PLoS ONE: Hoge diversiteit van Vaca en cagA Helicobacter pylori genotypen bij patiënten met en zonder maagkanker

De abstracte

Achtergrond

Helicobacter pylori
wordt geassocieerd met chronische gastritis, maagzweren en maagkanker. Het doel van deze studie was om de topografische verdeling van H beoordelen. pylori
in de maag, alsmede de Vaca Kopen en cagA
genotypes bij patiënten met en zonder maagkanker.

Methodologie /voornaamste bevindingen

Drie gastrische biopten, vooraf vastgestelde gebieden geëvalueerd in 16 patiënten met maagkanker en 14 patiënten met dyspeptische symptomen. Van kankerpatiënten, werden extra biopten verkregen uit tumor centra en marges; Onder deze monsters op de aanwezigheid van H. pylori Vaca Kopen en cagA
genotypes werd geëvalueerd. Positief H. pylori
was 38% en 26% in biopten verkregen uit de maagkanker en niet-kanker groepen, respectievelijk ( p
= 0,008), en 36% in de tumor sites. Bij kankerpatiënten, vonden we een preferentiële verdeling van de H. pylori
in de fundus en corpus, dat in de niet-kanker-groep, de verdeling was uniform ( p
= 0,003). Een meerderheid van de biopten waren gelijktijdig cagA
gen-positieve en -negatieve. De fundus en corpus toonden een hogere positiviteit tarief voor de cagA
-gen in de niet-kanker-groep ( p
= 0,036). Een mengsel van cagA
gen maten was ook significant vaker voor in deze groep ( p
= 0,003). Tweeënnegentig procent van de proefpersonen bleek meer dan één Vaca
gen genotype; S1b en m1 Vaca
genotypen werden voornamelijk in de maagkanker groep. De hoogste Vaca
-genotype signaal-sequentie diversiteit werd gevonden in het corpus en 5 cm van de tumor marges.

Conclusie /Betekenis

High H. pylori
kolonisatie diversiteit, samen met de cagA
-gen, werd voornamelijk in de fundus en het corpus van de patiënten met maagkanker gevonden. Het genotype diversiteit waargenomen over systematische whole-orgel en tumor steekproef was opmerkelijk. We vinden dat er onvoldoende bewijs is om de associatie van één isolaat te ondersteunen met een specifieke ziekte, als gevolg van de multistrain aard van de H. pylori
infectie wordt in dit werk

Visum:. López-Vidal Y, Ponce-de-León S, Castillo-Rojas G, Barreto-Zúñiga R, Torre-Delgadillo A (2008) High diversiteit van Vaca Kopen en cagA Helicobacter pylori
genotypen bij patiënten met en zonder maagkanker. PLoS ONE 3 (12): e3849. doi: 10.1371 /journal.pone.0003849

Editor: Debbie Fox, The Research Institute for Children in het Children's Hospital New Orleans, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 12 mei 2008; Aanvaard: 10 november 2008; Gepubliceerd: 3 december 2008

Copyright: © 2008 López-Vidal et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidie ​​DGAPA PAPIIT-IN207302 van de Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), UC-MEXUS en CONACyT-México 47749-M. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Helicobacter pylori
is een maag-pathogeen dat bijna 50% van de wereldbevolking besmet [1]. Het wordt beschouwd de voornaamste etiologische agens van chronische actieve gastritis en wordt algemeen aanvaard als de primaire oorzaak van maagzweren; Het is ook een bekende risicofactor voor maagkanker [2]. Maag kankerontwikkeling is aangetoond dat enkele decennia overspannen, beginnend met achtereenvolgens H.
pylori infectie en de ontwikkeling van chronische actieve gastritis [3]. Glandulaire atrofie en intestinale metaplasie uiteindelijk plaatsvinden in een subgroep van patiënten en eindigen bij maagkanker [4]. H.
pylori infecties werd voorgesteld leiden tot een verhoogd relatief risico (RR) -on de orde van 8:56-opvouwen voor de ontwikkeling precancerous maagaandoeningen, vooral wanneer de infectie optreedt tijdens de kindertijd [5]. Gezien het feit dat slechts een minderheid van de H.
pylori geïnfecteerde individuen ontwikkelen deze ziekte, wordt gedacht dat de ontwikkeling van de ziekte afhankelijk is van de expressie van specifieke bacteriële virulentie genen, bijvoorbeeld cagA Kopen en VACA
[6] , die beide sterk tot expressie ongeacht de ziektetoestand van de gastheer [7], [8]. De associaties tussen de maag topografie, de genetische diversiteit van de H. pylori Vaca Kopen en cagA
genen, en de ontwikkeling van maagkanker blijven controversieel. Het doel van dit onderzoek was om de verdeling van de evaluatie van de Vaca Kopen en cagA
genotypen van H. pylori
langs de maag bij patiënten met en zonder maagkanker

Hypothese:. een hogere frequentie van H. pylori
wordt geassocieerd met vroege stadia van maagkanker.

Methods

De patiënten verwezen voor endoscopisch onderzoek wegens een vermoeden van kanker of dyspeptische symptomen werden uitgenodigd om deel te nemen aan een cross-sectionele prospectieve studie . Alle patiënten met kanker bevatten, evenals die met niet dyspepsie en /of gastro-oesofageale reflux. Uitsluitingscriteria opgenomen stollingsafwijkingen, niet-steroïde anti-inflammatoire (NSAID) inname van het geneesmiddel in de laatste 72 uur, portal hypertensie, en de aanwezigheid van lymfoom in de histologische studie.

Alle patiënten tekenden een informed consent-formulier voorafgaand aan deelname aan het onderzoek. De studie protocol werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van het Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubiran (INCMNSZ), registratienummer CIBH-1081.

Upper gastro-intestinale endoscopie werd uitgevoerd volgens een standaard techniek. Een systematische biopsie-sampling regeling als volgt gebruikt: van elke patiënt werden drie gastrische biopten verkregen uit elk van de vier locaties maag (antrum, hoekgedeelte, corpus en fundus). Van de patiënten met maagkanker, werden extra biopten verkregen van het centrum en de rand van de tumor en op een afstand van tenminste 2,5 cm van de tumor marges.

Alle pathologische monsters van patiënten met maagkanker werden beoordeeld door een ervaren patholoog en geclassificeerd volgens de indeling Lauren diffuse, darmen, of gemengd type [9]. De beschrijving van gevorderde maagkanker is gebaseerd op de classificatie Borrmann [10]. Morfologische vroege maagkanker sub-types werden geclassificeerd volgens de Japanse Endoscopy Society richtlijnen [11], [12].

H. pylori
werd gekweekt door smeren biopsie specimens op het oppervlak van het paard bloed agar platen (10% paard bloed in Casman agar base [BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA]) [8].

De chromosomale DNA werd geëxtraheerd [13], en de H. pylori 16S rRNA Kopen en cagA
gen werd PCR geamplificeerd zoals eerder beschreven [7]. De Vaca
signaalsequentie en mid-regio werden getypt door allelische type-specifieke PCR, zoals eerder beschreven door Morales et al.
[8].

cagA
variabele gebied genamplificatie. De cagA
3 'repeat regio's van de H.
pylori stammen bestudeerd in dit onderzoek werden geclassificeerd volgens hun lengte (door de aanwezigheid van een variabel aantal herhalingssequenties in het 3 'gebied van het gen). De amplificatieproducten verkregen werden ingedeeld naar grootte in drie groepen: korte (906 bp); medium (1008 bp) en lange (1110 bp), volgens Karita et al
. [14]. Amplificatie werd uitgevoerd met primers cagRV17-F 5'-acc ctg gtc ggt aat gga tta tct-3 'en cag22-R 5'-tta aga ttt ttg gaa acc acc ttt t-3', die waren ontworpen gebaseerd op sequenties teruggevonden van Genbank gebruik Alig (wetenschappelijke en educatieve software) en ClustalW (BCM Search Launcher, multiple sequence uitlijningen).

De gegevens werden geanalyseerd voor beschrijvende doeleinden gebruik te maken van relatieve frequenties en rekenkundige middelen (standaard deviatie [SD]), als veronderstelde geschikt. Vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd door χ ^{2 analyse en met Fisher-Freeman-Halton nauwkeurige test voor kruistabellen. De maagkanker groep werd vergeleken met patiënten met niet dyspepsie en /of gastro-oesofageale reflux. kankerpatiënten werden al gestratificeerd voor TNM fase 0, I of II en geavanceerde voor III of IV. De alfa-niveau werd vastgesteld op 0,05. Gezien het feit dat meerdere gelijktijdige vergelijkingen werden uitgevoerd, werd een nominale alfa-waarde correctie ingevoerd na de Bonferroni procedure. Daarom zijn wij beschouwd associaties met p
waarden tussen 0,05 en 0,01 als verdachte. In tegenstelling tot de resultaten in de p
≤0.0063 niveau redelijk significant werden beschouwd. Waarden tussen 0,01 en 0,0063 werden beschouwd als marginaal. Alle analyses werden uitgevoerd met behulp Stata statistische software (intercooler Stata 7.0 voor Windows 98/95 /NT Package, 2002) en Stat-Xact (v. 4.0.1., Cytel Software Corp., 1999).}

Resultaten

Tweeëndertig patiënten werden opgenomen in dit onderzoek. Gebaseerd op endoscopische diagnose, 18 werden ingedeeld in de maagkanker groep en 14 in de niet-kankergroep. Door histologisch bewijs van gastrische lymfomen echter twee patiënten in de maagkanker groep moest worden uitgesloten, waardoor 16 mensen in die groep. De gemiddelde leeftijd van de patiënten in de maagkanker en dyspeptische groepen was 57,6 ± 16,7 jaar (56% mannelijk) en 47,2 ± 13,3 jaar (14% mannelijk), respectievelijk. Tien patiënten (63%) vertoonden een diffuse tumor volgens de Lauren indeling. Vijf patiënten hadden vroege maagkanker (type I, drie, II, een, IIB, een) en 11 hadden gevorderde maagkanker (type IIIA, vier, IIIB, drie, IV, vier), volgens de Japanse Research Society for maagkanker richtlijnen en de Borrmann indeling.

In onze 411 biopsie monsters, H. pylori
werd geïdentificeerd door een kweek of PCR in 38% (78/203) van de biopsie monsters van de groep maagkanker, 26% (54/208) van de niet-kanker groep ( p
= 0,008) en 36% (40/110) van de tumorplaatsen (zie tabellen 1 en 2). H. pylori
toonde een differentiële topografische distributie bij patiënten met maagkanker, met een hoger percentage positieve in de fundus en corpus ( p
= 0,003), tabel 1. De niet-kanker groep toonde geen verschil topografische distributie . Een iets hoger positiviteit van H. pylori
werd gevonden in de tumor plaatsen door de cultuur of de tumor marges door PCR; echter deze verhogingen van positiviteit waren niet statistisch significant (Tabel 2). Er was geen significante correlatie tussen de H. pylori
percentage positieve en TNM kanker stadium (vroeg versus laat).

We hebben H. pylori-cagA
positiviteit in 72% van de monsters van de maag maagkanker groep 73% van de niet-kanker groep ( p
= NS) (Tabel 3) en 83% van de tumor sites ( p
= niet significant [NS]). De H. pylori-cagA
topografische distributie was niet statistisch significant in de maagkanker-groep, terwijl de niet-kanker-groep toonden een hoger percentage positieve in de fundus en corpus; Maar de betekenis van deze bevinding is twijfelachtig ( p
= 0,036) (tabel 3). Nogmaals, in de tumor sites, vonden we geen significante distributie patroon voor de cagA
positiviteit fractie, noch was er een verschil tussen patiënten met vroege en gevorderde maagkanker.

Eenentachtig H. pylori
stammen werden onderzocht (80 cagA
+), met inbegrip van 46 stammen van patiënten met maagkanker en 35 uit niet-kankerpatiënten. Slechts twee cagA
gen maten werden verkregen uit de 80 H. pylori
stammen bestudeerd; geen van de langere cagA
sequenties werden gevonden. In beide groepen, de kortere cagA
was de meest frequent waargenomen. De resultaten zijn samengevat in Tabel 4. Interessant zowel cagA
afmetingen werden geamplificeerd uit 12 (15%) stammen, hetgeen suggereert dat deze patiënten werden tezamen geïnfecteerd met meerdere H. pylori
stammen. Deze bevinding werd vaker verkregen in de niet-kanker patiëntengroep (28,6%) dan in de maagkanker groep (4,4%) ( p
= 0,003).

De overheersende genotype signaalsequentie bij patiënten met maagkanker, aanwezig in 39% van de groep was S1b. De S1b /s2 combinatie was aanwezig bij 20% van de groep en s2 was aanwezig bij 12%. Zestien procent van de patiënten met maagkanker had een niet-identificeerbaar signaalsequentie (s0). Er was geen statistisch significant distributie van Vaca
genotypen over de buik ( p
= NS) (zie figuur 1). De meest voorkomende VACA
genotype in de niet-kanker groep S1b, aanwezig in 59% van de groep, gevolgd door de S1A /S1b combinatie 11%, S1A /S1b /s2 7%, en een niet-identificeerbaar signaalsequentie in 9% ( p
= 0,06), Figuur 1. Analyse van de topografische genotype verdeling bleek dat genotype S1b van Vaca
was overheersend in alle zones (fundus, corpus , hoekgedeelte en antrum) van de maag in beide groepen onderzocht (figuur S1). We vonden een afzonderlijke en marginaal significant verschil in het verspreidingspatroon van deze genotypes tussen kanker en niet-kanker groepen ( p
= 0,01). Zowel het corpus en fundus van de maag kankergroep vertoonde een grotere diversiteit aan signaal-sequentie genotypes, net als het corpus van de niet-kanker-groep (figuur S1).

De meest voorkomende VACA
genotypen voor elk van de tumorplaatsen (midden en rand van de tumor en tenminste 2,5 cm van de tumor marges) waren S1b en s2, dat in 19% was; S1A /S1b en S1b /s2 waren elk aanwezig in 17%, en S1 A /S1b /2, S1 A /s2, en s0 waren aanwezig bij 8%. Er was geen significant verband tussen het genotype en tumorplaats nabijheid (Figuur 2). De verspreiding van dit genotype in tumor en anatomische plaatsen bij kankerpatiënten was niet statistisch significant ( p
= 0,06) (figuren 1 en 2). Een significant verband ( p
= 0,02) tussen genotype en tumor stadium werd geïdentificeerd: S1 A /S1b, S1A /S1b /s2, en S1b /s2 genotypes waren overheersend in de vroege maagkanker groep, terwijl S1b, s2 en S1A /s2 genotypen relatief overvloedig in de gevorderde maagkanker groep (figuur 3).

de meest voorkomende middengebied genotype bij patiënten met maagkanker was m1, aanwezig in 44% van de patiënten was gevolgd door m0 (untypeable genotype) in 26%, 21% in m2 en de m1 /m2 combinatie 10% (figuur 1). In de niet-kanker-groep, de meest voorkomende VACA
genotype m1, aanwezig in 52% van de patiënten was, gevolgd door m0 in 32%, de m1 /m2 in combinatie 11%, en in m2 5%; Er was een duidelijk verdelingspatroon van deze genotypes met een twijfelachtige significantieniveau ( p
= 0,03) (Figuur 1). Analyse van de topografische verdeling over anatomische zones van het middengebied genotype bleek dat de m1 genotype was voornamelijk (50%) in het hoekgedeelte, de overige in de fundus (48%) en het corpus (42%). M0 genotype was overwegend antrum (39%) in de groep maagkanker (figuur S1). In de niet-kanker-groep, de m1 genotype was het meest overvloedig in de fundus (77%); 56% was in het corpus en 43% was in het antrum. De m0 genotype werd gedetecteerd in het hoekgedeelte (62%), zonder significant verschil tussen de studiegroepen (figuur S1). Een nagenoeg gelijkmatige verdeling van de verschillende genotypen werd gevonden in de tumorplaatsen, (figuur 2). Er was geen verschil tussen anatomische zones en tumorplaatsen bij patiënten met maagkanker (figuur 1 en 2) of tussen de vroege en gevorderde tumoren (figuur 3).

Tabel 5 toont de analyse van de afzonderlijke VACA
genotypen gevonden binnen elk individu voor wie meer dan één biopsie werd bestudeerd. Tweeënnegentig procent (12/13) van de kankerpatiënten meer dan één genotype aanwezig. Een vergelijkbare bevinding werd waargenomen in de niet-kankergroep. Drie thema's in de niet-kanker-groep was altijd positief voor de cagA
gen, en nog eens drie beide types (positieve en negatieve) bezat tegelijk. In de kanker groep zes mensen waren positief voor cagA
en zeven voor beide soorten. Geen proefpersonen waren consistent negatief voor dit gen. Figuur 4 toont het aantal biopten per individu en het aantal verschillende Vaca
gen signaal segment (SS) genotypen. Het laagste aantal genotypes bij patiënten met 10 of meer biopten was twee, en de hoogste was vijf

Discussie

De huidige studie resulteerde in vier belangrijke bevindingen:. Eerste, H. pylori
wordt gelijkmatig verdeeld over de maag bij patiënten die alleen dyspeptische symptomen; tweede, H. pylori
heeft een voorkeur voor de fundus en het corpus bij patiënten met maagkanker; derde, bij patiënten met dyspeptische symptomen, H. pylori-cagA
heeft een preferentiële verdeling in de fundus en corpus en er is een hoge frequentie van gemengde cagA
maten; vierde, de S1b genotype overheersend was in beide studiegroepen, en de S1 A genotype alleen aanwezig in de dyspeptische groep was.

De hoge H. pylori
positiviteit in de fundus van de patiënten met maagkanker kan zijn geweest vanwege de nabijheid van het corpus, een zone die wordt gekoloniseerd in H. pylori
geïnduceerde gastritis. Corpus-predominant atrofie of het verlies van gespecialiseerde glandulaire celtypen zoals pariëtale en chief cellen, lijkt cruciaal belang voor de progressie van kanker [15] zijn, en het is waarschijnlijk dat de fundus is betrokken voor of na het corpus is bezet in kanker.

Een relatief hoge positiviteit voor H. pylori
werd gevonden op de tumor-terrein, ondanks eerdere verklaringen dat H. pylori
kan ontwikkelen verschraalde mucosa en de intestinale metaplasie een ongunstige milieu [16]. Tang et al.
Echter gesuggereerd dat H. pylori
kunnen overleven in de maag epitheel in aanwezigheid van een carcinogeen letsel [17]. Ook is gespeculeerd dat bepaalde virulentiefactoren belangrijke rol kunnen spelen in het voortduren van H. pylori
in het maagslijmvlies [18].

In de huidige studie, zagen we dat de H. pylori
toont soortgelijke kolonisatie van de anatomische regio van de maag en tumorplaats. H. pylori
positiviteit in de vroege en gevorderde maagkanker groepen bleek ook zeer vergelijkbaar te zijn; Tang et al
., Echter, observeerde de omgekeerde resultaten [17]. Wij geloven dat het verschil waargenomen tussen de twee studies is door het aantal biopsieën onderzocht bij elke patiënt; we aangetoond dat een systematische bemonstering wijzigt de associatie van H. pylori hotels met ziekte.

Een hogere prevalentie van H. pylori cagA
gen-positiviteit werd gevonden in het corpus en fundus van patiënten met dyspepsie. Eerder, Semino-Mora et al
. bleek dat dit patroon niet in patiënten met maagkanker [19], hoewel we een ander cagA
amplificatiefragment toegepast in het onderhavige werk. Gastric neoplastische transformatie wordt opgewekt en in stand gehouden, ten minste gedeeltelijk, door de In vivo
intracellulaire cagA
meningsuiting; Daartoe zou een rol niet alleen tijdens de vroege maagkanker spelen, maar op basis van onze gegevens kunnen later ook in deze werkwijze [19]. We vonden dat 15% van de stammen bezaten een mengsel van cagA
3 herhalingen gebied afmetingen, suggereert de aanwezigheid van co-infectie met verschillende H. pylori
stammen, vooral in de niet-kanker-groep. Kidd et al
verkregen verschillende resultaten.; terwijl deze auteurs onderzocht een groter aantal patiënten [20], bestudeerden we een groter aantal gastrische biopten waarvan opgenomen aantal specifieke plaatsen in het maag.

We eerder waargenomen aanwezigheid van genetische diversiteit in de maagzweer corpus [8]. Deze diversiteit is voorgesteld om de synergetische acties die bij dit proces [21] geven. De overheersende Vaca
genotype signaalsequentie gedetecteerd in beide studiegroepen was S1b, in overeenstemming met onze vorige verslag [22].

De belangrijkste bevindingen van deze studie zijn dat er een topografische verdeling van VACA
signaalsequentie, het genotype S1b wordt vaak geassocieerd met de niet-kanker groep en S1b /s2 combinatie of genotypen s2 liggen uitsluitend de maagkanker groep. Geen eerdere studies over personen met maagkanker hebben de vier tumor zones geëvalueerd in het huidige werk beschouwd. De S1c genotype bleek het meest voorkomende genotype in Azië; echter, de associatie met maagkanker afneemt [22], [23]. De diversiteit van de Vaca
genotype van H. pylori
werd verklaard door een co-evolutie model [21].

Ten aanzien van Vaca
mid-regio allelen, vonden we M1 en M2 genotypes, in beide bestudeerde groepen, met m1 genotype het meest frequent in de vooraf bepaalde regio's van de geëvalueerde maag [8].

in beide onderzochte groepen, vonden we H. pylori
stammen die untypeable voor de signaal-sequentie en mid-regio allelen waren het gevolg van aanzienlijke variatie in de Vaca
gen [8], [24]. We consequent vonden dat de cagA
- en Vaca
-allele diversiteit groter was in de tumor, wat suggereert dat H. pylori
kunnen in de tumor, zonder belasting van het milieu blijven.

De genetische diversiteit waargenomen over systematische hele organen en tumoren in het huidige werk was opmerkelijk. De belangrijkste praktische implicatie van deze bevinding is de noodzaak om te zoeken naar een soortgelijke uitputtende bemonsteringsschema om een ​​pathogene factor associëren met de ziekte. We vonden dat de associatie van één isolaat-afgeleid van een biopsie-met ziekte niet voldoende is vanwege de aard van multistrain H. pylori
besmetting aangetoond in het huidige werk.

De beperkingen van dit onderzoek hebben betrekking op de observationele aard en de cross-sectionele design. We kunnen de mogelijkheid dat er een verstorende variabele bij zowel de aanwezigheid van de Helicobacter pylori
infectie en de kanker of dyspeptische toestand niet uitsluiten. Bovendien, het ontbreken van een longitudinale follow-up verhindert ons bevestiging van de sequentiële weergave van de gebeurtenissen, zoals de ontwikkeling van kanker en de eerste infectie met de stam (stammen) van Helicobacter pylori
die werden uiteindelijk gedetecteerd.

belangenconflict statement

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Ondersteunende informatie
Figuur S1. .
Topografische signaalsequentie en middengebied allel distributie van de Vaca-gen bij patiënten met en zonder maagkanker
doi: 10.1371 /journal.pone.0003849.s001
(3.81 MB TIF)

Dankwoord

Wij danken Rosa Isabel Amieva-Fernández, Ana Karina Martínez-Díaz, Leonor Jacobo-Albavera en Fernando Vargas-Romero voor een uitstekende technische bijstand met het DNA-amplificatie.

• PLoS ONE: hypoxia-induceerbare factor 1α Bepaalt maagkanker chemogevoeligheid via modulatie van p53 en NF-κB
• PLoS ONE: intratumorale heterogeniteit van de HER2, FGFR2, CMET en ATM bij maagkanker: het optimaliseren van gepersonaliseerde gezondheidszorg door middel van innovatieve Pathologische and Statistical…