PLOS ONE: alta diversidade de vacA e cagA Helicobacter pylori Os genótipos em pacientes com e sem câncer gástrico

Abstract

Fundo

Helicobacter pylori
está associada com gastrite crônica, úlcera péptica e câncer gástrico. O objetivo deste estudo foi avaliar a distribuição topográfica do H. pylori
no estômago, bem como o vacA
e cagA
genótipos em pacientes com e sem câncer gástrico.

Metodologia /PRINCIPAIS CONCLUSÕES

Três biópsias gástricas, de regiões predeterminadas, foram avaliados em 16 pacientes com câncer gástrico e 14 pacientes com sintomas de dispepsia. A partir de pacientes com câncer, biópsias adicionais foram obtidos a partir de centros de tumor e margens; Entre estas amostras, a presença de H. pylori vacA
e cagA
genótipos foi avaliada. Positivo H. pylori
foi de 38% e 26% em biópsias obtidas a partir dos grupos de cancro e de não-cancro gástrico, respectivamente, ( P
= 0,008), e 36% em locais de tumor. Em pacientes com câncer, encontramos uma distribuição preferencial de H. pylori
no fundo e corpus, ao passo que, no grupo de não-câncer, a distribuição foi uniforme ( p
= 0,003). A maioria das biópsias foram simultaneamente cagA
gene positivos e negativos. O fundo e corpus demonstrou maior positividade para o cagA
gene no grupo não-câncer ( p
= 0,036). Uma mistura de tamanhos cagA
também foi significativamente mais frequente neste grupo ( p
= 0,003). Noventa e dois por cento de todos os sujeitos apresentaram mais de um vacA
genótipo do gene; s1b e m1 vacA
genótipos foram encontrados predominantemente no grupo de câncer gástrico. O mais alto vacA
diversidade -genotype sinal de sequência foi encontrado no corpus e 5 cm de margens tumorais.

Conclusão /Significado

High H. pylori
diversidade colonização, juntamente com o cagA
gene, foi encontrado predominantemente no fundo e corpus de pacientes com câncer gástrico. A diversidade genótipo observado através de amostragem sistemática de todo o órgão e tumor foi notável. Nós achamos que não há provas suficientes para apoiar a associação de um isolado com uma doença específica, devido à natureza multistrain de H. pylori
mostrado neste trabalho

Citation:. López-Vidal Y, Ponce de Leon S, Castillo-Rojas G, Barreto-Zúñiga R, Torre-Delgadillo A (2008) elevada diversidade de vacA
e cagA Helicobacter pylori
genótipos em pacientes com e sem câncer gástrico. PLoS ONE 3 (12): e3849. doi: 10.1371 /journal.pone.0003849

editor: Debbie Fox, do Instituto de Pesquisa para crianças do Hospital Infantil de Nova Orleans, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de maio de 2008; Aceito: 10 de novembro de 2008; Publicação: 03 de dezembro de 2008

Direitos de autor: © 2008 López-Vidal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado pela concessão DGAPA PAPIIT-IN207302 da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), UC-MEXUS e CONACyT-México 47749-M. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Helicobacter pylori
é um patógeno gástrico que infecta quase 50% da população do mundo [1]. É considerado o principal agente etiológico da gastrite crónica activa e é geralmente aceito como a principal causa de úlcera péptica; ele também é um conhecido fator de risco para o câncer gástrico [2]. desenvolvimento de câncer gástrico foi demonstrado para abranger várias décadas, começando sequencialmente com H. pylori
infecção e ao desenvolvimento de gastrite crónica activa [3]. atrofia e metaplasia intestinal glandulares, eventualmente, ocorrer em um subgrupo de pacientes e terminar no câncer gástrico [4]. H. pylori
tem sido sugerido para levar a um aumento do risco relativo (RR) -on a ordem de 4-9 vezes-por desenvolver condições gástricas pré-cancerosas, especialmente quando a infecção ocorre durante a [5] infância. Dado que apenas uma minoria de H. pylori
indivíduos infectados desenvolvem esta doença, acredita-se que o desenvolvimento da doença é dependente da expressão de genes específicos de virulência da bactéria, por exemplo, cag
e vacA
[6] , ambos os quais são altamente expresso independentemente do estado de doença do hospedeiro [7], [8]. As associações entre topografia gástrico, a diversidade genotípica do H. pylori vacA
e cagA
genes, e o desenvolvimento de câncer gástrico permanecem controversos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a distribuição da vacA Comprar e cagA
genótipos de H. pylori
ao longo do estômago em pacientes com e sem câncer gástrico

Hipótese:. uma maior freqüência de H. pylori
está associado com estágios iniciais de câncer gástrico.

Métodos

Os pacientes encaminhados para estudo endoscópico, devido à suspeita de câncer ou sintomas de dispepsia foram convidados a participar de um estudo transversal prospectivo . Todos os pacientes com cancro foram incluídos, bem como aqueles com dispepsia não ulcerosa e /ou de refluxo gastro-esofágico. Os critérios de exclusão incluíram alterações da coagulação, o consumo de drogas não esteróides anti-inflamatório não esteróide (AINE) nas últimas 72 h, hipertensão portal, e a presença de linfoma no estudo histológico.

Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido antes da participação no estudo. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board do Instituto Nacional de Ciências Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ), número de registro CIBH-1081.

A endoscopia digestiva alta foi realizada de acordo com uma técnica padrão. Um esquema de biópsia-amostragem sistemática foi utilizado como segue: a partir de cada paciente, três biópsias gástricas foram obtidos a partir de cada um dos quatro locais do estômago (antro, porção angular, Corpus, e fundus). Dos pacientes com cancro gástrico, amostras de biópsia adicionais foram obtidos a partir do centro e a margem do tumor e a uma distância de, pelo menos, 2-5 cm a partir das margens do tumor.

Todas as amostras patológicas de pacientes com cancro gástrico foram avaliados por um único patologista experiente e classificados de acordo com a classificação Lauren como difusa, intestinal, ou tipo [9] mista. A descrição do cancro gástrico avançado baseou-se na classificação Borrmann [10]. Morfológicas precoce do câncer gástrico sub-tipos foram classificados de acordo com as diretrizes japonesa Endoscopy Society [11], [12].

H. pylori foi cultivada
manchando amostras de biópsia na superfície de placas de agar de sangue de cavalo (10% de sangue de cavalo em base de ágar Casman [BBL Microbiology Sistemas, Cockeysville, MD, USA]) [8].

cromossómicas o DNA foi extraído [13], e o H. pylori 16S rRNA
e cag
gene foi amplificado por PCR como descrito anteriormente [7]. O vacA
sequência de sinal e mid-região foram digitados por PCR tipo específico de alelos, como descrito anteriormente por Morales et al.
[8].

cag
amplificação do gene da região variável. cagA
'regiões de repetição 3 do H. pylori
estirpes estudadas nesta investigação foram classificados de acordo com o seu comprimento (devido à presença de um número variável de sequências de repetição na região 3 'do gene). Os produtos de amplificação obtidos foram categorizados por tamanho em um dos três grupos: curto (906 pb); médio (1.008 pb) e longa (1.110 pb), de acordo com Karita et al
. [14]. A amplificação foi realizada usando iniciadores cagRV17-F 5'-ACC CTG GTC AAT GGT GGA TCT TTA-3 'e cag22-R 5'-TTA AGA TTT ttg gaa acc acc ttt t-3', que foram concebidos com base em sequências recuperadas a partir de Genbank usando Alig (software científico e educacional) e ClustalW (BCM Pesquisa Launcher, alinhamentos múltiplos de sequências).

Os dados foram analisados ​​para fins descritivos utilizando frequências relativas e médias aritméticas (desvio padrão [SD]), como julgado apropriado. As comparações entre os grupos foram realizadas por χ ^{2 análise, bem como com o teste exato de Fisher-Freeman-Halton para tabelas de contingência. O grupo do cancro gástrico foi comparado com pacientes com dispepsia não ulcerosa e /ou de refluxo gastro-esofágico. Os pacientes com câncer foram estratificados tão cedo para a fase TNM 0, I ou II e avançado para o III ou IV. O nível alfa foi fixado em 0,05. Dado que as comparações múltiplas simultâneas foram realizadas, uma correcção de valor nominal de alfa foi introduzido na sequência do processo de Bonferroni. Consequentemente, nós considerado associações com P valores
entre 0,05 e 0,01 como suspeito. Por outro lado, resulta no p
≤0.0063 nível foram consideradas razoavelmente significativa. Valores entre 0,01 e 0,0063 eram considerados como marginais. Todas as análises foram realizadas utilizando Stata software estatístico (Intercooled Stata 7.0 para Windows 98/95 Package /NT, 2002) e Stat-Xact (v. 4.0.1., Cytel Software Corp., 1999).}

Resultados

Trinta e dois pacientes foram incluídos neste estudo. Com base no diagnóstico endoscópico, 18 foram classificados no grupo de câncer gástrico e 14 no grupo não-câncer. Devido à evidência histológica de linfoma gástrico, no entanto, dois pacientes no grupo de câncer gástrico tinha de ser excluído, deixando 16 pessoas nesse grupo. A idade média dos pacientes no cancro gástrico e grupos de dispepsia foi de 57,6 ± 16,7 anos (56% do sexo masculino) e de 47,2 ± 13,3 anos (14% do sexo masculino), respectivamente. Dez pacientes (63%) apresentaram um tumor difuso de acordo com a classificação de Lauren. Cinco pacientes tinham câncer gástrico precoce (tipo I, três; II, um; IIB, um) e 11 tinham câncer avançado (tipo IIIA, quatro; IIIB, três; IV, quatro) gástrica, de acordo com os japoneses Sociedade de Pesquisa em Câncer Gástrico diretrizes e a classificação Borrmann.

em nossas amostras de biópsia 411, H. pylori
foi identificado por qualquer cultura ou por PCR em 38% (78/203) das amostras de biópsia a partir do grupo do cancro gástrico, 26% (54/208) no grupo de não-cancro ( P
= 0,008) e 36% (40/110) dos locais de tumor (ver Tabelas 1 e 2). H. pylori
demonstrou uma distribuição topográfica diferencial em pacientes com câncer gástrico, com uma taxa de positividade maior no fundo e corpus ( p
= 0,003), a tabela 1. O grupo não-câncer não mostraram distribuição topográfica diferencial . Um pouco maior positividade de H. pylori
foi encontrado nos locais de tumor por cultura ou pelo margens do tumor por PCR; No entanto, estes aumentos de positividade não foram estatisticamente significativas (Tabela 2). Não houve correlação significativa entre o H. pylori
taxa de positividade e estágio do câncer TNM (precoce versus tardia).

Encontramos H. pylori cag
positividade em 72% das amostras gástricas a partir do grupo do cancro gástrico, 73% do grupo sem cancro ( P
= NS) (Tabela 3), e 83% do tumor locais ( p
= não significativo [NS]). O H. pylori cagA
distribuição topográfica não foi estatisticamente significativa no câncer gástrico grupo, enquanto o grupo não-câncer demonstraram uma taxa de positividade maior no fundo e corpus; no entanto, a importância deste achado é questionável ( p
= 0,036) (Tabela 3). Mais uma vez, nos locais de tumor, encontramos nenhum padrão de distribuição significativa para a fração positividade cagA
, nem havia uma diferença entre pacientes com câncer gástrico precoce e avançado.

Oitenta e um H. pylori
cepas foram estudados (80 cagA
+), incluindo 46 cepas de pacientes com câncer gástrico e 35 de pacientes não-cancerosas. Apenas dois cagA
tamanhos gene foram obtidos a partir da 80 H. pylori
cepas estudadas; nenhum dos mais sequências cagA
foram encontrados. Em ambos os grupos, o mais curto cagA
foi o mais detectado. Os resultados estão resumidos na Tabela 4. É interessante notar que tanto tamanhos cagA
foram amplificados a partir de 12 (15%) estirpes, sugerindo que estas pacientes foram co-infectadas com múltiplos H. pylori
estirpes. Esta constatação foi obtida com mais frequência no grupo de pacientes não-câncer (28,6%) do que no grupo de câncer gástrico (4,4%) ( p
= 0,003).

O predominante genótipo sequência de sinal em pacientes com câncer gástrico, presentes em 39% do grupo, era s1b. A combinação S1B /s2 estava presente em 20% do grupo de S2 e estava presente em 12%. Dezesseis por cento dos pacientes com câncer gástrico tinha uma sequência de sinal não identificável (s0). Não houve distribuição estatisticamente significativa de vacA
genótipos através do estômago ( p
= NS) (veja a Figura 1). O mais frequente vacA
genótipo no grupo não-câncer foi s1b, que estava presente em 59% do grupo, seguido pela combinação S1A /s1b em 11%, S1A /s1b /s2 em 7%, e uma sequência de sinal não identificável em 9% ( p
= 0,06), Figura 1. a análise da distribuição dos genótipos topográfico mostrou que s1b genótipo do vacA
foi predominante em todas as zonas (fundo de olho, corpus , porção angular, e antro) do estômago, em ambos os grupos estudados (Figura S1). Encontramos uma diferença distinta e marginalmente significativa nos padrões de distribuição destes genótipos entre os grupos cancerosas e não-cancerosas ( p
= 0,01). Tanto o corpus e fundo do grupo com câncer gástrico apresentaram uma maior diversidade de genótipos de sequência de sinal, como fez o corpus no grupo não-câncer (Figura S1).

A mais frequente vacA
genótipos para cada um dos locais do tumor (centro e a margem do tumor, e pelo menos 2-5 centímetros de as margens do tumor) foram S1B e S2, que estavam presentes em 19%; S1A /s1b e s1b /s2 foram cada presente em 17%, e S1A /s1b /2, S1A /s2, e s0 estavam presentes em 8%. Não houve associação significativa entre a proximidade genótipo e do tumor local (Figura 2). A distribuição deste genótipo em locais do tumor e anatômicas em pacientes com câncer não foi estatisticamente significativa ( p
= 0,06) (Figuras 1 e 2). A associação significativa ( p
= 0,02) entre genótipo e estádio do tumor foi identificado: S1A /s1b, S1A /s1b /s2, e os genótipos s1b /s2 foram predominantes no grupo de câncer gástrico precoce, enquanto s1b, s2 e genótipos S1A /s2 eram relativamente abundantes no grupo com câncer gástrico avançado (Figura 3).

o genótipo mid-região mais freqüente em pacientes com câncer gástrico foi m1, que estava presente em 44% dos pacientes , seguido por M0 (genótipo untypeable) em 26%, 21%, em m2, e a combinação de m1 /m2 em 10% (Figura 1). No grupo não-câncer, o mais freqüente vacA
genótipo foi m1, que estava presente em 52% dos pacientes, seguido por m0 em 32%, o /combinação m2 m1 em 11%, e m2 em 5%; não havia um padrão de distribuição distinto para estes genótipos, com um nível de significância questionável ( p
= 0,03) (Figura 1). A análise da distribuição topográfica através das zonas anatómicas do genótipo região-média mostrou que o genótipo M1 foi predominantemente (50%) na porção angular, com o restante na região do fundo (48%) e o corpo (42%). O genótipo M0 era predominantemente no antro (39%) no grupo do cancro gástrico (Figura S1). No grupo não-cancro, o genótipo M1 foi mais abundante na região do fundo (77%); 56% era no corpus, e 43% estava na antro. O genótipo m0 foi detectado na porção angular (62%), não havendo diferença estatisticamente significativa entre os grupos de estudo (Figura S1). Uma distribuição quase uniforme dos diferentes genótipos foi encontrado nos locais de tumor, (Figura 2). Não houve diferença entre as zonas anatômicas e locais de tumor em pacientes com câncer gástrico (Figura 1 e 2) ou entre início e avançados tumores (Figura 3).

A Tabela 5 mostra a análise da distinta vacA
genótipos encontrado dentro de cada indivíduo a quem mais de uma biópsia foi estudada. Noventa e dois por cento (12/13) dos pacientes de câncer tinham mais de um genótipo presente. Uma conclusão semelhante foi observado no grupo não-câncer. Três indivíduos no grupo não-câncer foram consistentemente positivo para o cagA
gene, e outros três possuíam ambos os tipos (positivos e negativos) simultaneamente. No grupo de câncer, seis indivíduos foram positivos para cagA
e sete para ambos os tipos. Não sujeitos foram consistentemente negativas para este gene. A Figura 4 apresenta o número de biópsias por indivíduo eo número de vacA
segmento de sinal do gene (SS) genótipos distintos. O menor número de genótipos em pacientes com 10 ou mais biópsias tinha dois anos, eo maior foi de cinco

Discussão

O presente estudo resultou em quatro grandes conclusões:. Em primeiro lugar, H. pylori
é uniformemente distribuída em todo o estômago em pacientes com sintomas só dispepsia; segundo, H. pylori
tem uma preferência para o fundo e o corpus em pacientes com câncer gástrico; em terceiro lugar, em pacientes com sintomas de dispepsia, H. pylori cagA
tem uma distribuição preferencial no fundo e corpus e há uma alta frequência de Misturado cagA
tamanhos; quarta, o genótipo s1b predominou em ambos os grupos de estudo, e o genótipo S1A estava presente apenas no grupo dyspeptic.

A alta H. pylori
positividade no fundo de olho de pacientes com câncer gástrico pode ter sido devido à sua proximidade com o corpus, uma zona que é colonizada em H. pylori
gastrite induzida. atrofia Corpus-predominante, ou a perda de tipos de células glandulares especializados, tais como células principais parietal e, parece ser crítico para a progressão do cancro [15], e é provável que o fundo está envolvido, quer antes ou depois do corpus já está envolvida na câncer.

a relativamente alta positividade para H. pylori
foi encontrado no tumor local, apesar de declarações anteriores de que H. pylori
não pode desenvolver-se atrofiado e mucosa que a metaplasia intestinal é um ambiente desfavorável [16]. Tang et al.
, No entanto, sugeriu que H. pylori
pode sobreviver no epitélio gástrico na presença de uma lesão cancerígena [17]. Também tem sido especulado que certos factores de virulência podem desempenhar papéis importantes na persistência de H. pylori
na mucosa gástrica [18].

No presente estudo, observou-se que H. pylori
demonstra colonização semelhante das regiões anatômicas do site estômago e tumor. H. pylori
positividade em grupos de câncer gástrico precoce e avançados também foi encontrado para ser muito semelhante; Tang et al
., No entanto, observaram os resultados inversos [17]. Acreditamos que a diferença observada entre estes dois estudos é devido ao número de biópsias estudados em cada paciente; demonstramos que a amostragem sistemática modifica a associação de H. pylori
com a doença.

A maior prevalência de H. pylori cagA
gene-positividade foi encontrado no corpus e fundo de olho de pacientes com dispepsia. Anteriormente, Semino-Mora et al
. mostrou que este padrão não está presente em pacientes com câncer gástrico [19], embora nós usamos um fragmento de amplificação diferente cagA
no presente trabalho. transformação neoplásica gástrico é induzida e mantida, pelo menos em parte, pela in vivo
intracelular cagA
expressão; este efeito poderia desempenhar um papel não só durante a carcinogênese gástrica cedo, mas, com base em nossos dados, também pode ocorrer mais tarde neste processo [19]. Observou-se que 15% das cepas possuíam uma mistura de cagA
3 'repetir tamanhos região, sugerindo a presença de co-infecção com múltiplos H. pylori
estirpes, principalmente no grupo de não-câncer. Kidd et al
obtido resultados diferentes.; enquanto esses autores estudaram um número maior de pacientes [20], estudamos um maior número de biópsias gástricas de que incluiu vários locais específicos dentro do estômago.

Nós anteriormente observada a presença de diversidade genotípica no corpus úlcera péptica [8]. Esta diversidade tem sido proposto para reflectir as acções sinérgicas que estão associadas com este processo [21]. A predominante vacA
sequência de sinal genótipo detectado em ambos os grupos de estudo foi s1b, de acordo com nosso relatório anterior [22]
.

As importantes descobertas do nosso estudo são que há uma distribuição topográfica de vacA
sinal de sequência, o genótipo s1b é comumente associado com o grupo não-câncer e a combinação s1b /s2 ou genótipos s2 são encontradas apenas no grupo de câncer gástrico. Não há estudos anteriores sobre os indivíduos com câncer gástrico ter considerado as quatro zonas de tumor avaliados no presente trabalho. O genótipo S1C verificou-se ser o genótipo mais prevalente na Ásia; no entanto, sua associação com câncer gástrico está a diminuir [22], [23]. A diversidade da vacA
genótipo do H. pylori
foi explicada por um modelo de co-evolução [21].

Em relação à vacA
alelos mid-região, encontramos genótipos M1 e M2, em ambos os grupos estudados, com m1 sendo o mais frequente nas regiões predeterminadas do estômago avaliada genótipo [8].

em ambos os grupos estudados, encontramos H. cepas pylori
que estavam untypeable para o sinal de sequência e no meio da região alelos devido à variação significativa no gene vacA
[8], [24]. Nós encontramos consistentemente que o cagA viajantes - e vacA
diversidade -allele foi maior no tumor, sugerindo que H. pylori
pode permanecer no tumor sem stress ambiental.

A diversidade genotípica observadas em órgãos inteiros sistemáticas e tumores no presente trabalho foi notável. A principal implicação prática desta descoberta é a necessidade de procurar um sistema de amostragem exaustiva semelhante, a fim de associar um fator de patogenicidade com a doença. Verificou-se que a associação de um único isolado derivado de uma única biópsia com doença não é suficiente, devido à natureza multistrain de H. pylori
infecção demonstrado no presente trabalho.

As limitações deste estudo estão relacionados com a sua natureza observacional e seu desenho transversal. Não podemos excluir a possibilidade de que há uma variável de confusão associada tanto com a presença do infecção por Helicobacter pylori
e que o câncer ou o status dyspeptic. Além disso, a falta de um acompanhamento longitudinal nos impede de confirmar o aparecimento sequencial dos eventos, como o desenvolvimento do cancro e da infecção inicial com a estirpe (s) de Helicobacter pylori
que acabaram por ser detectado.

declaração de conflito de interesse

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Informações de Apoio
Figura S1. .
Sequência de sinal topográfico e distribuição alelo região central do gene vacA em pacientes com e sem câncer gástrico
doi: 10.1371 /journal.pone.0003849.s001
(3,81 MB TIF)

Agradecimentos

Agradecemos Rosa Isabel Amieva-Fernández, Ana Karina Martínez-Díaz, Leonor Jacobo-Albavera e Fernando Vargas-Romero para excelente assistência técnica com a amplificação de DNA.

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