PLOS ONE: Atoh1 pode regular a tumorigenicidade de células de câncer gástrico por induzir a diferenciação de células-tronco do câncer

Sumário

cancro de células estaminais (CSCs) têm mostrado mediar a tumorigenicidade, quimio-resistência, rádio-resistência e metástases, o que sugere que eles ser considerados alvos terapêuticos. Devido suas células filhas diferenciadas não são mais tumorigénico, para induzir a diferenciação das CSCs pode ser uma das estratégias que podem erradicar CSCs. Aqui nós mostramos que Atoh1 pode induzir a diferenciação de células-tronco do câncer gástrico (GCSCs). PCR em tempo real e análise de Western blot mostrou que Atoh1 foi induzida durante a diferenciação de GCSCs. Além disso, a sobre-expressão induzida por lentivírus de Atoh1 em GCSCs e em linhas celulares de cancro gástrico induzida significativamente diferenciação, proliferação e formação esfera reduzida e reduzida in vivo
formação de tumores nos modelos de injeção e fígado metástase xenoenxerto subcutâneo. Estes resultados sugerem Atoh1 ser considerado para o desenvolvimento de uma terapia de diferenciação para câncer gástrico

Citation:. Han ME, Baek SJ, Kim SY, Kang CD, Oh SO (2015) Atoh1 pode regular a tumorigenicidade de câncer gástrico células por induzir a diferenciação de células estaminais cancerosas. PLoS ONE 10 (5): e0126085. doi: 10.1371 /journal.pone.0126085

Editor do Academic: Gianpaolo Papaccio, Segunda Universidade de Nápoles, Itália

Recebido: 03 de setembro de 2014; Aceito: 30 de março de 2015; Publicado em: 07 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Han et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel, exceto dados RNA sequenciação que foram depositados no repositório público. (GEO Número de Acesso: GSE46597)

Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Bio e Desenvolvimento Tecnologia médica (2012M3A9C6050213) e a pesquisa científica básica Foundation (2012R1A1A3010521), da Fundação Nacional de Pesquisa (NRF), financiado pelo governo coreano (MEST) e, uma bolsa da R &Nacional; Programa D de Controle do Câncer, Ministério da Saúde, Bem-Estar e Assuntos da família, República da Coreia (0.920.050) . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Depois de células-tronco cancerosas (CSCs) foram inicialmente isoladas de pacientes de leucemia, que tinham sido isolados a partir de muitos tipos de câncer, incluindo câncer gástrico [1,2,3,4,5,6]. CSCs têm sido sugeridos para ser um alvo terapêutico porque eles podem mediar a tumorigenicidade, quimio-resistência, rádio-resistência e metástase [7,8,9]. A terapia anti-convencional do câncer, principalmente alvos proliferando não CSCs, o que explica a recorrência frequente de câncer [9]. O mau prognóstico de pacientes com maior população CSC, também incentiva o desenvolvimento de terapêuticas que visam as CSCs [10].

Uma das características dos CSCs é que eles podem se diferenciar em células-filhas que já não são tumorigénico, por exemplo , CSCs do cólon e do estômago foram induzidas para se diferenciarem por soro [5,6]. Isto significa que a hipótese de CSC difere fundamentalmente da hipótese de expansão clonal tradicional. Além disso, a relação hierárquica entre CCC e as suas células filhas podem ser explicadas pelos mecanismos epigenética que pode ser aplicada às células estaminais normais [11,12]. Além disso, o microambiente pode afectar a diferenciação das CSCs [13], e esta característica pode ser explorada para o desenvolvimento de agentes terapêuticos.

Por conseguinte, a indução de diferenciação é uma estratégia que pode ser utilizada para erradicar CSCs. reguladores ambientais têm sido sugeridos para induzir a diferenciação, por exemplo, histona desacetilase (HDAC) foram mostrados para induzir a diferenciação das CSCs em leucemia que foram provocadas por proteínas de fusão, tais como, AML1-ETO e PML-RARa [14,15 ]. Além disso, o ácido trans-retinóico (ATRA), pode induzir a diferenciação das CSCs na leucemia promielocítica aguda (APL), através de factores de C /EBP [16,17], factores de transcrição de tipo selvagem, tais como, diferenciação C /EBPα, pode induzida em humanos AML e em linhas celulares de cancro do pulmão e no rato In vivo
modelos [17,18,19,20]. No cancro gástrico, suramina tem sido mostrado para induzir a diferenciação de linhas de células de cancro gástrico humano [21].

Atoh1 é uma hélice-laço-hélice (bHLH) factor de transcrição homóloga de base para a atonal Drosophila [22]. Ela ativa a transcrição E box-dependente em colaboração com E47 [23]. HES1, uma molécula na via de sinalização Notch, pode inibir a sua expressão [24]. estudos knock-out de ratinho demonstraram que Atoh1 desempenha papéis importantes na geração de neurónios cerebelares granulares, as células ciliadas do ouvido interno, interneurónios da espinal medula, células de Merkel na pele e células secretoras intestinais [25]. Curiosamente, Atoh1 tem sido associado a vários tipos de cancros, incluindo o cancro do cólon [25].

Para desenvolvimento de uma nova terapia diferenciação no câncer gástrico, analisamos as mudanças de expressão nos níveis de mRNA durante a diferenciação de células-tronco de câncer gástrico células (GCSCs). Verificou-se que durante a diferenciação de GCSCs, o nível de expressão Atoh1, o que é importante para a diferenciação das células epiteliais intestinais [26,27], foi significativamente aumentada. Além disso, a indução de Atoh1 em linhas celulares de cancro gástrico e em GCSCs reduziu significativamente a sua tumorigenicidade em modelos de metástases hepáticas e injecção subcutânea

Materiais e.; Métodos

culturas de células

tecidos câncer gástrico-tronco do câncer gástrico foram recuperados após a obtenção do consentimento informado escrito dos pacientes que foram submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital Pusan ​​National University (PNUH) e Pusan ​​Hospital Nacional Yangsan University (PNUYH ). O protocolo do estudo foi aprovado pelo Pusan ​​National University Hospital-Institutional Review Board (IRB-PNUH) e Pusan ​​National University Yangsan Hospital-Institutional Review Board (IRB-PNUYH). células-tronco cancerosas gástricas foram cultivadas como descrito anteriormente [6], e foram induzidas a se diferenciarem através da adição de 5% FCS aos meios de comunicação em vez de fatores de crescimento.

Cultura de linhas celulares de cancro gástrico

O câncer gástrico células (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, NCI-N87) foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 100 ug
/ml de penicilina /estreptomicina a 37 ° C em um CO 5% _{2 incubadora humidificada. Estas linhas celulares foram obtidas a partir da linha celular coreana Banco (Seoul, Coreia).}

Cultura da linha celular 293FT

293FT células foram mantidas em DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10% e 0,1 mM MEM não-aminoácidos essenciais (NEAA), 1 mM de piruvato de sódio MEM (ambos da Sigma, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), 6 mM de L-glutamina (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA), e 1% de Pen-Strep num CO 5% _{2 incubadora humidificada.}

sequenciação de ARN e análise de dados

Biblioteca foi preparado utilizando o kit de preparação de amostra de ARN IlluminaTruSeq e sequenciado utilizando o Illumina Genoma Analyzer IIx (San Diego, CA, EUA) para gerar 76 pb final emparelhado lê. Sequenciado leituras foram alinhados em um genoma de referência humano 19 usando Tophat 2 [id pubmed 19289445]. expressão de mRNA foi medida como RPKM (leituras por quilobases por milhão mapeados lê) a partir mapeados exclusivamente lê usando um modelo RefSeq hg19 eo pacote HTSeq (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/). arquivos de cama foram produzidos usando Tophat 2. Todos RNA dados de sequenciamento foram depositados no repositório público (GEO Número de acesso: GSE46597)

PCR em tempo real

A extração de RNA e PCR em tempo real foram realizadas. a utilização de uma fonte de SYBR Green PCR master Mix e um detector de sequências ABI 7500 Prism (ambos a partir de Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), como previamente descrito [28]. As sequências dos iniciadores utilizados (para a frente e reverso, respectivamente) foram as seguintes: marcadores de diferenciação; CA1, 5'- TCA GAG CAG CTG GCA CAA TTC CG-3 'e 5' CCT TCA GAG GTT GGG TTG GGC G-3 '; SSTR2, 5'- CCA GGA ACC CCA AAC GTC CG-3 'e 5'-CAG TGT GAC ATC TTT GCT TTT CCG C -3'; CHGA, 5'- GCA AAC CGC AGA CCA GAG GAC C-3 'e 5'-TGT CTC AGC CCC GCC GTA GT-3'; PGC2, 5'-TGG CCT ACC CTG CTC TGT CCG -3 'e 5'-ACT CCA GGA CCA GGT TGC TGA GG -3'; MUC5AC, 5'- TCA CAC GGT CCT GCC CAC AGA G-3 'e 5'-ACC CCT GCA TCT CAG AGC CCC -3'; ATP4B, 5'-GAA AGC CCA GCC CCA CTA CAG C-3 'e 5' TGC TCC GCC ATG ACC TTG CAC -3 '; marcadores stemness; CD44, 5'-GCC TGG GGA CTC TGC CTC GT-3 'e 5'-AGC CTT GCA GAG GTC AGC GG -3'; LGR5, 5'-GAG CTG CCT TCC AAC CTC AG-3 'e 5' CCC GCA AGA CGT AAC TCC TC -3 '; BMI1, 5'-TGG TTG CCC ATT GAC AGC GG -3 'e 5'-AAA AAT CCC GGA AAG AGC AGC CG-3'; e c-Myc, 5'- ACA CCC GAG CAA GGA CGC GA -3 'e 5'-CGC GGG AGG CTG CTG GTT TTC -3'; Atoh1, 5'- CCC CTT CCA GCA AAC AGG TG -3 'e 5'-ACG GGA TAA CAT TGC GCA GC -3'; GAPDH 5'-GAG TCC ACT GGC GTC TTC AC-3 'e 5' ATG ACG AAC ATG GGG GCA TC -3 '. GAPDH foi utilizada para normalizar os níveis de entrada cDNA

análise de Western blot

análise de Western blot foram realizados conforme descrito anteriormente [24], utilizando os seguintes anticorpos:. Atoh1 (LSBio, Seattle, WA, EUA ); CD44, LGR5, ATP4B, CA1, PGC, MUC5AC (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA); C-Myc, caspase-3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA); caspase-3, caspase-9 clivada, caspase-9 (Cell Signaling Technology, MA, EUA); p21, o anticorpo β-actina (Abcam, Cambridge, MA, EUA) e anticorpo secundário conjugado com HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EUA).

construções lentivirais e a geração de vírus activo

Para criar um clone de expressão, a sequência verificada viral ORF Clones (Atoh1, IOH34744; Life Technologies, Grand Island, NY) em vetores de entrada de gateway foram transferidos para vector pLenti7.3-DEST (pLenti7.3/V5-DEST gateway Vector Kit, Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) utilizando uma reacção de recombinação LR (mistura de enzima clonase LR II, Life technologies, Grand Island, NY, EUA). Para a transformação, foi utilizado One Shot Stbl3 E. coli competente (Life Technologies). Após a co-transfecção do clone de expressão e a mistura ViraPower Embalagem (Life Technologies) para a linha celular 293FT (Life Technologies) para produzir lentivírus, os sobrenadantes foram colhidos lentivirais. Estes stocks lentivirais foram utilizados para transduzir GCSCs e linhas celulares de cancro gástrico.

recolha do vírus e propagação foram realizados de acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies). O vírus controle foi gerado em paralelo sem a inclusão de Atoh1.

Construção de linhas celulares RASSF4-repórter e ensaio de luciferase

O Gluc-ON Promotor Reporter Clones, pEZX-PG02 (HPRM11834-PG02 , GeneCopoeia, Rockville, MD, EUA) foram utilizados para construir linhas de células repórteres RASSF4-luciferase (NCI-N87 e SNU216 células) e puromicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi utilizado para a selecção. O lentivírus descrito acima foi usado para induzir Atoh1. actividades de luciferase foram medidas usando Segregue-Par Gaussia Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD, EUA) de acordo com as instruções do fabricante a 72 horas após a transdução.

Xenoenxerto ensaio

As células foram diluídas para uma dose de injecção apropriado (1x10 ^{6 células), misturado com BD Matrigel (BD Biosciences, CA, EUA) a uma proporção de 1: 1, e injectadas por via subcutânea no lado dorsal de cada um dos flancos em imunodeficiência combinada severa (SCID) (n = 5 /grupo). Para minimizar a variabilidade experimental devido a diferenças individuais em ratinhos receptores, as populações de células que estavam a ser comparados foram injectados em flancos opostos dos mesmos animais. Os tumores foram colhidos após quatro semanas e pesos dos tumores foram medidos. Para o modelo de metástases do fígado, foram anestesiados ratinhos SCID com uma injecção intra-peritoneal de combinação de cetamina /xilazina. Em seguida, os ratos foram objecto de uma incisão de cerca de 10 mm na subcostal esquerda, o baço foi confirmada no âmbito do peritônio, peritônio foi aberto para cerca de 8 mm e o baço foi exposto ao longo do peritônio. As células (5x10 4 células /100 ul
) foram lentamente injectada no baço de murganhos através de uma agulha de calibre 27 (n = 5 /grupo) e, em seguida, o baço foi devolvido à cavidade abdominal , o peritônio e que a ferida foi suturada. 4 semanas após a inoculação com as células, os ratinhos foram sacrificados [37]. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório emitidas pelo Instituto Nacional de Saúde. Pusan ​​National University-Animal Care Institucional e Use Committee (PNU-IACUC) aprovou todos os procedimentos experimentais envolvendo animais.}

A proliferação celular ensaio

Cinco dias após a transdução com lentivírus, 10 l
de pré-mistura solúvel em água, sal de tetrazólio-1 (WST-1, Roche, Indianapolis, IN, EUA) foi adicionado em poços. Estas células foram então incubadas durante duas horas e a viabilidade celular foi determinada medindo a absorvância a 450 nm utilizando um leitor de ELISA (TECAN, Mannedorf, Suíça).

Esfera ensaio de formação de

esferas foram dissociados em células isoladas e plaqueadas em placas de 96 poços em 0,2 ml de volumes de meios. Cada poço da placa de 96 poços continha menos do que 10 células. As células foram então cultivadas e monitorizada durante 5-7 dias. Esferas maiores do que 25 um foram contadas usando o microscópio invertido e a eficiência da formação esfera foi comparado.

A análise dos dados

O Mann-Whitney U-teste não paramétrico ou o teste t de Student (não pareado comparações) foram utilizados para determinar os significados de diferenças entre os valores médios dos dois grupos e análise de uma via da variância (ANOVA) seguida por comparações múltiplas de Tukey foi utilizado para determinar os significados de diferenças entre os valores médios de três ou mais grupos . * Indica um valor P de < 0,05, foi considerado que o critério de significância. Os dados foram analisados ​​usando o software SPSS, versão 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Os resultados são apresentados como médias ± SDs.

resultados

Indução de Atoh1 durante a diferenciação de GCSCs

A diferenciação de GCSCs pelo soro foi demonstrado anteriormente [6]. Para identificar os fatores associados com a diferenciação, foram comparados os perfis de expressão de mRNA de células-tronco e células em estados de células diferenciadas por seqüenciamento RNA. Muitos genes supressores de tumores foram induzidos durante a diferenciação (dados não mostrados). Curiosamente, Atoh1, um factor de transcrição essencial para a diferenciação das células epiteliais intestinais, também foi induzida. Para confirmar esta indução da Atoh1 durante a diferenciação, examinámos as mudanças no nível de expressão de Atoh1 por PCR em tempo real e análise de Western blot. Descobrimos como GCSCs aproximou fases terminais da diferenciação, a expressão de Atoh1 aumentou (Fig 1).

A superexpressão de Atoh1 induzida a diferenciação de GCSCs

Para determinar os papéis de Atoh1 durante a diferenciação GCSC, que sobre-expresso em que GCSCs usando lentivírus. Para verificar status de diferenciação, examinamos os níveis de vários marcadores de diferenciação ou stemness expressão. Notavelmente, a sobre-expressão de Atoh1 em GCSCs aumentou o nível de expressão diferentes marcadores de diferenciação, mas diminuiu os níveis de vários marcadores stemness (Figura 2) de expressão.

Em seguida investigamos se Atoh1 poderia regular a proliferação ou a formação de esfera. Curiosamente, a superexpressão de Atoh1 diminuiu significativamente as proliferações de vários tipos de linhas celulares de cancro gástrico e formação esfera por GCSCs (Fig 3).

Atoh1 superexpressão reduzida in vivo
tumorigenicidade

para determinar se Atoh1 pode regular a in vivo
tumorigenicidade das células cancerosas gástricas, foi utilizado um modelo de metástase hepática produzida pela injeção de células de câncer gástrico para o baço (células posteriormente migrou para o fígado). Notavelmente, a sobre-expressão de Atoh1 reduziu significativamente a formação do tumor no fígado por GCSCs e por células de cancro gástrico NCI-N87 (Figura 4). Além disso, quando fizemos xenoenxertos subcutâneos, foram observados resultados semelhantes (Fig 4).

Atoh1 aumento da atividade promotora RASSF4

Para confirmar se a diferenciação de GCSCs por Atoh1 é mediada através da sua actividade de transcrição, examinámos a actividade do promotor de um gene alvo Atoh1 (RASSF4) usando ensaios de luciferase [29]. Após o promotor RASSF4, o qual se acoplou com o gene lucifease, foi introduzido estavelmente em linhas celulares de cancro gástrico (NCI-N87 e células SNU216), examinámos os efeitos de Atoh1 sobre a actividade de luciferase. A transdução com Atoh1 aumentou significativamente a actividade de luciferase do promotor de RASSF4. (Fig 5).

O envolvimento da apoptose e ciclo celular percursos nos efeitos da Atoh1

Os relatórios anteriores têm relatado apoptose e ciclo celular percursos estão envolvidos nos efeitos da Atoh1 sobre tumores na retina [30] e do cólon [25]. Então, examinamos se proteínas relacionadas também estão envolvidos nos efeitos da Atoh1 na proliferação (Fig 3A) e formação de esfera (Fig 3B) no presente estudo. A alteração na proliferação e formação de esfera pode ser devido a um ciclo celular mais lenta, um aumento da taxa de apoptose, ou ambos.

Encontrámos a transdução com Atoh1 aumentou o nível de clivada pela caspase-3 e caspase-9- em GCSCs e linhas celulares de cancro gástrico (figura 6), sugerindo que a via de apoptose intrínseca pode ser envolvido. Além disso, também encontramos aumento da regulação do p21 em cima superexpressão Atoh1 (Fig 6).

Discussão

No presente estudo, mostramos que Atoh1, um fator de transcrição HLH, pode induzir a diferenciação de GCSCs, e isso leva a uma perda de tumorigenicidade. Atoh1 sobreexpressão tem sido mostrado previamente para induzir a diferenciação de células estaminais em células secretoras intestinais [24], e em ratos Atoh1-nulo, células secretoras não foram gerados no intestino [26]. Este efeito de Atoh1 na diferenciação também tem sido observada em células de cancro colorrectal, em que actuou como um supressor de tumor. Além disso, em aproximadamente 70% dos cancros colorrectais, a sua expressão tem sido relatado para ser diminuída por mecanismos genéticos e ambientais [25,31]. Em células de câncer colorretal, Atoh1 superexpressão reduziu a proliferação e crescimento em agar mole e xenotransplantes [31], e supressão de Atoh1 reforçada tumorigenicidade em ratos [25]. Estes resultados sugerem que colectivamente Atoh1 pode ser utilizada como uma terapia de diferenciação para os cancros gastrointestinais.

Em contraste com o seu efeito sobre a diferenciação, Atoh1 pode também promover a proliferação de células progenitoras e a formação do tumor. Durante o desenvolvimento do cerebelo de ratos, Atoh1 foi encontrado para iniciar o programa de diferenciação de cerebelar grânulos neurônios precursores numa fase inicial (P0). No entanto, numa fase posterior (P5), promoveu a proliferação de precursores [32,33,34]. supressão Atoh1 em P0, inibiu fortemente a diferenciação, mas a sua eliminação em fase posterior resultou na saída do ciclo celular e diferenciação [35]. Estes diferentes papéis de Atoh1 em diferentes fases pode ser explicada por targetomes diferentes [35]. Atoh1 promovido formação meduloblastoma em conjunto com a via de sinalização Hedgehog Shh [36,37]. Além disso, sua expressão foi encontrado para ser significativamente elevados no adenocarcinoma mucinoso, carcinoma anel de sinete, e tumores neuroendócrinos intestinais [38]. Portanto, para ser capaz de utilizar Atoh1 para a terapia de diferenciação, seus alvos directos que induzem a diferenciação precisam de ser identificados.

Embora os estados de Expressional Atoh1 têm sido relatados na mucosa gástrica normal e no cancro gástrico, as suas funções são mal caracterizado. Atoh1 é expressa em células epiteliais gástricas humanas normais em níveis baixos [39,40], mas a sua expressão não foi observada nas células epiteliais gástricas normais no estômago do rato [26]. Além disso, o rato e da mucosa gástrica humana metaplásico mostraram expressão Atoh1 [41], mas a sua expressão não foi observada em linhas de células de cancro gástrico, incluindo MKN74, MKN45, KATOIII, HSC58 e [40]. Em alguns doentes com cancro gástrico, que é sobre-expressa [39]. Seus papéis fisiopatológicos nunca foram exploradas em câncer gástrico. No presente estudo, verificou-se que a indução da expressão Atoh1 pode reduzir a proliferação, invasão e a tumorigenicidade de células de cancro gástrico. Encontramos também o possível envolvimento de p21 e via de apoptose em efeitos de Atoh1.

Nossas observações sugerem a possibilidade de que o gene Atoh1 deve ser vista como alvo potencial tratamento para o cancro gástrico. As pequenas moléculas que induzem a expressão ou a terapia génica utilizando células estaminais ou vírus poderia ser desenvolvido. Em particular, Atoh1 foi encontrada para induzir a diferenciação de células estaminais do cancro gástrico, e, assim, agentes terapêuticos segmentação Atoh1 pode ser capaz de erradicar as células estaminais do cancro.

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