2015 года; Принято: 17 сентября, 2015 года; Опубликовано: 13 ноября 2015
<р> Copyright: © 2015 Се и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные . находятся в его сопутствующую информацию, файлы бумаги и
<р> Финансирование: Это исследование было поддержано Национальным научным фондом Китая, предоставляют номера: 81572861; 81201638; 81302309; 81372324.

Конфликт интересов: Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Несмотря на то, выполняется с лечебной целью и в сочетании с неоадъювантной химиотерапии, радикальной операции по расширенному желудка. рак (Гастрэктомия с D2 лимфаденэктомии) часто сопровождается локальной региональной рецидива [1]. На самом деле, около 75-80% случаев до сих пор в конечном итоге с местного и регионального рецидива в 2-х лет после [2] операции. Местный-региональный рецидив после лечебной радикальной гастрэктомии является основной причиной плохого прогноза рака желудка [3].

В последние три десятилетия, TME (всего мезоректальная иссечение) или CME (полная mesocolic иссечение) хирургические процедуры колоректальный рак уменьшились шансы местного рецидива и увеличение 5-летней выживаемости [4,5]. Хирургическая исследования показали, что предполагаемые причины лучшие методы, квалифицированные хирурги с большим количеством лет практики, расширенные функции управления пери-операции, а также полный иссечение лимфатических узлов. С другой стороны, это все еще трудно полностью понять, как у пациентов, получавших резекцию с R0 постановкой T2N0M0 и T3N0M0 также местного и регионального рецидивы, которые могут варьироваться от 10% до 30% [6]. Таким образом, нет точных причин или оснований для этого не было строго показано.
<Р> прямое вторжение, лимфатический дренаж, гематогенного распространения и перитонеального распространения являются четыре классические маршруты, через которые на местном регионарных рецидивов или отдаленные имплантаты клеток рака желудка может определяется. Каждый из этих путей находится в определенной полости. Например, прямое вторжение и перитонеальный распространение расположены в серозные полости; гематогенный метастаз могут быть найдены в полости кровеносных сосудов; в лимфатическую метастазирования, раковые клетки расположены в полости лимфатических сосудов и узлов. Тем не менее, в дополнение к этим путям, люди также сообщали о различных метастатическим раковые клетки в локальных жировых тканях окружающий пищеварительный тракт [7-11]. Так как они не в состоянии описать полость эти ткани были расположены в, метастазирование было объяснено, как случайность, случайные события, или один путать с лежащей в основе серозного распространения. была предложена "обволакивают" гипотеза мезогастрит когда ранее неизвестная полость, окружена или окутан правильной фасции, был обнаружен с раковыми клетками, расположенными и движущихся в ней [12]. Мы обозначили появление этих раковых клеток в мезогастрит с жировой тканью окружающий пищеварительный тракт как метастаз V [12]. Для того, чтобы подтвердить нашу гипотезу, мы также обнаружили частоту и охарактеризованы патологические характеристики метастазирования V с использованием больших поперечных образцов сечения тканевые мезогастрит, полученных от больных раком желудка. В общей сложности 5,892 образцов мезогастрит секций, каждая толщиной 4 мкм, от 74 пациентов были проанализированы (рис 1А и 1В).

Материалы и методы

Пациенты, образцов и большой Перекрестный анализ образца ткани в разрезе
<р> Семьдесят четыре пациентов, перенесших операцию по поводу первичного рака желудка в отделении хирургии желудочно-кишечного тракта, Тунцзи больницы Тунцзи медицинского колледжа в Хуажонге университета науки и техники в период с октября 2012 по январь 2014 года были включены в этом исследовании. Пациенты состоял из сорока двух мужчин и тридцати двух пациентов женского пола со средним возрастом 52 (диапазон 23-72 лет). Все эти пациенты прошли лапароскопию помощь D2 + CME (полная мезогастрит иссечение) радикальная гастрэктомия с лечебной R0 резекции, и вся операция была выполнена профессором Цзяньпин Гун, главный GI хирургии Тунцзи больницы, Хуажонге университета науки и техники. Все участники представили письменное информированное согласие на участие в исследовании. Это исследование было одобрено Комитетом по этике Тунцзи больницы.
<Р> Образцы мезогастрит были получены из резецированными желудка тканей. В этом исследовании, были включены четыре области мезогастрит, и каждый из которых назван мезогастрит левых желудочно-сальниковый сосудов (mLGEV), мезогастрит из правой желудочно сосудов (mRGEV), meosgastrium правого Желудочные сосудов (mRGV) и мезогастрит из левого желудочка сосудов (mLGV) соответственно в соответствии с основными питающих сосудов (рис 1А). Все резецированные образцы фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение, по крайней мере за один час до любой манипуляции мезогастрит. Образцы были затем выпрямилась, чтобы идентифицировать соответствующие цветоножки на мезогастрит, и участки первичной опухоли (верхняя (U), средний (М), или ниже (L) частей, передней или задней стенки, в большей или меньшей кривизн). Ближайшее расстояние между первичной опухоли и каждого брыжейки была измеряли и регистрировали (Фиг.1А). В mesogastriums извлекали целиком из желудка, выпрямить и измеряли их длине и ширине. Образцы были вырезаны перпендикулярно к стенке желудка на 1см промежутки времени и организованы в проксимальнее дистальной рисунка, отмеченного римскими цифрами (рис 1В). Каждая полоска была разрезана на кубики параллельно стенке желудка на 1см интервалами. Кубики затем секвенировали в радиальных моделей, отмеченных и нумеруются с использованием стандартных цифр. Кубики были помещены в заливочных кассет, хранится в 10% нейтральном формалине буферизацией и переносили в лабораторию патоморфологическую для дальнейшей обработки и большой серийный секционирования. В общей сложности 5,892 секций, каждая из 4 мкм толщиной, были удалены из 74 пациентов, при среднем значении 80 блоков (диапазон 13-136) на одного пациента. Все блоки были подвергнуты окрашивание гематоксилином-эозином и иммуногистохимии. В таблице 1 приведены клинические и патологические характеристики 74 пациентов в нашем исследовании. Клинико-патологическими данные были проанализированы в соответствии с 7-м издании Руководства по Staging AJCC рака.
<Р> Для анализа выживаемости, в общей сложности шестидесяти семи пациентов, получавших лапароскопической D2 гастрэктомию плюс полный мезогастрит иссечение с лечебной резекции R0 в период с февраля 2009 года по июнь 2012 года были включены. Вся операция была выполнена профессором Цзяньпин Гун. После хирургической резекции, все пациенты прошли последующую деятельность, с медиана наблюдения при анализе является 47 месяцев для всех пациентов. Последующая программа послеоперационного наблюдения состояла из физического обследования, биохимический анализ крови, включая CEA, компьютерная томография и ультразвуковое исследование выполняется каждые 3 месяца, чтобы диагностировать рецидивирующие заболевания.

Immunohistochemistry и определение метастазирования V в мезогастрит <бр> <р> Immunohistochemistry проводили с использованием цитокератин AE1 /AE3 антитело, моноклональное антитело, которое реагирует на эпителиальные клетки опухоли из желудочно-кишечного тракта и было доказано быть весьма чувствительным маркером рака желудка.
<р> Иммунологическое была выполнена в соответствии со стандартом стрептавидин-биотин методом. Вкратце, срезы депарафинировали и регидратации, и эндогенная пероксидаза ингибируется с 0,3% Н <суб> 2O <суб> 2. Для поиска антигена срезы варят в 0,01 М, рН буфера цитрата натрия 6,0 в течение 15 мин в микроволновой печи. После блокирования 5% нормальной козьей сывороткой в ​​течение 30 мин, первичный анти-цитокератин AE1 /AE3 моноклональные антитела (1: 100), теперь в блокировании буферов и срезы инкубировали при 4 ° С в течение ночи. Пероксидазы DAB, кролик мыши, DAKO от систем обнаружения Envision ™ были применены //в следующих шагах. Срезы контрастировали гематоксилином Майера, обезвоживают в градуированных серии спирта, очищенной в ксилоле, и установлен. Метастазирование V определяется как наличие изолированных раковых клеток в мезогастрит разрывами от первичного очага и без каких-либо обнаруженных на том же слайде лимфатических узлах, а детектируется ОН окрашиванием и иммуногистохимическое цитокератин AE1 /AE3.

анализ Immunohistochemistry изображения
<р> интенсивность продукта реакции Е-кадгерина и DAB2IP иммуногистохимии измеряли полуколичественно с помощью Image Pro Plus Software 6.0 (Media Кибернетика, CA, USA). Эта процедура может быть разделена на семь различных этапов: 1. Создание и измерения области интереса (AOI); 2. калибровки оптической плотности; 3. приобретение, преобразование и сохранение изображений; 4. выполнение фона и фоновое окрашивание коррекции; 5.setting из АОИ в получившемся изображении для измерения оптической плотности; 6.measuring плотность; 7.creating макросы [13].

Статистический анализ
<р> Статистический анализ проводили с помощью SPSS версии 17.0. были представлены описательные данные, как среднее ± стандартное отклонение. X 2 тест, точный критерий Фишера были быть использованы для определения значимости различий между ковариантами. Длительности выживаемости были рассчитаны с использованием метода Каплана-Мейера и анализировали с помощью теста лог-ранга для сравнения кумулятивного продолжительности выживаемости в группах пациентов. Кривая выживания вычисляли со дня операции. Модель пропорционального риска Кокса использовали для вычисления одномерных и многомерных опасностей коэффициенты для исследуемых параметров. Для всех испытаний, Р-значение менее 0,05 считается статистически значимым.

Результаты и обсуждение

Обнаружение метастазирования V
<р> Метастазы V был обнаружен в 9 из всего 74 (12%) пациентов по H &Amp; E окрашивание и иммунное (рис 1C), в том числе 1 из 40 (2,5%) больных с ранними стадиями рака желудка, 8 из 34 (24%) пациентов с распространенным раком желудка (табл 2). Эти изолированные раковые клетки являются прерывистыми из первичного очага и нет лимфатических узлов не наблюдалось в том же слайде (рис 1C). В клинике патологические особенности положительных пациентов Метастазы V были приведены в таблице 2. Из этих пациентов, пять были слабо дифференцированы аденокарциномы и четыре были умеренно дифференцированной аденокарциномы. С точки зрения глубины инвазии опухоли, два имели проникновение опухоли серозной, шесть имели суб-серозная вторжение и один был суб-слизистых оболочек проникновение (таблица 2). Хотя восемь метастазирования V-положительных пациентов имели положительный метастазы в лимфоузлы, также был идентифицирован один Метастазы V-положительный пациент без метастазов в лимфатических узлах.

Распределение и расстояние Метастазы V
<р> Для того, чтобы определить распределение метастазы V, мы проанализировали взаимосвязь между локализацией метастазирования V и первичных опухолевых поражений, а также расстояние метастазирования V от желудочных стенок. Из этих девяти Метастазы V-положительных пациентов, положение метастаза V по отношению к первичной опухоли у пяти пациентов были обнаружены в mLGV близко к левой желудочной артерии (лимфатический узел № 7 станции), общей печеночной артерии (лимфатический узел № 8 станция) и чревного ствола (лимфатический узел № 9 станции) (рис 2). Остальные четверок были найдены в mRGEV близко к infropyloric лимфатических узлов (№ 6 станции) (рис 2). Интересно, что очаги метастазирования V были обнаружены в обоих mLGV и mRGV близко к suprapyloric лимфатических узлов (№ 5) станция у одного пациента (пациент 5 из рис.2).
<Р> Среднее расстояние метастазирования V от желудка стена была приблизительная 2,6 см (диапазон 1-8 см) (рис 1D). Диапазон расстояний метастазирования V от желудочных стенок составляла 1-3 см в 8 из 9 пациентов ожидают одного пациента (пациент 8), в котором расстояние составляло 8 см. Это может быть связано с мезогастрит в брюшной полости, и удлинении меняется от трехмерной формы, когда резекция хирургом.

Корреляция между V и метастазы клинических факторов
<р> Демографические характеристики пациентов и патологические особенности опухолей с метастазами V, как позитивы и негативы, приведены в таблице 3. частота метастазирования V была тесно связана с глубиной вторжения первичной опухоли. Метастазы V был более частым в опухолях, вторгающихся в subserosal (6/20 опухоли; 30%) или серозный слой (2/4 опухолей; 50%) по сравнению с опухолями, вторгшихся подслизистой слой (1/40 опухоли; 2,5%), что было статистически значимым (p = 0,001). Кроме того, метастазов в лимфатических узлах был также тесно связан с метастазами В. V был метастазы чаще, как количество метастазов в лимфатических узлах увеличилось (N0: 1/45, 2,2%; N 1: 4/18, 22,2%; N 2: 1/6 , 16,7%; N 3: 3/5, 60%, соответственно, р = 0,001). Плохо дифференцированные опухоли были более склонны иметь метастазирования V, но не является статистически значимым (P = 0,489). Там не было никаких существенных различий между метастазирования V-позитивов и метастазирование V-негативов с точки зрения пола, возраста, размера опухоли, локализации опухоли и гистологических подтипов (Таблица 3 и S1 таблицу).

Выживание
<р> на основе наших последующих данных, прогноз всех V-положительных пациентов метастазирования значительно (P = 0,006) хуже, чем метастазирования V-отрицательных пациентов (рис 3А). Кроме того, мы проанализировали прогностическое значение метастазирования V в различных опухолевых подгрупп (Т2, Т3 и Т4) или клинические стадии (II и III). Прогноз у больных с метастазами V-положительным был значительно беднее, чем те, с метастазами V-отрицательным в T3 подгруппы (P = 0,004; фиг.3В) или в клинической стадии II (P = 0,0005; рис 3C), в то время как никаких существенных различий в прогнозе была обнаружена между метастазированием V-позитивов и метастазирование V-негативов в Т2, Т4 подгруппах или в стадии III (данные не показаны). Мы также оценили прогностические факторы, влияющие на общую выживаемость. Согласно однофакторного анализа, диаметр размер (Р = 0,02), Lauren классификация (Р = 0,01) и метастазирование В (Р = 0,002) были достоверно коррелирует с выживаемостью пациентов (S2, таблица). В многомерном анализе было обнаружено метастаз V (P = 0,037) являются независимыми прогностическими факторами (S3 Таблица).

DAB2IP и E-кадгерин являются вниз регулируется метастазирования V

Для того, оценить клиническую значимость результатов и разработки потенциальной терапевтической мишени метастазирования V, это было необходимо исследовать основные молекулярные механизмы. Е-кадгерин рассматривается в качестве основного маркера для EMT (эпителиальные к мезенхимальных перехода), известный как критический процесс в биологии раковых метастазов [14]. Наши предыдущие исследования показали, что потеря экспрессии DAB2IP инициировал EMT и способствовало опухолевой инвазии и метастазированию [15]. В этом исследовании, мезогастрит метастаз и его соответствие первичной опухоли и нормальной тканью были иммуноокрашиванию для DAB2IP и Е-кадгерина. Наши результаты показали, что экспрессия обоих DAB2IP и Е-кадгерина снизилась в мезогастрит метастазирования по сравнению с таковым в согласованной первичной опухоли и нормальной тканью (рис 4), что наводит на мысль, что DAB2IP регулируемых ЕМТ могут играть определенную роль метастазирования V . Так как ниже по потоку от DAB2IP-опосредованной Wnt пути является активация транскрипционных факторов, таких как бета-катенина и р65, мы также обнаружили экспрессию бета-катенина и р65. Наши результаты показали, что экспрессия как бета-катенина и p65 повышенной (а также ядерной локализации) в мезогастрит метастазирования по сравнению с этим в первичной опухоли (S1 рис). Точные механизмы регулирования, однако, необходимо провести дальнейшее расследование.

Обсуждение

В нашем исследовании, то ясно, что метастатические раковые клетки находятся в тканях жировой ткани вокруг живота желудка больного раком. Эти метастатические Клетки рака желудка показали три основные характеристики: (1). они расположены в жировой ткани, и отделен от первичной опухоли; (2). не было структуры кровеносных сосудов, лимфатических узлов или других сосудов вокруг этих метастатических клеток (рис 1C); (3). ткани жировой ткани были окутаны правильной фасции. Эти характеристики показали, что этот тип метастазирования отличался от четырех классических типов метастазирование, в том числе прямого вторжения, серозные распространение, лимфатический метастаза или гематогенного распространения. Так как это был новый путь, мы обозначив его, на данный момент, как метастаз V [12]. Метастатические раковые клетки обычно распространяются в пределах различных полостей различными силами, например, гематогенный метастаз распространяется в полости кровеносных сосудов, управляемых циркуляции потока крови, лимфатических узлов метастазы распространяется в лимфатической полостей ведомых за счет циркуляции лимфатической потока, в то время как прямой инфильтрации и серозные спреды в серозных полостях, которая показывает свободное распространение автономного или движения. Наши предыдущие данные свидетельствуют о том, что метастазирование V наблюдалось, распространяется в пределах надлежащего фасцией полость, и данные этого исследования еще раз свидетельствует о том, что DAB2IP-опосредованной ЕМТ могут быть вовлечены метастазирования V распространяется через жировой ткани (фиг.4).
<р> метастазы V тесно коррелировало с глубиной инвазии опухоли в стенки желудка. Наши данные показывают, что большинство случаев метастаза V произошло в T3 или опухолей T4a, хотя некоторые из них также имели место в опухолях Т1 (таблица 2). Метастазы V также коррелируют с лимфатической метастазирования. Лимфатические узлы постановка N1-N3 были большие проценты метастазирования V, чем N0, и хотя N0 были случаи метастазирования V (таблица 3). Кроме того, прогноз больных с метастазами V-положительных опухолей был значительно хуже, чем те, с метастазами V-отрицательных опухолей, особенно в T3 или II стадии (рис 3). Из-за ограниченного числа пациентов в данном исследовании, большая выборка пациентов когорты должны быть включены для дальнейшего анализа. Эти данные позволяют предположить, что обнаружение метастазирования V имеет плохую прогностическое значение у пациентов, которые проходят целебное резекцию. Так как D2 радикальной гастрэктомии может только улучшить ограниченно выживание передовых больных раком желудка, обнаружение метастазирования V в пределах мезогастрит резекцию должно быть эффективным методом для отбора пациентов для дальнейшего терапевтического химиотерапии или других целевых методов лечения. Точный маршрут или механизм метастазирования V не ясна. Предполагается, что, когда первичная опухоль прорастает стенку желудка до определенной степени, опухолевые клетки уходят из первичного сайта возможно благодаря DAB2IP регулируемого механизма EMT, а затем распространяться среди жировых тканей в пределах надлежащего фасцией полость мезогастрит который лежит между желудком и брыжейки [12].
<р> Метастазирование V не ограничивается только к раку желудка, но может также существовать во многих других видов рака, происходящих из различных тканей, включая рак прямой кишки, нефрогенной аденомы и др [16,17 ]. В нашем исследовании, было падение на 24% метастазирования V при поздних стадиях рака желудка, и такой процент может быть как ожидается, возрастет, когда более крупные сечения одного слайда на 0,5 или 0,25 см сделаны.
<Р> Хотя другие показали, через крупные серийные срезы мезогастрит большей и меньшей кривизной, что частота опухолевых узлов в мезогастрит может достигать 8% [11], патологические особенности и частота метастазирования V не полностью изучены. Во-первых, на основе эмбриональной анатомии, большим сальником и меньшей сальнике не полностью мезогастрит. Мезогастрит должен обладать двумя характеристиками: является то, что она должна быть расположена вдоль края желудка, а другой является то, что он должен вложить основные кровеносные сосуды брыжейки, которые соединяют их с прикрепленными органов. В нашем исследовании, четыре области мезогастрит резецировали с помощью лапароскопии помощь D2 + CME (полная мезогастрит иссечение) радикальной гастрэктомии, и каждый регион был назван mLGEV, mRGEV, mLGV, mRGV соответственно (рис 1А). Кроме того, мы проанализировали локализацию метастаза V в пределах различных регионов мезогастрит. Наши данные показали, что mLGV и mRGEV чаще обнаруживаются с метастазами V по сравнению с другими мезогастрит (рис 2), что предполагает клиника значение этих двух частей в процессе радикальной гастрэктомии. Дальнейшее исследование на расстоянии метастазирования V от желудочных стенок предложил диапазон или длину мезогастрит быть резекция во время радикальной операции (рис 1D)
. <Р> Это было хорошо известно на практике, что радикальная операция по поводу рака должна включать в себя гуртом резекция первичной опухоли и соседних тканей. Тем не менее, трудно понять точные границы гуртом резекция приводит к более полной лимфаденэктомии предпринимается. Модель метастаза V в мезогастрит, который окутан правильной фасции предлагает точную границу и патологическое направление, которое не может быть покрыта модели лимфатического метастазирования. Более того, наши результаты являются клинически значимыми, поскольку метастазирование через этот путь неизбежно требует хирургического иссечения в качестве лечения выбора. Учитывая, что на местном регионального рецидива может быть тесно связана с метастазами V, полная мезогастрит иссечение (СМЕ) должно осуществляться наряду с гастрэктомии и D2 лимфодиссекция, чтобы уменьшить частоту местных рецидивов в региональном рака желудка [18]. Рандомизированное исследование контроль (NCT01978444) в настоящее время ведется в нашем отделе, чтобы оценить клиническую значимость хирургического удаления метастаза В.

подтверждающей информации,
S1 таблице. Корреляция между V и метастазы гистологических подтипов (N = 74)
DOI: 10.1371. /Journal.pone.0142970.s001
(DOCX)
S2 Таблица. Одномерный анализ факторов, влияющих на общую выживаемость у 67 больных
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0142970.s002
(DOCX)
S3 Таблица. Многофакторный анализ факторов, влияющих на общую выживаемость у 67 больных
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0142970.s003
(DOCX)
S1 Рис. . Экспрессия р65 и бета-катенина в нормальной слизистой оболочке желудка, первичных опухолей желудка и метастазирование V в пределах мезогастрит
Представитель IHC окрашивания для p65 и бета-катенина из того же самого пациента
DOI:. 10.1371 /journal.pone. 0142970.s004
(TIF)

Выражение признательности
<р> Мы благодарим состоилась Ли за техническую поддержку и Sanpeng Сюй патологического анализа. Мы также благодарим Эрнеста Иоганна за помощь в редактировании.

• PLoS ONE: Антидепрессанты и Рак желудка: общенациональная населения на основе Уплотненный случай-контроль Study
• PLoS ONE: PFTK1 Содействует рака желудка прогрессию регуляции пролиферации, миграции и Invasion