PLoS ONE: Atoh1 Может Регулировать туморогенности клеток рака желудка индуцируя дифференцировке стволовых клеток рака

Абстрактные
<р> Раковые стволовые клетки (ЦОК) было показано, что посредником онкогенность, химио-сопротивление, радиорезистентности и метастазирование, которые предполагают, что они считаются терапевтических мишеней. Из-за их дифференцированные дочерние клетки больше не онкогенными, чтобы индуцировать дифференцировку ЦОК может быть одной из стратегий, которые может уничтожить CSCs. Здесь мы покажем, что Atoh1 может индуцировать дифференцировку желудка раковых стволовых клеток (GCSCs). ПЦР в реальном времени и Вестерн-блот-анализ показал, что Atoh1 индуцировали во время дифференцировки GCSCs. Кроме того, лентивирусов-индуцированной избыточная экспрессия Atoh1 в GCSCs и в линиях раковых клеток желудка значительно индуцирует дифференциацию, снижение пролиферации и образования сферы, а также снижение В естественных условиях
образование опухоли в подкожных инъекций моделей и печени метастазы ксенотрансплантатных. Эти результаты указывают на Atoh1 быть рассмотрены для развития дифференцировки терапии по поводу рака желудка
<р> Образец цитирования:. Хан ME, Пэк SJ, Ким С.Ю., Кан CD, Oh So (2015) Atoh1 может регулировать туморогенности рака желудка Клетки индуцируя дифференцировании рака стволовых клеток. PLoS ONE 10 (5): e0126085. DOI: 10.1371 /journal.pone.0126085
<р> Академический редактор: Gianpaolo Papaccio, Второй университет Неаполя, Италия
<р> Поступило: 3 сентября 2014 года; Принято: 30 марта, 2015 года; Опубликовано: 7 мая 2015
<р> Copyright: © 2015 Хан и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в работе, за исключением РНК секвенирования данных, которые были сданы на хранение в государственном хранилище. (GEO, инвентарный номер: GSE46597)
<р> Финансирование: Эта работа была поддержана Программой развития био- и медицинские технологии (2012M3A9C6050213) и фундаментальной науки исследований Фонд (2012R1A1A3010521) Национального исследовательского фонда (ПЗФ), финансируемой правительством Кореи (МЭПВ) и, грант от Национального R &усилителя; D Программа по борьбе с раковыми заболеваниями, Министерство здравоохранения, социального обеспечения и по делам семьи, Республики Корея (0920050) , Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> После того, как раковые стволовые клетки (ЦОК) первоначально были выделены от больных лейкозом, они были изолированы от многих видов рака, включая рак желудка [1,2,3,4,5,6]. ОКК было предложено, чтобы быть терапевтической мишенью, так как они могут опосредовать туморогенность, химио-сопротивление, радиорезистентности и метастазирование [7,8,9]. Традиционная терапия противораковым в основном установлены целевые показатели пролиферирующих не-CSCs, что объясняет частое повторение рака [9]. Неблагоприятный прогноз пациентов с большей населения CSC, также способствует развитию терапевтических средств, нацеленных на CSCs [10].
<Р> Одна из характеристик ЦОК является то, что они могут дифференцироваться в дочерние клетки, которые больше не онкогенными, например, , ОКК от толстой кишки и желудка раков были дифференцироваться сывороткой [5,6]. Это означает, что гипотеза ЦОК принципиально отличается от традиционного клонального гипотезы расширения. Кроме того, иерархические отношения между ЦОНов и их дочерние клетки могут быть объяснены с помощью эпигенетических механизмов, которые могут быть применены к нормальным стволовым клеткам [11,12]. Кроме того, микросреда может влиять на дифференцировку ЦОК [13], и эти характеристики могут быть использованы для разработки терапевтических средств
. <Р> Таким образом, индуцирование дифференциации является стратегией, которая может быть использована, чтобы уничтожить CSCs. Эпигенетические регуляторы Было предложено, чтобы побудить их дифференцировку, например, ингибиторы гистондеацетилазы (HDAC) Было показано, что для индукции дифференцировки ЦОНов при лейкемии, которые были вызваны слитых белков, таких как, AML1-ЕТО и PML-RARα [14,15 ]. Кроме того, все-транс-ретиноевой кислоты (ПТРК) может индуцировать дифференцировку ЦОК в острой промиелоцитарной лейкемии (APL) с помощью C факторов /EBP [16,17], дикие транскрипционные факторы типа, например, C /EBPα, может индуцирует дифференцировку у человека AML и в линиях клеток рака легких и на мышах в естественных условиях
модели [17,18,19,20]. При раке желудка, сурамин было показано, чтобы индуцировать дифференцировку клеток желудка человека линий [21].
<Р> Atoh1 является основной спираль-петля-спираль (bHLH) фактор транскрипции, гомологичны атональное Drosophila [22]. Он активирует E коробчатой ​​зависимой транскрипции в сотрудничестве с Е47 [23]. Hes1, молекула в передаче сигналов Notch пути, может подавлять его экспрессию [24]. Выбиваемые исследования мыши показали, что Atoh1 играет решающую роль в генерации нейронов мозжечка гранул, внутренних волосковых клеток уха, спинного мозга, вставочных клеток Меркеля в коже и кишечных секреторных клеток [25]. Интересно, что Atoh1 был связан с различными видами рака, включая рак толстой кишки [25].
<Р> Для разработки новой дифференциации терапии при раке желудка, мы проанализировали изменения экспрессии на уровне мРНК во время дифференцировки желудка раковых стволовых клетки (GCSCs). Было установлено, что во время дифференцировки GCSCs, уровень экспрессии Atoh1, что имеет важное значение для дифференцировки эпителиальных клеток кишечника [26,27], был значительно увеличен. Кроме того, индукция Atoh1 в желудочном линий раковых клеток, а в GCSCs существенно сократили онкогенность подкожной модели метастаз инъекций и печени

Материалы и АМФ. МЕТОДЫ

Желудочный раковых стволовых клеточных культур
<р> желудочные раковые ткани были получены после получения письменного информированного согласия пациентов, подвергшихся хирургической резекции в Пусане Национальной университетской больницы (PNUH) и Пусане Национальной Yangsan университетской больницы (PNUYH ). Протокол исследования был одобрен Национальным советом Пусане университета Больница-Institutional Review (PNUH-IRB) и Национального совета Пусане университета Yangsan Больничные Institutional Review (PNUYH-IRB). Желудочный раковые стволовые клетки культивировали, как описано ранее [6], и были индуцированы к дифференцировке добавлением 5% FCS в средах, а не факторов роста.

Культура линий рака желудка клеточных
<р> Рак желудка клетки (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, NCI-N87) культивировали в RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 100 <ЕМ> мкг
/мл пенициллина /стрептомицина при 37 ° с в 5% CO а <суб> 2 увлажненном инкубаторе. Эти клеточные линии были получены из корейской линии клеток банка (Сеул, Корея).

Культура 293FT линии клеток
<р> 293FT клетки поддерживали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,1 мМ MEM Non-незаменимых аминокислот (NEAA), 1 мМ пирувата натрия MEM (оба из SIGMA, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США), 6 мМ L-глутамина (Life Technologies, Grand Island, Нью-Йорк, США), и 1% Pen-Strep в 5% CO <суб> 2 увлажненном инкубаторе.

РНК секвенирование и анализ данных
<р> Библиотека была подготовлена ​​с использованием РНК-IlluminaTruSeq Sample Kit Prep и секвенировали с использованием Illumina Genome Анализатор IIx (Сан-Диего, штат Калифорния, США) для создания 76 п.н. в паре концевых чтений. Sequenced чтений были согласованы на референсный геном 19 с использованием TopHat 2 [PubMed ID 19289445]. экспрессия мРНК измеряли как RPKM (читает Per килобаза на миллион отображенной читает) из однозначно сопоставляются чтений с использованием модели RefSeq hg19 и пакет HTSeq (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/). Файлы кровать были получены с использованием TopHat 2. Все данные РНК секвенирования были депонированы в общественном хранилище (GEO инвентарный номер: GSE46597)

ПЦР в реальном времени
<р> Выделение РНК и реального времени были проведены ПЦР. с использованием мощности SYBR Green PCR Master Mix и 7500 детектор последовательности ABI Prism (оба из Applied Biosystems, Foster City, CA, США), как описано ранее [28]. Последовательности праймеров, используемых (вперед и назад, соответственно) распределились следующим образом: маркеры дифференцировки; CA1, 5'- TCA GAG CAG CTG GCA CAA TTC CG-3 'и 5'- ССТ TCA GAG GTT GGG TTG GGC G -3'; SSTR2, 5'- CCA GGA ACC CCA AAC GTC CG-3 'и 5'- CAG TGT GAC ATC ТТТ ТТТ GCT CCG C -3'; КВУА, 5'- GCA AAC CGC AGA CCA GAG GAC C-3 'и 5'- TGT СТС AGC CCC НКУ GTA GT-3'; PGC2, 5'- TGG ССТ ACC CTG CTC TGT CCG-3 'и 5'- ACT CCA CCA GGA GGT ТГК TGA GG-3'; MUC5AC, 5'- TCA CAC GGT ССТ НКУ CAC AGA G -3 'и 5'- ACC CCT GCA TCT CAG AGC CCC -3'; ATP4B, 5'- GAA AGC CCA CCA GCC CTA CAG C -3 'и 5'- ТГК TCC ATG GCC ACC TTG CAC -3'; Стволовости маркеры; CD44, 5'- НКУ TGG GGA CTC ТГК КТК GT-3 'и 5'- AGC CTT GCA GAG GTC AGC GG-3'; LGR5, 5'- GAG CTG ССТ TCC AAC CTC AG-3 'и 5'- CCC GCA AGA ВКТ AAC TCC TC-3'; Bmi1, 5'- TGG TTG CCC ATT GAC AGC GG-3 'и 5'- AAA AAT CCC GGA AAG AGC AGC CG-3'; и с-Мус, 5'- ACA CCC GAG CAA GGA CGC GA-3 'и 5'- CGC GGG AGG CTG CTG GTT ТТС -3'; Atoh1, 5'- CCC СТТ ССА GCA AAC AGG TG-3 'и 5'- ACG GGA ТАА CAT ТГК GCA GC-3'; GAPDH 5'- GAG TCC ACT GGC GTC TTC AC-3 'и 5'- ATG ACG AAC ATG GGG GCA TC-3'. GAPDH был использован для стандартизации входных уровней кДНК

Вестерн-блот анализ
<р> Вестерн-блот-анализ проводили, как описано ранее [24], используя следующие антитела:. Atoh1 (LSBio, Сиэтл, Вашингтон, США ); CD44, LGR5, ATP4B, CA1, PGC, MUC5AC (Sigma-Aldrich Co., Сент-Луис, штат Миссури, США); с-Мус, каспазы-3 (Santa Cruz Biotechnology, Калифорния, США); расщепляется каспазы-3, каспазы-9, расщепляется каспазы-9 (Cell Signaling Technology, MA, USA); p21, β-актин антитела (Abcam, Кембридж, Массачусетс, США) и HRP-конъюгированные вторичные антитела (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Пенсильвания, США).

Lentiviral конструкции и генерация активного вируса <бр>

Для создания экспрессии клона, последовательность подтверждали вирусной ORF клона (Atoh1, IOH34744; Life Technologies, Grand Island, NY) в векторы входных шлюзов были перенесены в pLenti7.3-DEST вектора (pLenti7.3/V5-DEST шлюз Vector Kit, технологии жизни, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) с использованием реакции LR рекомбинации (смеси ферментов LR Clonase II, технологии жизни, Grand Island, NY, USA). Для трансформации использовали One Shot Stbl3 компетентную E. палочка (Life Technologies). После котрансфекции клона экспрессии и ViraPower Packaging Mix (Life Technologies) в клеточную линию 293FT (Life Technologies) для производства лентивирус, собирали супернатанты лентивирусов. Эти лентивирусов запасы были использованы для трансдукции GCSCs и желудка клеточных линий рака.
<Р> Сбор и распространение Вирус были выполнены в соответствии с инструкциями производителя (Life Technologies). Вирус управления был создан параллельно без включения Atoh1.

Строительство клеточных линий RASSF4-репортер и анализа люциферазы
<р> Gluc-ON Promoter Reporter Клоны, pEZX-PG02 (HPRM11834-PG02 , GeneCopoeia, Роквилл, штат Мэриленд, США) были использованы для построения RASSF4-люциферазы линии репортер клеток (NCI-N87 и SNU216 клетки) и пуромицин (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) был использован для выбора. Лентивирусов описано выше, использовали для индукции Atoh1. Люциферазы мероприятия были измерены с использованием секретируют-Pair Gaussia люциферазы Kit (GeneCopoeia, Роквилл, штат Мэриленд, США) в соответствии с инструкциями изготовителя в течение 72 ч после трансдукции.

ксенотрансплантата анализ
<р> Клетки разбавляют до соответствующая доза инъекции (1x10 6 клеток), смешивают с BD Матригель (BD Biosciences, Калифорния, США) в соотношении 1: 1, и вводили подкожно на спинной стороне каждого фланга в тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) мышей (п = 5 /группа). Для того, чтобы свести к минимуму экспериментальную изменчивость из-за индивидуальных различий в мышей-реципиентов, популяции клеток, которые должны были быть сравнены впрыскивали на противоположных флангах тех же животных. Опухоли собирали через 4 недели и массы опухолей были измерены. Для модели метастазов в печени мышей SCID анестезировали внутрибрюшинной инъекцией комбинации кетамин /ксилазин. Затем мыши были врезаны около 10 мм на левом подреберье, селезенка была подтверждена при брюшины, брюшины был открыт в течение приблизительно 8 мм и селезенка подвергалось над брюшины. Клетки (5х10 4 клеток /100 <ЕМ> мкл
) медленно вводили в селезенке мышей через 27-иглы (п = 5 /группа), а затем селезенка возвращали в брюшную полость , зашивают брюшину и рана. Через 4 недели после инокуляции клеток, мышей забивали [37]. Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, выданных Национальным институтом здравоохранения. Пусане национальный университет-Институциональная Уход за животными и использование комитета (ПНУ-IACUC) одобрила все экспериментальные процедуры, связанные с животными.

Пролиферация клеток для анализа
<р> Пять дней после трансдукции с лентивирусов, 10 мкл
предварительно смешанных водорастворимый соль тетразолия-1 (WST-1, Roche, Индианаполис, штат Индиана, США) добавляли в лунки. Затем эти клетки инкубировали в течение двух часов, и жизнеспособность клеток определяли путем измерения оптической плотности при 450 нм с использованием ELISA-ридер (Tecan, Mannedorf, Швейцария).

Сфера Анализ образования
<р> Шары диссоциируют в отдельные клетки и высевали в 96-луночные планшеты в 0,2 мл объемы сред. В каждую лунку 96-луночного планшета содержала менее 10 клеток. Клетки затем культивировали и контролироваться в течение 5-7 дней. Шары больше, чем 25 мкм, были подсчитаны с помощью инвертированного микроскопа и эффективность формирования сферы сравнивали.

Анализ данных
<р> непараметрический Манна-Уитни U-тест или Т-тест Стьюдента (непарный сравнения) были использованы для определения значимостей различий между средними значениями двух групп, и односторонний анализ дисперсии (ANOVA) с последующим множественных сравнений Тьюки был использован для определения значимостей различий между средними значениями трех или более групп , * Указывает значение P из < 0,05, считавшейся критерий значимости. Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения SPSS, версия 12.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Результаты представлены в виде средних значений ± ИКБ.

Результаты

Индукция Atoh1 во время дифференцировки GCSCs
<р> дифференциация GCSCs сывороткой было показано ранее [6]. Для выявления факторов, связанных с дифференциацией, мы сравнили экспрессию мРНК профили стволовых клеток и клеток в дифференцированных состояний клеточных РНК последовательности. Многие гены-супрессоры опухолей индуцировали во время дифференцировки (данные не показаны). Интересно отметить, что Atoh1, транскрипционный фактор критической для дифференцировки эпителиальных клеток кишечника, также индуцируется. Для подтверждения этой индукции Atoh1 во время дифференцировки, мы исследовали изменения в уровне экспрессии Atoh1 путем ПЦР в реальном времени и Вестерн-блоттинга. Мы нашли, как GCSCs подошел к терминальной стадии дифференцировки, экспрессия Atoh1 возрастала (рис.1).

Гиперэкспрессия Atoh1 индуцирует дифференциацию GCSCs
<р> Для определения роли Atoh1 во время GCSC дифференциации, мы гиперэкспрессия его в GCSCs с помощью лентивирус. Для проверки дифференциации статусы, мы исследовали уровни экспрессии различных маркеров для дифференциации или стволовости. Примечательно, что избыточная экспрессия Atoh1 в GCSCs увеличило уровень экспрессии различных маркеров дифференцировки, но снизились уровни экспрессии различных стволовости маркеров (рис 2).
<Р> Далее мы исследовали, может ли Atoh1 регулировать пролиферацию или формирование сферы. Интересно отметить, что избыточная экспрессия Atoh1 значительно снижает пролиферацию различных типов желудочных линий раковых клеток и формирование сферы путем GCSCs (рис 3).

Atoh1 избыточная экспрессия снижается В естественных условиях
туморогенность
<р> для того, чтобы определить, может ли Atoh1 регулировать в естественных условиях
туморогенности клеток рака желудка, мы использовали метастаз печени модель производится путем инъекции клеток рака желудка в селезенку (клетки впоследствии мигрировали в печень). Следует отметить, что избыточная экспрессия Atoh1 значительно снижает образование опухоли в печени путем GCSCs и NCI-N87 клеток рака желудка (рис.4). Более того, когда мы сделали подкожные ксенотрансплантаты, наблюдались аналогичные результаты (рис 4).

Atoh1 увеличил RASSF4 активность промотора
<р> Для того, чтобы подтвердить, является ли дифференциация GCSCs по Atoh1 опосредовано через его транскрипционной активности, мы исследовали активность промотора в целевом Atoh1 гена (RASSF4) с использованием люциферазы анализов [29]. После того, как промотор RASSF4, который был соединен с геном lucifease, стабильно введена в желудочную линиях раковых клеток (NCI-N87 и клетках SNU216), мы исследовали эффекты Atoh1 на активность люциферазы. Трансдукция Atoh1 значительно повысило активность люциферазы RASSF4 промотора. (Рис 5).

Участие апоптоза и клеточного цикла путей в эффектах Atoh1

Предыдущие отчеты сообщили апоптоз и клеточный цикл пути участвуют в эффектах Atoh1 на опухолях в сетчатке [30] и толстой кишки [25]. Таким образом, мы исследовали, являются ли также вовлечены родственные белки в воздействии Atoh1 на пролиферацию (Фиг.3А) и формирование сферы (фиг.3В), в настоящем исследовании. Изменение пролиферации и формирования сферы может быть связано с более медленным клеточного цикла, увеличение скорости апоптоза, или обоих.

Мы нашли трансдукции с Atoh1 повысился уровень расщепленного-каспазы-3 и каспазы-9- в GCSCs и клеточных линий рака желудка (рис 6), что свидетельствует о том, что внутренняя пути апоптоза могут быть вовлечены. Кроме того, мы также обнаружили, повышающей регуляции р21 при Atoh1 оверэкспрессии (рис 6).

Обсуждение
<р> В настоящем исследовании мы показали, что Atoh1, фактор транскрипции HLH, может индуцировать дифференцировку из GCSCs, и это приводит к потере туморогенности. Atoh1 суперэкспрессия было показано ранее, индуцирует дифференциацию кишечных стволовых клеток в секреторных клеток [24], а в Atoh1-нулевых мышей, секреторные клетки не были сгенерированы в кишечнике [26]. Этот эффект Atoh1 на дифференциации также наблюдалось в колоректального рака, в котором он выступал в качестве супрессора опухоли. Кроме того, примерно 70% от колоректального рака, его экспрессия, как сообщается, ущемляться генетических и эпигенетических механизмов [25,31]. В клеток колоректального рака, Atoh1 избыточная экспрессия снижается пролиферацию и рост в мягком агаре и ксенотрансплантатов [31], а также исключение Atoh1 усиливается туморогенности у мышей [25]. Эти результаты позволяют предположить, что в совокупности Atoh1 могут быть использованы в качестве дифференцировки терапии желудочно-кишечных раковых образований.
<Р> В отличие от его влияния на дифференциацию, Atoh1 может также способствовать пролиферации клеток-предшественников и образование опухолей. В процессе развития мозжечка мышей, Atoh1 было обнаружено, чтобы инициировать программу дифференцировки предшественников мозжечка гранула нейрон на ранней стадии (P0). Тем не менее, на более поздней стадии (P5), она способствует пролиферации предшественников [32,33,34]. Atoh1 удаление при P0, сильно тормозил дифференциацию, но его удаление на более позднем этапе привело к выходу из цикла и дифференцировки [35] клеток. Эти различные роли Atoh1 на разных этапах могут быть объяснены различными targetomes [35]. Atoh1 способствовало формированию медуллобластомой вместе с сигнальной ежа пути Shh [36,37]. Кроме того, его выражение было установлено, что значительно повышен в муцинозной аденокарциномы, перстневидно карциномы и кишечных нейроэндокринных опухолей [38]. Поэтому, чтобы иметь возможность использовать Atoh1 для дифференциации терапии, его непосредственные цели, которые индуцируют дифференцировку должны быть идентифицированы.
<Р> Хотя экспрессивные статусы Atoh1 были зарегистрированы в нормальной слизистой оболочке желудка и рака желудка, его роли являются плохо охарактеризованы. Atoh1 выражается в нормальных эпителиальных клеток желудка человека на низком уровне [39,40], но его экспрессия не наблюдалось в нормальных эпителиальных клеток желудка в желудке мыши [26]. Кроме того, мыши и метапластический слизистой оболочки желудка человека показали экспрессию Atoh1 [41], но его экспрессия не наблюдалась в желудочном линиях раковых клеток, в том числе MKN74, MKN45, KATOIII и HSC58 [40]. В некоторых больных раком желудка, он избыточно экспрессируется [39]. Его патофизиологические роли никогда не были изучены при раке желудка. В настоящем исследовании мы обнаружили, что индукция экспрессии Atoh1 может уменьшить пролиферацию, инвазию и туморогенности клеток рака желудка. Мы также нашли возможную причастность к р21 и пути апоптоза в эффектах Atoh1 в.
<Р> Наши наблюдения дают возможность предположить, что ген Atoh1 следует рассматривать как потенциальную мишень для лечения рака желудка. Малые молекулы, которые индуцируют его экспрессии или генной терапии с использованием вируса или стволовые клетки могут быть разработаны. В частности, было установлено, Atoh1 индуцировать дифференцировку желудочных раковых стволовых клеток, и, таким образом, терапевтические средства, направленные Atoh1 может быть в состоянии искоренить раковые стволовые клетки.

• PLoS ONE: Fas Signaling Содействует рак желудка метастазирования через STAT3-зависимой повышающей регуляции Fascin
• PLoS ONE: Nod1 и NOD2 генетические варианты в ассоциации с риском рака желудка и его прекурсоры в китайском Population