Krebsstammzellen (KSZ) wurden tumorigenicity zu vermitteln gezeigt, Chemo-Resistenz, Radio-Widerstand und Metastasen, die sie therapeutische Ziele in Betracht gezogen werden vorschlagen. Weil ihre differenzierte Tochterzellen nicht mehr tumorigenen sind, kann die Differenzierung von CSCs zu induzieren eine der Strategien sein, die CSCs ausrotten können. Hier zeigen wir, dass ATOH1 die Differenzierung von Magen-Krebs-Stammzellen induzieren können (GCSCs). Echtzeit-PCR und Western-Blot-Analyse zeigte, dass ATOH1 während der Differenzierung von GCSCs induziert wurde. Darüber hinaus ist die Lentivirus-induzierte Überexpression von ATOH1 in GCSCs und bei Magenkrebs-Zelllinien signifikant induzierte Differenzierung, reduzierte Proliferation und Kugelbildung und reduziert in vivo Citation:. Han ME, Baek SJ, Kim SY, Kang CD, Oh SO (2015) ATOH1 Kann die Tumorigenität von Magenkrebs Regulate Zellen, die durch die Differenzierung von Krebsstammzellen zu induzieren. PLoS ONE 10 (5): e0126085. doi: 10.1371 /journal.pone.0126085 Academic Editor: Gianpaolo Papaccio, Zweite Universität von Neapel, Italien in Empfangen: 3. September 2014; Akzeptiert: 30. März 2015; Veröffentlicht: May 7, 2015 Copyright: © 2015 Han et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind in der Papier außer RNA-Sequenzierungsdaten, die in der öffentlichen Repository hinterlegt wurden. (GEO-Zugangsnummer: GSE46597) die Finanzierung: Diese Arbeit wurde von der Bio- und Medizintechnik Development Program (2012M3A9C6050213) und Basic Science Research unterstützt Foundation (2012R1A1A3010521) der National Research Foundation (NRF) von der koreanischen Regierung finanziert (MEST) und einen Zuschuss von der National R & D-Programm für Cancer Control, Ministerium für Gesundheit, Soziales und Familie, der Republik Korea (0.920.050) . Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen Einführung Nach Krebsstammzellen (KSZ), die ursprünglich von Leukämie-Patienten isoliert wurden, waren sie von vielen Krebsarten isoliert worden, einschließlich Magenkrebs [1,2,3,4,5,6]. CSCs haben ein therapeutisches Ziel sein vorgeschlagen, weil sie tumorigenicity vermitteln kann, Chemo-Resistenz, Radio-Widerstand und Metastasierung [7,8,9]. Herkömmliche Anti-Krebs-Therapie in erster Linie Targets wuchernden nicht CSCs, die die häufige Wiederauftreten von Krebs erklärt [9]. Die schlechte Prognose von Patienten mit größeren CSC Bevölkerung, fördert auch die Entwicklung von Therapeutika, die CSCs Ziel [10]. Eines der Merkmale von CSCs ist, dass sie in Tochterzellen differenzieren können, die nicht mehr tumorigenen, zum Beispiel , CSCs von Dickdarm- und Magenkrebs wurden von Serum [5,6] zu unterscheiden induziert. Dies bedeutet, der CSC Hypothese grundlegend von der herkömmlichen Hypothese klonalen Expansion unterscheidet. Weiterhin kann die hierarchische Beziehung zwischen KSZ und ihre Tochterzellen durch epigenetische Mechanismen erklärt werden, die normalen Stammzellen angewendet werden können, [11,12]. Darüber hinaus kann die Mikroumgebung, die Differenzierung des CSCS beeinflussen [13], und die Eigenschaften können für die Entwicklung von Therapeutika ausgenutzt werden. Dementsprechend ist die Induktion der Differenzierung ist eine Strategie, die verwendet werden können CSCs auszurotten. Epigenetische Regulatoren vorgeschlagen worden, ihre Differenzierung zu induzieren, beispielsweise Histon-Deacetylase (HDAC) -Inhibitoren wurden Differenzierung des CSCS in Leukämie zu induzieren, die durch Fusionsproteine verursacht wurden, wie AML1-ETO und PML-RAR &agr; [14,15 ]. Weiterhin all-trans-Retinsäure (ATRA) können in akuter Promyelozytenleukämie (APL) über C /EBP Faktoren [16,17], Wildtyp-Transkriptionsfaktoren wie C /EBP &agr kann induzierte Differenzierung in menschlichen Differenzierung des CSCS induzieren AML und in Lungenkrebs-Zelllinien und in Maus in vivo ATOH1 ein Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktoren (bHLH) Transkriptionsfaktors homolog zu der Drosophila atonal [22]. Es aktiviert E-Box-abhängige Transkription in Zusammenarbeit mit E47 [23]. HES1, ein Molekül in Notch-Signalweg kann seine Expression [24] hemmen. Knock-out-Maus-Studien haben gezeigt, dass ATOH1 spielt eine entscheidende Rolle bei der Erzeugung von zerebellären Körnerzellen, inneren Haarzellen, Rückenmark Inter, Merkel-Zellen in der Haut und Darm-sekretorischen Zellen [25]. Interessanterweise hat ATOH1 mit verschiedenen Arten von Krebs einschließlich Darmkrebs in Verbindung gebracht worden [25]. Zur Entwicklung einer neuen Differenzierung Therapie bei Magenkrebs, analysierten wir die Expression Änderungen an den mRNA-Spiegel während der Differenzierung von Magenkrebsstammzellen Zellen (GCSCs). Es wurde, dass während der Differenzierung von GCSCs, das Expressionsniveau von ATOH1 gefunden, die für die Differenzierung von intestinalen Epithelzellen wichtig ist [26,27], wurde deutlich erhöht. Darüber hinaus reduziert die Induktion von ATOH1 bei Magenkrebs-Zelllinien und GCSCs signifikant ihre Tumorigenität im subkutanen Injektion und Lebermetastasen Modelle Materials &. Methoden Magenkrebs Stammzellkulturen Magenkrebsgewebe wurden nach Erhalt schriftlicher Einwilligung von Patienten abgerufen, die chirurgische Resektion bei Pusan National University Hospital (PNUH) und Pusan National University Yangsan Hospital (PNUYH unterzog ). Das Studienprotokoll wurde von Pusan National University Hospital-Institutional Review Board (PNUH-IRB) und Pusan National University Yangsan Krankenhaus-Institutional Review Board (PNUYH-IRB) genehmigt. Magenkrebsstammzellen wurden kultiviert, wie zuvor beschrieben [6] und wurden durch Zugabe von 5% FCS auf Medien Faktoren statt Wachstum zu unterscheiden induziert. Magenkrebs Zellen (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, NCI-N87) wurden in RPMI1640, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 100 ug 293FT-Zellen wurden in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum gehalten und 0,1 mM MEM nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 1 mM MEM Natriumpyruvat (beide von Sigma, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 6 mM L-Glutamin (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), und 1% Pen-Strep in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. RNA-Sequenzierung und Datenanalyse in der Bibliothek wurde nach dem IlluminaTruSeq RNA Probenvorbereitung Kit und sequenziert unter Verwendung des Illumina Genome Analyzer IIx (San Diego, CA, USA) zu erzeugen 76 bp paarigen Ende liest. Sequenced liest wurden auf einem menschlichen Referenzgenom 19 ausgerichtet Tophat 2 [pubmed ID 19289445] verwenden. mRNA-Expression wurde als RPKM gemessen (Liest pro Kilobasen pro Million abgebildet liest) von eindeutig abgebildet liest mit Hilfe eines hg19 RefSeq-Modell und das HTSeq Paket (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/). Bed Dateien wurden mit Tophat produziert 2. Alle RNA-Sequenzierungsdaten im öffentlichen Repository hinterlegt wurden (GEO-Zugangsnummer: GSE46597) Echtzeit-PCR- Die Extraktion von RNA und real time PCR getragen wurden. aus ein Power SYBR Green PCR Master Mix verwendet und mit einem ABI Prism 7500 Sequenzdetektor (beide von Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), wie zuvor beschrieben [28]. Die verwendeten Primersequenzen (vorwärts und rückwärts, jeweils) waren wie folgt: Differenzierungsmarker; CA1, 5 'TCA GAG CAG CTG GCA CAA TTC CG-3' und 5 'CCT TCA GAG GTT GGG TTG GGC G-3'; SSTR2, 5 'CCA GGA ACC CCA AAC GTC CG-3' und 5 'CAG TGT GAC ATC TTT GCT TTT CCG C-3'; CHGA, 5 'GCA AAC CGC AGA CCA GAG GAC C-3' und 5 'TGT CTC AGC CCC GCC GTA GT-3'; PGC2, 5 'TGG CCT ACC CTG CTC TGT CCG-3' und 5 'ACT CCA GGA CCA GGT TGC TGA GG-3'; MUC5AC, 5 'TCA CAC GGT CCT GCC CAC AGA G-3' und 5 'ACC CCT GCA TCT CAG AGC CCC-3'; ATP4B, 5 'GAA AGC CCA GCC CCA CTA CAG C-3' und 5 'TGC TCC GCC ATG ACC TTG CAC -3'; Stemness Marker; CD44, 5 'GCC TGG GGA CTC CTC TGC GT-3' und 5 'AGC CTT GCA GAG GTC AGC GG -3'; LGR5, 5 'GAG CTG CCT TCC AAC CTC AG 3' und 5 'CCC GCA AGA CGT AAC TCC TC-3'; BMI1, 5 'TGG TTG CCC ATT GAC AGC GG-3' und 5 'AAA AAT CCC GGA AAG AGC AGC CG-3'; und c-Myc, 5 'ACA CCC GAG CAA GGA CGC GA-3' und 5 'CGC GGG AGG CTG CTG GTT TTC -3'; ATOH1, 5 'CCC CTT CCA GCA AAC AGG TG-3' und 5'-ACG GGA TAA CAT TGC GCA GC-3 '; GAPDH 5 'GAG TCC ACT GGC GTC TTC AC-3' und 5 'ATG ACG AAC ATG GGG GCA TC-3'. GAPDH wurde verwendet, um cDNA Eingangspegel zu standardisieren Western-Blot-Analyse Western-Blot-Analyse wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [24], mit den folgenden Antikörpern:. ATOH1 (LSBio, Seattle, WA, USA ); CD44, LGR5, ATP4B, CA1, PGC, MUC5AC (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA); c-Myc, Caspase-3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA); gespalten Caspase-3, Caspase-9, Caspase-9 gespalten (Cell Signaling Technology, MA, USA); p21, β-Actin-Antikörper (Abcam, Cambridge, MA, USA) und HRP-konjugierten sekundären Antikörper (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, USA). Lentivirale Konstrukte und die Erzeugung von aktiven Virus einen Ausdruck Klon zu erstellen, Sequenz viralen ORF Klone verifiziert (ATOH1, IOH34744, Life Technologies, Grand Island, NY) in Gateway-Eintrag Vektoren wurden in pLenti7.3-DEST-Vektor (pLenti7.3/V5-DEST-Gateway übertragen Vector Kit, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) unter Verwendung eines LR-Rekombinationsreaktion (LR Clonase II-Enzym-Mix, Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Für die Transformation verwendet wurde, One Shot Stbl3 Kompetente E. coli (Life Technologies). Nach Ko-Transfektion des Expressions klonieren und die ViraPower Verpackungs Mix (Life Technologies) in die 293FT Zelllinie (Life Technologies) Lentivirus, lentivirale Überstände wurden geerntet herzustellen. Diese lentiviralen Bestände wurden verwendet, um GCSCs und Magenkrebs-Zelllinien zu transduzieren. Virensammlung und Vermehrung wurden durchgeführt, gemäß den Anweisungen des Herstellers (Life Technologies). Das Kontrollvirus wurde parallel ohne die Einbeziehung von ATOH1 erzeugt. Der Gluc-ON Promoter Reporter Clones, pEZX-PG02 (HPRM11834-PG02 , GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) wurden verwendet RASSF4-Luciferase-Reporterzelllinien (NCI-N87 und SNU216 Zellen) und Puromycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) wurde für die Selektion zu konstruieren, verwendet. Die Lentivirus oben beschrieben wurde verwendet ATOH1 zu induzieren. mit Secrete-Pair Gaussia Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers bei 72 h nach Transduktion Luziferase-Aktivitäten wurden gemessen. Xenograft-Test Die Zellen wurden verdünnt eine geeignete Injektionsdosis (1x10 6 Zellen), gemischt mit BD Matrigel (BD Biosciences, CA, USA) in einem Verhältnis 1: 1, und subkutan injiziert auf der Rückenseite jeder Flanke in Severe Combined Immunodeficiency (SCID) Mäusen (n = 5 /Gruppe). Experimentelle Variabilität minimiert aufgrund der individuellen Unterschiede in Empfängermäuse, Zellpopulationen, die verglichen werden sollten, wurden auf den gegenüberliegenden Flanken der gleichen Tiere injiziert. Tumoren wurden geerntet nach 4 Wochen und Tumorgewichte wurden gemessen. Für die Lebermetastasen Modell wurden SCID-Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin /Xylazin Kombination narkotisiert. Dann wurden die Mäuse etwa 10 mm auf der linken subcostal eingeschnitten wurde die Milz unter dem Peritoneum bestätigt wurde das Peritoneum für etwa 8 mm und die Milz geöffnet wurde über das Peritoneum ausgesetzt. Die Zellen (5x10 4 Zellen /100 ul Fünf Tage nach der Transduktion mit Lentiviren, 10 ul Spheres wurden distanzierte in Einzelzellen und in Platten mit 96 Vertiefungen in 0,2 ml Volumina von Medien ausplattiert. Jede Vertiefung der 96-Well-Platte enthielt weniger als 10 Zellen. Die Zellen wurden dann kultiviert und überwacht für 5-7 Tage. Kugeln größer als 25 &mgr; m wurden unter Verwendung des inversen Mikroskops und die Effizienz der Kugelbildung verglichen wurde gezählt. Die nichtparametrischer Mann-Whitney-U-Test oder der t-Tests von Student (ungepaarten Vergleiche) wurden verwendet, um die Signifikanzen der Unterschiede zwischen den Mittelwerten der beiden Gruppen, und eine Einweganalyse der Varianz (ANOVA) gefolgt von Tukey multiple Vergleiche die Signifikanzen der Unterschiede zwischen den Mittelwerten von drei oder mehr Gruppen zu bestimmen, wurde zur Bestimmung verwendet, . * Zeigt einen P-Wert von < 0,05, was die Bedeutung Kriterium angesehen wurde. Die Daten wurden mit SPSS-Software analysiert, Version 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Die dargestellten Ergebnisse sind als ± SDs bedeutet.
Tumorbildung in der subkutanen Injektion und Lebermetastasen Xenotransplantatmodellen. Diese Ergebnisse legen nahe ATOH1 für die Entwicklung einer Differenzierung Therapie für Magenkrebs in Betracht gezogen werden
Modelle [17,18,19,20]. In Magenkrebs ist Suramin wurde Differenzierung von menschlichen Magenkrebszelllinien induzieren [21].
Kultur von Magenkrebs-Zelllinien
/ml Penicillin /Streptomycin bei 37 ° C in 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. Diese Zelllinien wurden von koreanischen Zelllinie Bank (Seoul, Korea) erhalten.
Kultur von 293FT Zelllinie
Bau von RASSF4-Reporterzelllinien und Luciferase-Assay
) langsam in die Milz von Mäusen injiziert wurden über eine 27-Gauge-Nadel (n = 5 /Gruppe), und dann wurde die Milz in die Bauchhöhle zurück , das Peritoneum und die Wunde vernäht. 4 Wochen nach der Inokulation mit Zellen wurden die Mäuse getötet, [37]. Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren herausgegeben vom National Institute of Health durchgeführt. Pusan National University-Institutional Animal Care und Use Committee (PNU-IACUC) genehmigt alle experimentellen Verfahren mit Tieren.
Zellproliferationsassays
von vorgemischten wasserlösliche Tetrazoliumsalz-1 (WST-1, Roche, Indianapolis, iN, USA) wurde in Vertiefungen gegeben. Diese Zellen wurden dann für zwei Stunden inkubiert und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Messung der Absorption bei 450 nm unter Verwendung eines ELISA-Reader (TECAN, Männedorf, Schweiz) bestimmt.
Sphere Bildungstest
Die Datenanalyse
Ergebnisse
Nanotechnologie und COVID-19-Diagnose und -Behandlung
Studie mit Zwillingen zeigt, dass COVID-19-Symptome einen genetischen Beitrag haben
Ein ungesundes Darmmikrobiom reduziert das Beschneiden der Synapsen des Gehirns,
Gentechnisch veränderte Darmbakterien reduzieren das Risiko von Darmkrebs bei Mäusen, findet Studie
Darmmikrobiota könnte den Schweregrad von COVID-19 vorhersagen
Glycyrrhizinsäure als Medikamentenkandidat für COVID-19
Chronischer Husten könnte mit neuem Medikament gelindert werden
Zwei Studien haben gezeigt, dass chronischer Husten und seine belastenden Symptome mit Hilfe eines neuen Medikaments gelindert werden könnten. Ebenfalls, das Medikament hat keine Nebenwirkungen, die s
Männer, die zweimal pro Woche Joghurt essen, erkranken seltener an Darmkrebs
Neue Forschungen haben ergeben, dass Männer, die zwei oder mehr Portionen Joghurt pro Woche essen, ihr Risiko für die Entwicklung von Krebsvorstufen, die zu Darmkrebs führen können, verringern können.
Xylit und Grapefruitkernextrakt sind vielversprechend bei der Vorbeugung einer SARS-CoV-2-Infektion.
Studie findet Die Coronavirus-Krankheit (COVID-19), verursacht durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), hat weltweit Verwüstung angerichtet. Es hat sich seit seinem