Plos ONE: ATOH1 regulira tumorogenosti želodčnega raka celic s indukcijo diferenciacije rakavih matičnih celic

Povzetek

Rak matične celice (FT) je bilo dokazano, da posreduje tumorogenosti, Chemo-odpornost, radio odpornost in metastaze, ki predlagajo, da se šteje za terapevtske cilje. Ker so njihove diferencirane hčerinske celice ne morejo več tumorogen, da inducira diferenciacijo FT je lahko ena od strategij, ki lahko izkoreninjenje FT. Tukaj bomo pokazali, da lahko ATOH1 inducira diferenciacijo želodčnih rakavih matičnih celic (GCSCs). PCR v realnem času in western blot analiza je pokazala, da je bila ATOH1 povzroča med diferenciacijo GCSCs. Poleg tega je lentivirusom povzroča prekomerno izražanje ATOH1 v GCSCs in v celičnih linijah raka na želodcu bistveno povzroča diferenciacijo, zmanjšano proliferacijo in oblikovanje krogle, in zmanjšano in vivo
nastanek tumorja v modelih subkutane injekcije in jetrne metastaze ksenotransplantskih. Ti rezultati kažejo, da bodo ATOH1 šteje za razvoj terapije diferenciacijo za raka želodca

Navedba. Han ME, Baek SJ, Kim SY, Kang CD, Oh SO (2015) ATOH1 regulira tumorogenosti želodčnega raka celice z indukcijo diferenciacije Rak izvornih celic. PLoS ONE 10 (5): e0126085. doi: 10,1371 /journal.pone.0126085

Akademska Urednik: Gianpaolo Papaccio, Second Univerza v Neaplju, Italija

Prejeto: 3. september 2014; Sprejeto: 30. marec 2015; Objavljeno: 7. maj 2015

Copyright: © 2015 Han et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v dokumentu, razen podatkov RNA zaporedja, ki so bili deponirani v javnem skladišču. (GEO pristop številka: GSE46597)

Financiranje: To delo je podprl Bio in Medical Technology Development Program (2012M3A9C6050213) in osnovne znanstvene raziskave Foundation (2012R1A1A3010521) National Research Foundation (NRF), ki jih je korejska vlada (MEST), in nepovratnih sredstev iz državnega R &financira; D Program za raka nadzor, Ministrstvo za zdravje, socialo in družino, Republike Koreje (0.920.050) . Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Potem, ko so rak matičnih celic (FT) najprej izolirali iz bolnikov levkemijo, ki so jih izolirali iz različnih vrst raka, vključno z rakom želodca [1,2,3,4,5,6]. FT je bilo predlagano, da je terapevtski cilj, saj lahko posreduje tumorogenosti, Chemo-odpornost, radio odpornost in metastaze [7,8,9]. Konvencionalna terapija proti raku v glavnem cilj so bolj razširjeni non-FT, ki pojasnjuje, da je pogost pojav raka [9]. Revni prognoza bolnikov z večjo CSC prebivalstva, prav tako spodbuja razvoj terapij, ki so usmerjeni FT [10].

Ena od značilnosti CSCS je, da se lahko diferencirajo v hčerinskih celic, ki niso več tumorogen, na primer so CSCS iz debelega črevesa in želodca raka povzroča razlikovanje s serumom [5,6]. To pomeni, da CSC hipoteza bistveno razlikuje od tradicionalnega klonsko razširitveno hipoteze. Poleg tega se lahko hierarhično razmerje med FT in njihovih hčerinskih celic mogoče pojasniti s epigenetskih mehanizmov, ki se lahko uporabljajo v običajnih matičnih celic [11,12]. Poleg tega lahko mikrookolje vplivala na diferenciacijo CSCS [13], in to karakteristike je mogoče izkoristiti za razvoj terapij.

Zato, indukcijo diferenciacije je strategija, ki se lahko uporabijo za odpravo CSCS. Epigenetske regulatorji so predlagali, da inducira njihovo diferenciacijo, na primer, histon deacetilaze inhibitorji (HDAC) so pokazale, da inducira diferenciacijo CSCS v levkemije, ki jih povzročajo fuzijskih proteinov, kot so AML1-ETO in PML-RARα [14,15 ]. Poleg tega lahko vse-trans retinojska kislina (ATRA) inducira diferenciacijo CSCS v akutno promielocitno levkemijo (APL) preko C /EBP dejavniki [16,17], divje transkripcijske faktorje tipa, na primer, C /EBPα, lahko inducirane razlikovanje pri ljudeh AML in v celičnih linijah s pljučnim rakom in pri miših in vivo
modeli [17,18,19,20]. V raka želodca, je bilo suramin pokazalo, da inducira diferenciacijo človeških želodčnih raka celičnih linij [21].

ATOH1 je osnovni helix-loop-helix (bHLH) transkripcijski faktor homologna za atonalni Drosophila [22]. Aktivira E box-odvisno transkripcijo v sodelovanju z E47 [23]. HES1, molekule v Notch signalne poti, lahko ovirajo njegovo izražanje [24]. Knock-out študije miške so pokazale, da ATOH1 igra ključne vloge pri ustvarjanju cerebelarni zrnc nevronov, notranjega ušesa celic za lase, hrbtenice internevronov vrvjo, Merkel celice v koži in črevesnih izločevalnih celic [25]. Zanimivo je, da ATOH1 je povezana z različnimi vrstami raka, vključno z rakom debelega črevesa [25].

Za razvoj nove diferenciacije zdravljenju raka želodca za, smo analizirali izražanje spremembe na ravni mRNA med diferenciacijo želodca stebla raka celice (GCSCs). Ugotovljeno je bilo, da je med diferenciacije GCSCs, raven ekspresije ATOH1, kar je pomembno za razlikovanje črevesnih epitelnih celic [26,27], se je znatno povečal. Poleg tega je indukcija ATOH1 v želodcu raka celičnih linijah in GCSCs občutno zmanjšale pojav tumorjev pri subkutane injekcije in metastaz jeter modelov

Materiali in amp.; METODE

Rak želodca izvornih celičnih kultur

Rak želodca tkiva so najdena po pridobitvi pisno privolitev od bolnikov, ki so doživeli kirurško resekcijo na nacionalni bolnišnici Pusan ​​University (PNUH) in Pusan ​​National University Yangsan Hospital (PNUYH ). Protokol študije je bil odobren s Pusan ​​National University Hospital-Institutional Review Board (PNUH-IRB) in Pusan ​​National University Yangsan Hospital-Institutional Review Board (PNUYH-IRB). Želodčni rak matične celice smo gojili kot je opisano predhodno [6] in so bile inducirane za diferenciacijo z dodatkom 5% FCS za medije namesto rastnih faktorjev.

kulture celičnih linij raka želodca

rak želodca celice (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, NCI-N87) smo kultivirali v RPMI1640 dopolnjen z 10% fetalnega govejega seruma (FBS) in 100 ug
/ml penicilina /streptomicin pri 37 ° C 5% CO _{2 navlaženega zraka inkubator. Te celične linije so bili pridobljeni iz Korejski Cell Line banke (Seoul, Koreja).}

Kultura 293FT celične linije

so 293FT celice vzdržujejo v DMEM dopolni z 10% fetalnega govejega seruma in 0,1 mM MEM non-Esencialne aminokisline (NEAA), 1 mM MEM natrijev piruvat (oba SIGMA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA), 6 mM L-glutamina (Life Technologies, Grand Island, NY, ZDA), in 1% Pen-Strep v 5% CO _{2 navlaženega zraka inkubatorja.}

RNA zaporedja in analiza podatkov

Knjižnica je bila pripravljena s pomočjo IlluminaTruSeq RNA vzorca Prep Kit in sekvenciramo z Illumina genoma Analyzer IIx (San Diego, CA, ZDA), da ustvari 76 bp paru konec zapisano. Sequenced glasi bila usklajena na človeško referenčnega genoma 19 uporabo Tophat 2 [PubMed ID 19289445]. mRNA smo izmerili kot RPKM (Bere Per kilobaznih na milijon mapiranim bere) z enolično preslikajo glasi uporabo hg19 RefSeq model in HTSeq paket (http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/). Bed datoteke so bili izdelani z Tophat 2. Vse RNA podatki zaporedja so bile deponirane na javnem skladišču (GEO Pristopna številka: GSE46597)

PCR v realnem času

Pridobivanje RNA in v realnem času so bile opravljene PCR. z uporabo Power SYBR Green PCR Master Mix in ABI Prism 7500 zaporedja detektor (oba Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA), kot je opisano zgoraj [28]. V začetnih oligonukleotidov sekvence, ki se uporabljajo (naprej in nazaj, v tem zaporedju) so bili naslednji: Diferenciacija markerji; CA1, 5'TCA GAG OAS CTG GCA CAA TTC CG -3 'in 5' SCT TCA GAG GTT GGG TTG GGC G -3 "; SSTR2, 5'CCA GGA ACC CCA AAC GTC CG -3 'in 5' OAS TGT GAC ATC TTT GCT TTT CCG C -3 "; CHGA, 5'GCA AAC CGC AGA CCA GAG GAC C -3 'in 5' TGT CTC AGC CCC GCC GTA GT -3 "; PGC2, 5'-TGG SCT ACC CTG CTC TGT CCG -3 "in 5'-ACT CCA GGA CCA GGT TGC TGA GG -3"; MUC5AC, 5'TCA CAC GGT SCT GCC CAC AGA G -3 'in 5' ACC SCT GCA TCT OAS AGC CCC -3 "; ATP4B, 5'GAA AGC CCA GCC CCA CTA OAS C -3 'in 5' TGC TCC GCC ATG ACC TTG CAC -3 "; Stemness markerji; CD44, 5'-GCC TGG GGA CTC TGC CTC GT -3 'in 5' AGC CTT GCA GAG GTC AGC GG -3 "; LGR5, 5'-GAG CTG SCT TCC AAC CTC AG -3 'in 5' CCC GCA AGA CGT AAC TCC TC -3 "; BMI1, 5'-TGG TTG CCC ATT GAC AGC GG -3 'in 5' AAA AAT CCC GGA AAG AGC AGC CG -3 "; in c-myc, 5'-ACA CCC GAG CAA GGA CGC GA -3 "in 5'-CGC GGG AGG CTG CTG GTT TTC -3"; ATOH1, 5'CCC CTT CCA GCA AAC AGG TG -3 'in 5' ACG GGA TAA CAT TGC GCA GC -3 "; GAPDH 5'GAG TCC ACT GGC GTC TTC AC -3 'in 5' ATG ACG AAC ATG GGG GCA TC -3 ". GAPDH je bila uporabljena za standardizacijo ravni vhodnih cDNA

Western blot analiza

Western analiza blot smo izvedli kot je opisano prej [24], z uporabo naslednjih protiteles:. ATOH1 (LSBio, Seattle, WA, ZDA ); CD44, LGR5, ATP4B, CA1, PGC, MUC5AC (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, ZDA); c-myc, kaspaza-3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, ZDA); razcepi kaspaze-3, kaspaze-9, razklani kaspaze-9 (Cell Signaling Technology, MA, ZDA); p21, β-aktina protitelesa (Abcam, Cambridge, MA, ZDA) in HRP konjugirano sekundarna protitelesa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, ZDA).

lentivirusni konstrukti in generacija aktivnega virusa

Če želite ustvariti izraz klon, zaporedje preverila virusni ORF klonov (ATOH1, IOH34744, Life Technologies, Grand Island, NY), v vektorjih vstopnih Gateway so bile prenesene v pLenti7.3-DEST vektorja (pLenti7.3/V5-DEST Gateway Vector Kit, Life Technologies, Grand Island, NY, ZDA) z uporabo rekombinacije reakcijo LR (encimsko mešanico LR Clonase II, Life Technologies, Grand Island, NY, ZDA). Za transformacijo smo uporabili One Shot Stbl3 Pristojni E. coli (Life Technologies). Po kotransfekcijo z izrazom klona in ViraPower Embalaža Mix (Life Technologies) v celični liniji 293FT (Life Technologies) za proizvodnjo lentivirusom, požanjemo lentivirusni supernatante. Te lentivirusni zaloge so bili uporabljeni za transducira GCSCs in želodčni rak celičnih linij.

zbiranje in širjenje virusov so bile izvedene v skladu z navodili proizvajalca (Life Technologies). virus Nadzor je bil ustvarjen vzporedno brez vključitve ATOH1.

Gradnja celičnih linij RASSF4-reporter in luciferazni test

Gluc-ON Promotor Reporter Clones, pEZX-PG02 (HPRM11834-PG02 , GeneCopoeia, Rockville, MD, USA), so bili uporabljeni za gradnjo RASSF4-luciferaza linij reporter celice (NCI-N87 in SNU216 celice) in puromicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) je bila uporabljena za izbiro. Lentivirusni opisano zgoraj smo uporabili za indukcijo ATOH1. Luciferazne aktivnosti so bile izmerjene z uporabo izločajo-Pair Gaussia luciferazni test Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca in pri 72 h post-transdukcije.

ksenotransplantskih test

Celice smo razredčili na ustrezen odmerek injekcija (1x10 ^{6 celic), v mešanici z BD Matrigel (BD Biosciences, CA, ZDA) v razmerju 1: 1, in injiciramo subkutano na hrbtni strani vsake poslal v huda kombinirana imunska pomanjkljivost (SCID) miši (n = 5 /skupino). Zmanjšati eksperimentalnega variabilnosti zaradi individualnih razlik v miših prejemnice so celične populacije, ki so se v primerjavi injicirali na nasprotnih boki iste živali. Tumorji so pridelane po Izmerili smo 4 tedne in tumorske uteži. Za model metastaz jeter, so SCID miši anestezirali z injekcijo intraperiotnealni za ketamin /Ksilazin kombinaciji. Nato so bile miši zareže okoli 10 mm na levi subcostal je vranica potrjena po peritonej, je peritonej odprta za okoli 8mm in vranico bila izpostavljena preko peritoneja. Celice (5x10 4 celic /100 ul
) smo počasi injicirali v vranice miši z 27-gauge iglo (n = 5 /skupino) in nato vranice so se vrnili v trebušni votlini je zašite trebušne votline in rane. 4 tedne po okužbi s celicami, smo miši žrtvovali [37]. Ta študija je bila izvedena v strogo v skladu s priporočili v navodilih za nego in uporabo laboratorijskih živali, ki jih je Nacionalni inštitut za zdravje izdal. Pusan ​​National University-institucionalnega varstva živali in odbor uporaba (PNU-IACUC) odobri vse eksperimentalne postopke, ki vključujejo živali.}

Cell širjenje test

Pet dni po transdukcija z lentivirusom, 10 ul
pre mešano vodotopna tetrazolij sol-1 (WST-1 Roche, Indianapolis, IN, ZDA) smo dodali v jamice. Te celice smo nato inkubirali dve uri in viabilnost celic smo določili z merjenjem absorbance pri 450 nm ob uporabi ELISA čitalnika (Tecan, Mannedorf, Švica).

Krogla tvorba vsebnosti

Krogle so bile ločeno v posamezne celice in prekrita s 96 vdolbinami pri 0,2 ml volumni medijev. Vsako vdolbino 96 vdolbinami plošče vsebuje manj kot 10 celic. Celice so nato kultivirani in spremljati 5-7 dni. Krogle večja od 25 mikrometrov so bili prešteti z obrnjeno mikroskop in učinkovitost tvorbe krogle so primerjali.

Analiza podatkov

neparametrični Mann-Whitney U test ali na t-test (neparni primerjave) so bili uporabljeni za določitev pomene razlik med srednjimi vrednostmi dveh skupinah, in enosmerno analizo variance (ANOVA), sledi Tukey za multiple primerjave smo ugotavljali pomene razlik med srednjimi vrednostmi treh ali več skupin . * Označuje vrednost P < 0,05, kar je šteje merilo pomembnosti. Podatke smo analizirali s pomočjo SPSS programske opreme, verzija 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Rezultati so prikazani kot sredstva ± SDS.

Rezultati

Indukcija ATOH1 med diferenciacijo GCSCs

Diferenciacija GCSCs s seruma je bila predhodno dokazana [6]. Identificirati dejavnike, povezane z diferenciacijo, smo primerjali mRNA izražanja profile matičnih celic in celic v diferenciranih celic državah po RNA sekvenciranje. Mnogi tumor supresorski geni so bile med diferenciacijo inducirane (podatki niso prikazani). Zanimivo je, da ATOH1, transkripcijski faktor ključnega pomena za razlikovanje črevesnih epitelnih celic, smo sprožili tudi. Da bi potrdili to indukcijo ATOH1 med diferenciacije, smo pregledali spremembe v ravni ekspresije ATOH1 ga realnem času PCR in zahodni blot analizo. Ugotovili smo, kot GCSCs približal terminalske stopnje diferenciacije, izraz ATOH1 povečalo (slika 1).

Čezmerno ATOH1 povzroča diferenciacijo GCSCs

Za določitev vloge ATOH1 med GCSC diferenciacije, smo ga prekomerno v GCSCs uporabo lentivirusom. Če želite preveriti diferenciacije stanja, smo preverjali raven izražanja različnih označevalcev za razlikovanje ali stemness. Predvsem prevelike količine ATOH1 v GCSCs povečala raven izražanja različnih razlikovanja označevalcev, ampak se je zmanjšalo raven izražanja različnih stemness označevalcev (slika 2).

V nadaljevanju smo raziskali, ali bi ATOH1 urediti orožja ali nabiranje krogle. Zanimivo je, da prevelike količine ATOH1 bistveno zmanjšala proliferacije različnih vrst želodčnega raka celičnih linij in oblikovanje krogle s GCSCs (slika 3).

ATOH1 prekomerno zniža in vivo
tumorogenosti

Če želite ugotoviti, ali lahko ATOH1 urejanje in vivo
tumorogenosti želodčnih rakavih celic, smo uporabili model jetra metastaz, ki ga vbrizgavajo želodčne rakave celice v vranici (celice nato preselili v jetrih). Predvsem prevelike količine ATOH1 bistveno zmanjša nastanek tumorjev na jetrih, ki ga GCSCs in NCI-N87 želodčnih rakavih celic (slika 4). Poleg tega, ko smo podkožne ksenografi, so opazili podobne rezultate (slika 4).

ATOH1 povečala RASSF4 promotor dejavnost

Da bi potrdili, ali je razlikovanje GCSCs s ATOH1 posredovana prek transkripcijske aktivnosti, smo pregledali aktivnosti promotor ciljnega ATOH1 gena (RASSF4) z luciferazne teste [29]. Po promotor RASSF4, ki je skupaj z genom lucifease je stabilno uvedemo v želodčni rak celičnih linijah (NCI-N87 in SNU216 celice), smo pregledali učinke ATOH1 na aktivnost luciferaze. Transdukcija z ATOH1 znatno povečala luciferazno aktivnost v RASSF4 promotorja. (Slika 5).

Sodelovanje apoptoze in celičnega ciklusa poti v učinkih ATOH1

Prejšnja poročila so poročali apoptosis in celičnega cikla poti so vključeni v učinkih ATOH1 na tumorjev v mrežnici [30] in colon [25]. Torej, smo pregledali, ali so z njimi povezani proteini sodelujejo tudi pri vplivu ATOH1 na orožja (slika 3A) in oblikovanje krogle (slika 3b) V tej študiji. Sprememba orožja in oblikovanju krogle lahko posledica počasnejše celični ciklus, povečane apoptoze mero, ali pa oboje.

Našli smo transdukcija z ATOH1 povečala raven cepi-kaspaze-3 in-kaspaze-9 v GCSCs in celičnih linij raka želodca (slika 6), kar kaže, da bi lahko bile vključene realna apoptoza pot. Poleg tega smo ugotovili tudi up-regulacijo p21 ob ATOH1 prekomerno (slika 6).

Pogovor

V tej raziskavi smo pokazali, da ATOH1 A HLH transkripcijski faktor, lahko povzroči razlikovanje od GCSCs, in to vodi do izgube tumorjev. ATOH1 overexpression je že pokazalo, da inducira diferenciacijo črevesnih matičnih celic v izločevalnih celic [24], in v ATOH1-null miši, sekrecijska celice niso bile ustvarjene v črevesju [26]. Ta učinek ATOH1 diferenciacije so opazili tudi pri raku debelega črevesa in celic, v katerih je delovala kot zaviralnih. Poleg tega je v približno 70% kolorektalnih rakov, so poročali njen izraz se zmanjša z genetskih in epigenetskih mehanizmov [25,31]. V debelega rakavih celic, ATOH1 čezmernim zmanjša proliferacijo in rast v mehki agar in ksenograftih [31], in izbris ATOH1 okrepljeno tumorjev pri miših [25]. Ti rezultati skupaj kažejo, da se ATOH1 mogoče uporabiti kot diferenciacije terapije za raka prebavil.

V nasprotju z njegovim učinkom na diferenciacijo, lahko ATOH1 spodbujajo tudi širjenje matičnih celic in tvorbe tumorja. Pri malih možganov razvoju miši, je ATOH1 ugotovljeno, da začne program diferenciacija cerebelarni zrnc nevronov predhodnimi sestavinami v zgodnji fazi (P0). Vendar pa je pozneje (P5), je spodbujati širjenja predhodnih sestavin [32,33,34]. ATOH1 izbris na P0, močno zaviral diferenciacijo, vendar njeno črtanje v poznejši fazi povzročilo izstop iz celičnega cikla in diferenciacije [35]. Te različne vloge ATOH1 na različnih stopnjah je mogoče pojasniti z različnimi targetomes [35]. ATOH1 spodbujati nastanek meduloblastom skupaj s SHH jež signalne poti [36,37]. Poleg tega je njen izraz ugotovljeno, da znatno povišano mucinozni adenokarcinoma, pečatni prstan karcinom in črevesne nevroendokrinih tumorjih [38]. Zato, da se lahko uporabljajo ATOH1 za terapijo diferenciacije, njegovi neposredni cilji, ki povzročajo razlikovanje treba ga je mogoče prepoznati.

Čeprav so poročali o izraznih statusi ATOH1 v normalnem želodčne sluznice in rakom želodca, njegove vloge so slabo označena. ATOH1 je izražen v normalnih želodčne epitelijskih celic človeških na nizki ravni [39,40], vendar izraz ni bilo opaziti v normalnih želodčne epitelijskih celic želodca miške [26]. Poleg tega je miška in človeški metaplastic želodčne sluznice je pokazala ATOH1 izraz [41], vendar izraz ni bilo opaziti v želodcu raka celičnih linijah, vključno MKN74, MKN45, KATOIII in HSC58 [40]. Pri nekaterih bolnikih z rakom želodca se prekomerno [39]. Njene patofizioloških vloge nikoli niso bili raziskani v rakom želodca. V tej študiji smo ugotovili, da lahko indukcija ATOH1 izražanja zmanjša proliferacijo, invazijo in tumorogenosti želodčnih rakavih celic. Našli smo tudi morebitno vpletenost p21 in apoptoze pot v učinke ATOH1 je.

Naše ugotovitve kažejo na možnost, da se gen ATOH1 ogledov kot potencialne tarče zdravljenja raka želodca. Lahko bi se razvila majhne molekule, ki povzročajo njeno izražanje ali gensko zdravljenje s pomočjo virusov ali matičnih celic. Zlasti je ATOH1 ugotovljeno, da inducira diferenciacijo želodčnih rakavih matičnih celic, in s tem, Therapeutics ciljanje ATOH1 bi mogli izkoreniniti raka matičnih celic.

• Plos ONE: Fas signalnega Spodbuja Rak želodca metastaze skozi stat3 odvisni uravnavanjem Fascin
• Plos ONE: NOD1 in NOD2 genetskih variant v povezavi s Nevarnost želodca raka in njegovih predhodnikov v kitajski Population