PLoS ONE: ATOH1 kan regulere tumorfremkaldende i Gastric Cancer Cells ved at inducere differentieringen af ​​Cancer Stem Cells

Abstrakt

Kræft stamceller (CSCS) har vist sig at mægle tumorgenicitet, kemo-modstand, radio-modstand og metastase, der antyder, at de betragtes som terapeutiske mål. Fordi deres differentierede datterceller ikke længere tumorigene, at inducere differentieringen af ​​CSCS kan være en af ​​strategier, som kan udrydde CSCS. Her viser vi, at ATOH1 kan inducere differentieringen af ​​gastriske cancer stamceller (GCSCs). Real time PCR og western blot analyse viste, at ATOH1 blev induceret under differentieringen af ​​GCSCs. Endvidere lentivirus-induceret overekspression af ATOH1 i GCSCs og gastrisk cancer cellelinjer signifikant induceret differentiering, reduceret proliferation og kugle-dannelse og reduceret in vivo
tumordannelse i subkutan injektion og levermetastaser xenograftmodeller. Disse resultater tyder ATOH1 overvejes for udviklingen af ​​en differentiering terapi for mavekræft

Henvisning:. Han ME, Baek SJ, Kim SY, Kang CD, Oh SO (2015) ATOH1 kan regulere tumorfremkaldende i Gastric Cancer Celler ved at inducere Differentiering af kræft stamceller. PLoS ONE 10 (5): e0126085. doi: 10,1371 /journal.pone.0126085

Academic Redaktør: Gianpaolo Papaccio, Napolis andet universitet, ITALIEN

Modtaget: 3. september 2014 Accepteret: 30 marts 2015; Udgivet: 7. maj 2015

Copyright: © 2015 Han et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret undtagen RNA sekventering data, som blev deponeret på det offentlige arkiv. (GEO tiltrædelse Nummer: GSE46597)

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af Bio og Medicinsk Teknologi Development Program (2012M3A9C6050213) og Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) af National Research Foundation (NRF) finansieret af den koreanske regering (MEST), og en bevilling fra National R &D Program for Cancer Control Ministeriet for sundhed, velfærd og familiespørgsmål, Republikken Korea (0.920.050) . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Efter cancer stamceller (CSCS) oprindeligt blev isoleret fra leukæmipatienter, var de blevet isoleret fra mange cancertyper, herunder mavekræft [1,2,3,4,5,6]. CSCS er blevet foreslået at være et terapeutisk mål, fordi de kan mægle tumorgenicitet, kemo-modstand, radio-modstand og metastase [7,8,9]. Konventionelle anti-cancer terapi primært med målsætningen prolifererende ikke-CSCS, hvilket forklarer den hyppige gentagelse af kræft [9]. Den dårlige prognose for patienter med større CSC befolkning, fremmer også udviklingen af ​​lægemidler, der er målrettet CSCS [10].

En af karakteristika CSCS er, at de kan differentiere til datterceller, som ikke længere tumorigen, for eksempel , CSCS fra kolon og mavekræft er blevet tilskyndet til at differentiere ved serum [5,6]. Det betyder, at CSC hypotesen fundamentalt forskellig fra den traditionelle klonal ekspansion hypotese. Endvidere kan den hierarkiske relation mellem CSCS og deres datterceller forklares ved epigenetiske mekanismer, der kan anvendes til normale stamceller [11,12]. Desuden kan mikromiljøet påvirke differentieringen af ​​CSCS [13], og dette kendetegn kan udnyttes til udvikling af terapeutiske midler.

Derfor induktionen af ​​differentiering er en strategi, der kan anvendes til at udrydde CSCS. Epigenetiske regulatorer er blevet foreslået at inducere deres differentiering, fx histon deacetylase (HDAC) inhibitorer er blevet vist at inducere differentiering af CSCS i leukæmi, der blev forårsaget af fusionsproteiner, såsom, AML1-ETO og PML-RARa [14,15 ]. Endvidere kan all-trans-retinsyre (ATRA) inducerer differentiering af CSCS i akut promyelocytisk leukæmi (APL) via C /EBP faktorer [16,17], vildtype transkriptionsfaktorer, såsom C /EBPα, kan induceret differentiering i humane AML og lungekræft-cellelinjer og i mus in vivo
modeller [17,18,19,20]. I gastrisk cancer, er suramin blevet vist at inducere differentiering af humane gastriske cancercellelinier [21].

ATOH1 er en grundlæggende helix-loop-helix (bHLH) transcription faktor homolog med Drosophila atonal [22]. Det aktiverer E box-afhængig transskription i samarbejde med E47 [23]. HES1, et molekyle i Notch-signalvejen, kan inhibere dets ekspression [24]. Knock-out mus har vist, at ATOH1 spiller kritiske roller i dannelsen af ​​cerebellare granulneuroner neuroner, indre øre-hårceller, rygmarv interneuroner, Merkel celler i huden og intestinale sekretoriske celler [25]. Interessant, har ATOH1 været forbundet med forskellige former for kræft, herunder tyktarmskræft [25].

Til udvikling af en ny differentiering terapi i mavekræft, vi analyserede udtryk ændringer på mRNA-niveauer under differentieringen af ​​gastrisk stilk kræft celler (GCSCs). Det blev konstateret, at under differentieringen af ​​GCSCs, ekspressionsniveauet af ATOH1, hvilket er vigtigt for differentieringen af ​​intestinale epitelceller [26,27], blev signifikant forøget. Desuden induktionen af ​​ATOH1 i gastrisk cancer cellelinjer og i GCSCs betydeligt reduceret deres tumorigenicitet i subkutan injektion og levermetastaser modeller

Materialer &.; Metoder

mavekræft stamcellekulturer

mavekræft væv blev hentet efter at have indhentet skriftligt informeret samtykke fra patienter, der gennemgik kirurgisk resektion ved Pusan ​​National University Hospital (PNUH) og Pusan ​​National University Yangsan Hospital (PNUYH ). Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af Pusan ​​Rigshospitalet-Institutional Review Board (PNUH-IRB) og Pusan ​​Nationale Universitet Yangsan Hospital-Institutional Review Board (PNUYH-IRB). Gastrisk cancer stamceller blev dyrket som tidligere beskrevet [6], og blev induceret til at differentiere ved tilsætning af 5% FCS til medier i stedet for vækstfaktorer.

Kultur af gastrisk cancer cellelinjer

mavekræft celler (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, NCI-N87) blev dyrket i RPMI1640 tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 ug
/ml penicillin /streptomycin ved 37 ° C i en CO 5% _{2 befugtet inkubator. Disse cellelinier blev opnået fra koreansk cellelinje Bank (Seoul, Korea).}

Culture of 293FT cellelinie

293FT celler blev opretholdt i DMEM suppleret med 10% kalvefosterserum og 0,1 mM MEM ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 1 mM MEM natriumpyruvat (begge fra Sigma, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 6 mM L-glutamin (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), og 1% Pen-Strep i en CO 5% _{2 befugtet inkubator.}

RNA-sekventering og dataanalyse

Library blev fremstillet under anvendelse af IlluminaTruSeq RNA Sample Prep Kit og sekventeret ved anvendelse af Illumina Genome Analyzer IIx (San Diego, CA, USA) til at generere 76 bp parret ende læser. Sekventeret læser blev rettet ind på en menneskelig henvisning genom 19 ved hjælp Tophat 2 [PubMed id 19.289.445]. mRNA-ekspression blev målt som RPKM (Læser Per kb pr Million kortlagt læser) fra entydigt kortlagt læser ved hjælp af en hg19 RefSeq model og HTSeq pakken (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/). Bed filer blev fremstillet ved hjælp af Tophat 2. Alle RNA sekventering data blev deponeret på det offentlige arkiv (GEO Tiltrædelse Nummer: GSE46597)

Fast time PCR

Udvinding af RNA og real time PCR blev udført. ved anvendelse af en Power SYBR Green PCR Master Mix og en ABI Prism 7500-sekvens detektor (begge fra Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), som tidligere beskrevet [28]. Primersekvenserne anvendt (fremad og tilbage, henholdsvis) var som følger: differentieringsmarkører; CA1, 5'TCA GAG CAG CTG GCA CAA TTC CG -3 'og 5'FTT TCA GAG GTT GGG TTG GGC G -3 « SSTR2, 5'CCA GGA ACC CCA AAC GTC CG -3 'og 5'CAG TGT GAC ATC TTT GCT TTT CCG C -3 « CHGA, 5'GCA AAC CGC AGA CCA GAG GAC C -3 'og 5'TGT CTC AGC CCC GCC GTA GT -3 « PGC2, 5'TGG FTT ACC CTG CTC TGT CCG -3 'og 5'ACT CCA GGA CCA GGT TGC TGA GG -3 « MUC5AC, 5'TCA CAC GGT FTT GCC CAC AGA G -3 'og 5'ACC FTT GCA TCT CAG AGC CCC -3 « ATP4B, 5'GAA AGC CCA GCC CCA CTA CAG C -3 'og 5'TGC TCC GCC ATG ACC TTG CAC -3 « Stemness markører; CD44, 5'GCC TGG GGA CTC TGC CTC GT-3 'og 5'AGC CTT GCA GAG GTC AGC GG-3'; LGR5, 5'GAG CTG FTT TCC AAC CTC AG -3 'og 5'CCC GCA AGA CGT AAC TCC TC -3 « BMI1, 5'TGG TTG CCC ATT GAC AGC GG -3 'og 5'AAA AAT CCC GGA AAG AGC AGC CG -3 « og c-myc, 5'ACA CCC GAG CAA GGA CGC GA -3 "og 5'CGC GGG AGG CTG CTG GTT TTC -3« ATOH1, 5'CCC CTT CCA GCA AAC AGG TG -3 'og 5'ACG GGA TAA CAT TGC GCA GC -3 « GAPDH 5'GAG TCC ACT GGC GTC TTC AC -3 'og 5'ATG ACG AAC ATG GGG GCA TC -3 ". GAPDH blev brugt til at standardisere cDNA input niveauer

Western blot-analyse

Western blot-analyse blev udført som beskrevet tidligere [24], ved hjælp af følgende antistoffer:. ATOH1 (LSBio, Seattle, WA, USA ); CD44, LGR5, ATP4B, CA1, PGC, MUC5AC (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA); c-Myc, caspase-3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA); spaltet caspase-3, caspase-9, kløvet caspase-9 (Cell Signaling Technology, MA, USA); p21, β-actin-antistof (Abcam, Cambridge, MA, USA) og HRP-konjugeret sekundært antistof (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA).

Lentivirale konstruktioner og dannelsen af ​​aktive virus

For at oprette et udtryk klon, sekvens verificeret viral ORF Kloner (ATOH1, IOH34744; Life Technologies, Grand Island, NY) i Gateway entry vektorer blev overført til pLenti7.3-DEST vektor (pLenti7.3/V5-DEST Gateway Vector Kit, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) under anvendelse af en LR rekombinationsreaktion (LR Clonase II enzymblanding, Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Til transformation blev One Shot Stbl3 Kompetent E. coli (Life Technologies), der anvendes. Efter cotransfektion af ekspressionen klonen og ViraPower Packaging Mix (Life Technologies) ind i 293FT Cell Line (Life Technologies) til frembringelse af lentivirus blev lentiviral supernatanter høstet. Disse lentivirale lagrene blev anvendt til at transducere GCSCs og gastriske cancercellelinjer.

Virus indsamling og opformering blev udført ifølge producentens instruktioner (Life Technologies). Den kontrol virus blev genereret parallelt uden inddragelse af ATOH1.

Konstruktion af RASSF4-reporter cellelinjer og luciferaseanalyse

Gluc-ON Promotor Reporter Kloner, pEZX-PG02 (HPRM11834-PG02 , GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) blev anvendt til konstruktion RASSF4-luciferase reporter cellelinjer (NCI-N87 og SNU216 celler) og puromycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) blev anvendt til selektion. Den ovenfor beskrevne lentivirus blev anvendt til at inducere ATOH1. Luciferaseaktiviteter blev målt under anvendelse Secréte-Pair Gaussia Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) i overensstemmelse med producentens instruktioner ved 72 timer efter transduktion.

xenograft assay

Celler blev fortyndet til en passende injektion dosis (1x10 ^{6 celler), blandet med BD Matrigel (BD Biosciences, CA, USA) ved en 1: 1-forhold, og injiceret subkutant på den dorsale side af hver flanke i svær kombineret immundefekt (SCID) mus (n = 5 /gruppe). For at minimere eksperimentel variabilitet på grund af individuelle forskelle i recipientmus blev cellepopulationer, der skulle sammenlignes injiceret på modstående flanker på de samme dyr. Tumorer blev høstet efter 4 uger og tumorvægte blev målt. For levermetastaser model blev SCID-mus bedøvet med en intraperitoneal injektion af ketamin /xylazin kombination. Derefter blev musene indsnit omkring 10 mm til venstre subcostal blev milten bekræftet under bughinden, blev peritoneum blev åbnet for omkring 8 mm, og milten blev eksponeret over peritoneum. Cellerne (5x10 4 celler /100 pi
) blev langsomt injiceret i milten af ​​mus via en 27-gauge nål (n = 5 /gruppe) og derefter milten blev returneret til bughulen , peritoneum og såret blev sutureret. 4 uger efter inokulation med celler blev musene aflivet [37]. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr udstedt af National Institute of Health. Pusan ​​Nationale Universitet-Institutional Animal Care og brug Udvalg (PNU-IACUC) godkendte alle eksperimentelle procedurer, der involverer dyr.}

Cell proliferation assay

Fem dage efter transduktion med lentivirus, 10 pi
fra forblandet vandopløseligt tetrazoliumsalt-1 (WST-1, Roche, Indianapolis, IN, USA) blev tilsat til brøndene. Disse celler blev derefter inkuberet i to timer og cellelevedygtigheden blev bestemt ved måling af absorbans ved 450 nm med en ELISA-læser (TECAN, Mannedorf, Schweiz).

Sphere formation assay

sfærer blev dissocieret til enkelte celler og udpladet i 96-brønds plader i 0,2 ml volumener medier. Hver brønd i 96-brønds plade indeholdt mindre end 10 celler. Celler blev derefter dyrket og overvåges i 5-7 dage. Spheres større end 25 um blev talt ved hjælp af omvendt mikroskop og effektiviteten af ​​kugle dannelse blev sammenlignet.

Dataanalyse

parametrisk Mann-Whitney U-testen eller t-test (uparret sammenligninger) blev anvendt til at bestemme de betydninger af forskelle mellem middelværdier for to grupper og envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukeys multiple sammenligninger blev anvendt til bestemmelse betydningerne af forskelle mellem middelværdier af tre eller flere grupper . * Angiver en P-værdi på < 0,05, som blev betragtet betydningen kriterium. Data blev analyseret under anvendelse af SPSS software version 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Resultaterne er præsenteret som betyder ± SDS.

Resultater

Induktion af ATOH1 under differentieringen af ​​GCSCs

Differentieringen af ​​GCSCs ved serum tidligere er blevet påvist [6]. For at identificere faktorer i forbindelse med differentiering, sammenlignede vi mRNA-ekspression profiler af stamceller og celler i differentierede celletilstande ved RNA-sekventering. Mange tumorsuppressorgener blev induceret under differentiering (data ikke vist). Interessant, ATOH1, en transkriptionsfaktor kritisk for differentieringen af ​​intestinale epitelceller, blev også induceret. For at bekræfte denne induktion af ATOH1 under differentiering, undersøgte vi ændringer i ekspressionsniveauet af ATOH1 af real time PCR og western blot-analyse. Vi fandt som GCSCs nærmede terminal stadier af differentiering, udtryk for ATOH1 steget (figur 1).

Overekspression af ATOH1 inducerede differentieringen af ​​GCSCs

For at bestemme rollerne for ATOH1 under GCSC differentiering, vi overudtrykt det i GCSCs hjælp lentivirus. For at kontrollere differentiering statusser undersøgte vi ekspressionsniveauerne af forskellige markører for differentiering eller stemness. Især overekspressionen af ​​ATOH1 i GCSCs forøgede ekspressionsniveauet af forskellige differentieringsmarkører, men faldt ekspressionsniveauerne af forskellige stemness markører (Fig 2).

Næste det undersøgt om ATOH1 kan regulere proliferation eller kugle formation. Interessant, overekspression af ATOH1 faldt betydeligt de proliferationer af forskellige typer af gastrisk kræft cellelinjer og sfære dannelse ved GCSCs (Fig 3).

ATOH1 overekspression reduceret in vivo
tumorgenicitet

for at afgøre, om ATOH1 kan regulere in vivo
tumorgenicitet af gastrisk kræftceller, vi brugte en levermetastaser model produceret ved at indsprøjte gastriske kræftceller i milten (celler senere migreret til leveren). Især overekspressionen af ​​ATOH1 signifikant reduceret tumordannelse i leveren ved GCSCs og af NCI-N87 gastriske cancerceller (Fig 4). Desuden, når vi gjort subkutane xenotransplantater blev lignende resultater observeret (figur 4).

ATOH1 øget RASSF4 promoter aktivitet

For at bekræfte, om differentiering af GCSCs ved ATOH1 medieres gennem sin transkriptionsaktivitet, undersøgte vi promotoraktiviteten af ​​en ATOH1 målgen (RASSF4) under anvendelse luciferaseassays [29]. Efter RASSF4 promotoren, som blev koblet med lucifease genet, blev stabilt indført i mavens cancercellelinier (NCI-N87 og SNU216 celler), undersøgte vi virkningen af ​​ATOH1 på aktiviteten af ​​luciferase. Transduktion med ATOH1 steget betydeligt luciferaseaktiviteten af ​​RASSF4 promotoren. (Figur 5).

Inddragelse af apoptose og cellecyklus veje i virkningerne af ATOH1

Tidligere rapporter har rapporteret apoptose og cellecyklus veje er involveret i virkningerne af ATOH1 på tumorer i nethinden [30] og colon [25]. Så vi undersøgt, om beslægtede proteiner også er involveret i virkningerne af ATOH1 på proliferation (Fig 3A) og sfære dannelse (figur 3B) i nærværende undersøgelse. Ændringen i proliferation og sfære dannelse kan skyldes en langsommere cellecyklus, en forøget apoptotisk sats, eller begge dele.

Vi fandt transduktion med ATOH1 øget niveau af spaltet-caspase-3 og caspase-9- i GCSCs og gastrisk cancer cellelinjer (Fig 6), hvilket antyder, at den intrinsiske apoptose pathway kan være involveret. Desuden har vi også fundet opregulering af p21 på ATOH1 overekspression (figur 6).

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, viser vi, at ATOH1, et HLH transskription faktor, kan inducere differentiering af GCSCs, og dette fører til et tab af tumorgenicitet. ATOH1 overekspression er tidligere blevet vist at inducere differentieringen af ​​intestinale stamceller til sekretoriske celler [24], og i ATOH1-nul-mus blev sekretoriske celler ikke genereret i tarmen [26]. Denne effekt af ATOH1 på differentiering er også blevet observeret i kolorektal cancer celler, hvor den fungerede som en tumor suppressor. Desuden i ca. 70% af tarmkræft, har sit udtryk blevet rapporteret, at blive formindsket ved genetiske og epigenetiske mekanismer [25,31]. I kolorektal kræftceller, ATOH1 overekspression reduceret spredning og vækst i blød agar og xenografter [31], og sletning af ATOH1 forbedret tumorgenicitet i mus [25]. Disse resultater tilsammen antyder, at ATOH1 kan anvendes som en differentiering terapi for gastrointestinale cancere.

I modsætning til dets virkning på differentiering, ATOH1 kan også fremme proliferation af progenitorceller og tumordannelse. Under cerebellar udvikling af mus, blev ATOH1 fundet at indlede differentiering program af cerebellare granula neuron forstadier på et tidligt tidspunkt (P0). Men på et senere tidspunkt (P5), det fremmet udbredelsen af ​​forstadier [32,33,34]. ATOH1 sletning ved P0, hæmmet kraftigt differentiering, men sletning på et senere tidspunkt resulterede i exit fra cellecyklus og differentiering [35]. Disse forskellige roller ATOH1 på forskellige stadier kan forklares ved forskellige targetomes [35]. ATOH1 fremmes medulloblastom dannelse sammen med Shh pindsvinesignaleringsvejen [36,37]. Desuden blev sit udtryk fundet, at være signifikant forhøjede i mucinous adenocarcinom, signetring karcinom, og tarm neuroendokrine tumorer [38]. Derfor, for at være i stand til at udnytte ATOH1 for differentiering terapi, dens direkte mål, der inducerer differentiering skal identificeres.

Selvom udtryksmæssige status for ATOH1 er blevet rapporteret i normal gastrisk mucosa og i gastrisk kræft, dens roller er dårligt karakteriseret. ATOH1 udtrykkes i normale humane gastriske epitelceller ved lave niveauer [39,40], men dets ekspression blev ikke observeret i normale gastriske epitelceller i musen maven [26]. Desuden, mus og menneske metaplastisk gastrisk mucosa viste ATOH1 udtryk [41], men dens udtryk blev ikke observeret i gastrisk cancer cellelinjer, herunder MKN74, MKN45, KATOIII, og HSC58 [40]. I nogle mavecancerpatienter, er det overudtrykkes [39]. Dens patofysiologiske roller er aldrig blevet udforsket i mavekræft. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at induktion af ATOH1 ekspression kan reducere proliferation, invasion, og tumorgenicitet af gastriske cancerceller. Vi fandt også mulig inddragelse af p21 og apoptose pathway i ATOH1 virkninger.

Vores observationer tyder muligheden for, at ATOH1 gen skal ses som potentielt mål for mavekræft behandling. Små molekyler, der inducerer dets ekspression eller genterapi under anvendelse virus eller stamceller kan udvikles. Især blev ATOH1 sig at inducere differentieringen af ​​gastriske cancer stamceller og dermed, terapeutiske midler rettet mod ATOH1 kan være i stand til at udrydde cancer stamceller.

• PLoS ONE: Fas Signaling Fremmer Gastric Cancer Metastase gennem STAT3-Dependent opregulering af Fascin
• PLoS ONE: NOD1 og NOD2 genetiske varianter i Foreningen med risiko for mavekræft og dens forstadier i en kinesisk Befolkning