PLoS ONE: высокое разнообразие Вака и CagA Helicobacter Pylori генотипов у больных с и без Желудочный Cancer

Абстрактный

Фон

хеликобактерной
связано с хроническим гастритом, пептической язвы и рака желудка. Цель данного исследования состояла в том, чтобы оценить топографическое распределение H. пилори
в желудке, а также Вака
и CaGa
генотипов у больных с и без рака желудка.

Методология /Основные выводы
<р> Три биопсию желудка, из заранее определенных регионов, были оценены у 16 ​​пациентов с раком желудка и 14 больных с симптомов диспепсии. От онкологических больных, дополнительные образцы биопсии были получены от опухолевых центров и полей; Среди этих образцов, наличие H. пилори Вака
и CaGa
генотипов оценивали. Положительная H. пилори
составила 38% и 26% в биоптатах, полученных от рака желудка и нераковых групп, соответственно (<ЕМ> р
= 0,008), и 36% в опухолевых участков. У больных раком, мы обнаружили предпочтительное распределение H. пилори
в глазном дне и тела, в то время как в группе без рака, распределение было равномерным ( р
= 0,003). Большинство биопсий были одновременно CaGa
ген-положительных и -отрицательное. Дно и корпус продемонстрировал более высокую скорость передачи положительности CaGa
гена в группе без рака ( р
= 0,036). Смесь CaGa
размеров генов также значительно чаще в этой группе ( р
= 0,003). Девяносто два процента всех испытуемых показали более одного Вака
гена генотип; s1b и m1 Вака
генотипы были преимущественно в желудочном группе рака. Самый высокий Вака
разнообразие -genotype сигнала последовательность была обнаружена в корпусе и 5 см от краев опухоли.

Заключение /Значение
<р> High H. Pylori
колонизация разнообразие, наряду с CaGa
ген был обнаружен преимущественно в глазном дне и своде больных раком желудка. Разнообразие генотип наблюдается через систематического целого органа и опухоли выборки было замечательно. Мы считаем, что нет достаточных доказательств, подтверждающих ассоциацию одного изолята с конкретным заболеванием, в связи с multistrain природы H. Pylori
инфекция В этой работе показано
<р> Образец цитирования:. Лопез-Видаль Y, Понс-де-Леон S, Кастильо-Рохас G, Баррето-Суньига R, Торре-Delgadillo A (2008) высокое разнообразие Вака
и CagA Helicobacter Pylori
генотипов у больных с и без рака желудка. PLoS ONE 3 (12): e3849. DOI: 10.1371 /journal.pone.0003849
<р> Редактор: Дебби Фокс, Научно-исследовательский институт по делам детей в детской больнице Нью-Орлеан, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 12 мая 2008 года; Принято: 10 ноября 2008 года; Опубликовано: 3 декабря, 2008
<р> Copyright: © 2008 López-Видал и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование финансировалось за счет гранта DGAPA PAPIIT-IN207302 из Национального автономного университета Мексики (УНАМ), UC-MEXUS и КОНАСИТ-México 47749-M. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение

хеликобактерной
является желудочный патоген, который инфицирует около 50% населения мира [1]. Он считается основным возбудителем хронического активного гастрита и, как правило, принимается в качестве основной причины язвенной болезни; он также является известным фактором риска развития рака [2] желудка. Развитие рака желудка было продемонстрировано, чтобы охватывать несколько десятилетий, начиная последовательно H. Pylori
инфекции и развитие хронического активного гастрита [3]. Железистые атрофии и кишечной метаплазии в конечном итоге происходит в подгруппе пациентов и оканчиваются рака желудка [4]. H. Pylori
инфекции было предложено привести к увеличению относительного риска (ОР) -он порядка четырех до девяти откидные для развития предраковых желудка условий, особенно, когда заражение происходит в детском возрасте [5]. Учитывая, что лишь меньшинство H. Pylori
-infected люди развивают эту болезнь, полагают, что развитие болезни зависит от экспрессии специфических генов вирулентности бактерий, например, CaGa
и Вака
[6] , оба из которых экспрессируется на высоком уровне, независимо от состояния заболевания хозяина [7], [8]. Ассоциации между топографии желудка, генотипическая разнообразие H. пилори Вака
и CaGa
генов, а также развитие рака желудка остаются спорными. Целью настоящего исследования было оценить распределение Вака
и CaGa
генотипы H. пилори
вдоль желудка у больных с и без рака желудка
<р> Гипотеза:. более высокая частота H. пилори
связано с ранними стадиями рака желудка.

методы
<р> Пациенты, указанные для эндоскопического исследования в связи с подозрением на рак или диспептических симптомов были приглашены принять участие в поперечном сечении проспективного исследования , У всех больных с раком были включены, а также тех, с неязвенной диспепсии и /или желудочно-пищеводного рефлюкса. Критерии исключения аномалий коагуляция, нестероидные противовоспалительные (НПВС) потребление наркотиков в течение последних 72 часов, портальной гипертензии, а также наличие лимфомы в гистологического исследования.
<р> Все пациенты подписали письменное формы информированного согласия до участия в исследовании. Протокол исследования был одобрен Советом по Institutional рассмотрению действия Instituto Nacional де Ciencias Medicas у Nutrición Сальвадор Zubirán (INCMNSZ), регистрационный номер CIBH-1081.
<Р> верхних отделов желудочно-эндоскопию проводили по стандартной методике. Систематический схема биопсии выборки была использована следующим образом: у каждого пациента, три были получены желудочные биопсии из каждого из четырех участков желудка (антрального, угловой части, корпус, и глазного дна). Из пациентов с раком желудка, дополнительные образцы биопсии были получены из центра и края опухоли и на расстоянии не менее 2-5 см от краев опухоли.
<Р> Все патологические образцы от больных раком желудка были оценены одним опытным патологоанатомом и классифицированы в соответствии с классификацией Lauren как диффузные, кишечника, или смешанного типа [9]. Описание прогрессирующего рака желудка было основано на классификации борманновской [10]. Морфологические ранних стадий рака желудка подтипы были классифицированы в соответствии с директивами Японский эндоскопии общества [11], [12].

H. пилори
культивировали смазывая биопсии на поверхности чашек с агаром лошадиной крови (10% лошадиной крови в агара базе Casman [BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA]) [8].
<р> Хромосомные ДНК экстрагировали [13], и H. пилори 16S рРНК
и ген CagA
был ПЦР-амплификации, как описано ранее [7]. Вака
сигнальной последовательности и средней области были набраны аллельного типа специфической ПЦР, как описано ранее Morales и др.
[8].

CaGa
гена вариабельной области усиления. В CaGa
3 'Repeat регионы H. Pylori
Исследованные штаммы в данном исследовании были классифицированы в соответствии с их длиной (из-за наличия переменного числа повторяющихся последовательностей в 3'-области гена). Продукты амплификации, полученные были классифицированы по размеру в одну из трех групп: короткая (906 п.н.); средний (1008 пар оснований), и длинные (1,110 б.п.), в соответствии с Карита и др
. [14]. Амплификацию проводили с использованием праймеров cagRV17-F 5'-Acc CTG GTC GGT ААТ GGA TTA TCT-3 'и cag22-R 5'-TTA Aga TTT TTG GAA Acc согласно ТТТ Т-3', который конструировали на основе последовательности, извлекаемые от Genbank использованием Alig (научного и образовательного программного обеспечения) и ClustalW (BCM Search Launcher, множественное выравнивание последовательностей).
<р> Данные были проанализированы для описательных целей с использованием относительных частот и средние арифметические (стандартное отклонение [SD]), так как считается подходящее. Сравнения между группами были выполнены х ^{2 анализа, а также с Fisher-Freeman-Хэлтон точный тест для таблиц сопряженности. Желудочный группа рак по сравнению с пациентами с неязвенной диспепсии и /или желудочно-пищеводного рефлюкса. Раковые больные были разделены еще на стадии TNM 0, I или II и III передовые для или IV. Уровень альфа был установлен на уровне 0,05. Учитывая, что было проведено несколько одновременных сравнения, коррекция номинальной альфа-значение было введено после процедуры Бонферрони. Следовательно, мы считали ассоциации с значений р
от 0,05 до 0,01 в качестве подозреваемого. В отличие от этого, результаты на р
≤0.0063 уровня считались достаточно значительными. Значения между 0,01 и 0,0063 считались маргинальными. Все анализы были выполнены с использованием Stata статистического программного обеспечения (Intercooled Stata 7.0 для Windows 98/95 /NT пакета, 2002) и Stat-Xact (ст. 4.0.1., Cytel Software Corp., 1999).}

Результаты
<р> Тридцать два пациента были включены в данное исследование. На основании эндоскопической диагностики, 18 были классифицированы в желудочную группу и 14 рака в группе без рака. Благодаря гистологического доказательства лимфомой желудка, однако, у двух пациентов в группе рака желудка должны были быть исключены, в результате чего 16 человек в этой группе. Средний возраст пациентов в рак желудка и диспепсическими группы составил 57,6 ± 16,7 лет (56% мужчин) и 47,2 ± 13,3 лет (14% мужчин), соответственно. Десять пациентов (63%) наблюдались диффузные опухоли по классификации Lauren. Пять пациентов имели ранний рак желудка (тип I, три, II, один, IIB, один) и 11 имели раком желудка (тип IIIA, четыре, IIIB, три, IV, четыре), по данным Общества исследования японского рака желудка руководящие принципы и классификация Бормана.
<р> В наших образцах биопсии 411, H. пилори
был идентифицирован любой культуры или ПЦР в 38% (78/203) образцов биопсии из желудка группы по изучению рака, 26% (54/208) из группы неонкологического ( P
= 0,008), и 36% (40/110) опухолевых участков (таблицы 1 и 2). H. пилори
продемонстрировала дифференциальную топографическую распределение у пациентов с раком желудка, с более высокой частотой положительности в глазном дне и тела ( р
= 0,003), таблица 1. Группа нераковых не показали дифференциальное распределение топографическую , Несколько выше положительность H. пилори
был найден в опухолевых сайтах по культуре или в опухолевых полях методом ПЦР; Тем не менее, эти увеличение положительности не были статистически значимыми (Таблица 2). Там не было никакой существенной корреляции между H. пилори
скорость положительность и стадии рака TNM (рано против поздно).
<р> Найдено H. Pylori-CaGa
позитивности в 72% образцов желудочного из желудка группы рака, 73% пациентов из группы неонкологического ( р
= NS) (таблица 3), и 83% опухоли сайты ( р =
не имеет существенного значения [NS]). H. Pylori-CaGa
топографическую распределение не было статистически значимым в рака желудка-группе, в то время как группа нераковых продемонстрировал более высокую скорость положительности в глазном дне и тела; Тем не менее, значение этой находки сомнительна ( р
= 0,036) (таблица 3). Опять же, в опухолевых участках, мы не обнаружили существенной картины распределения для CaGa
положительности фракции, и не было разницы между пациентами с ранним и распространенным раком желудка.
<Р> Восемьдесят один H. Были изучены штаммы пилори
(80 CaGa
+), в том числе 46 штаммов от больных раком желудка и 35 из пациентов без рака. Только два CaGa
размеры генов были получены из 80 H. штаммы пилори
изучены; ни один из более CaGa
последовательности не были найдены. В обеих группах, тем короче CaGa
был наиболее часто обнаруживаемых. Результаты приведены в таблице 4. Интересно, что и CaGa
размеры амплифицировали из 12 (15%) штаммов, предполагая, что эти пациенты были коинфицирован разным H. Pylori
штаммов. Этот вывод был получен чаще в неонкологического группе пациентов (28,6%), чем в желудочном группе рака (4,4%) ( р
= 0,003).
<Р> Преобладающей сигнальной последовательности генотипа у пациентов с раком желудка, присутствующих в 39% в группе, был s1b. Комбинация s1b /s2 присутствовал в 20% в группе и s2 присутствовал в 12%. Шестнадцать процентов больных раком желудка у Нераспознанная сигнальной последовательности (s0). Там не было никакого статистически значимого распределения Вака
генотипов через желудок ( р
= NS) (рисунок 1). Наиболее частой <ЕМ> вача
генотип в группе неонкологического был S1B, которая присутствовала в 59% в группе, а затем с помощью комбинации S1A /s1b в 11%, S1A /s1b /с2 в 7%, и неясный сигнальной последовательности в 9% ( р
= 0,06), Рисунок 1. Анализ топографического распределения генотипов показал, что генотип S1B из Вака
преобладала во всех зонах (фундус, корпус , угловая часть, и антрального отдела) желудка в обеих исследуемых группах (рис S1). Мы нашли четкую и незначительно существенное различие в моделях распределения этих генотипов между раком и нераковых групп ( р
= 0,01). Оба тела и дна желудка в желудке группы рака проявляли большее разнообразие генотипов сигнал последовательности, как и корпус в группе без рака (рис S1).
<Р> Наиболее частой Вака <бр> генотипы для каждой из опухолевых участков (центр и край опухоли, а также по меньшей мере, 2-5 см от краев опухоли) были s1b и S2, которые присутствовали в 19%; S1A /s1b и s1b /s2 были каждый присутствует в 17%, и S1A /s1b /2, S1A /с2 и s0 присутствовали в 8%. Там не было никакой значимой связи между генотипом и опухолевой близости (рисунок 2). Распределение этого генотипа в опухолевых и локализаций у пациентов с раком не было статистически значимым ( р
= 0,06) (Рисунки 1 и 2). Статистически значимая связь ( р
= 0,02) между генотипом и опухолевой стадии был идентифицирован: S1A /s1b, S1A /s1b /с2 и s1b /s2 генотипы преобладали в начале желудка группы рака, в то время как s1b, s2 и S1A /s2 генотипы были относительно распространены в продвинутой группе рака желудка (рисунок 3).
<р> наиболее частые области среднего генотипа у больных раком желудка был m1, которая присутствовала у 44% больных с последующим m0 (untypeable генотипа) в 26%, м2 в 21%, а также комбинации м1 /м2 в 10% (рисунок 1). В группе без рака, наиболее часто Вака
генотип m1, которая присутствовала у 52% больных, а затем m0 в 32%, в м1 /м2 в комбинации 11%, а м2 5%; была четкая картина распределения этих генотипов, с сомнительным уровнем значимости ( р
= 0,03) (Рисунок 1). Анализ топографического распределения по анатомическим зонам середине области генотипа показал, что m1 генотип преимущественно (50%) в угловой части, с оставшимися в глазном дне (48%) и корпус (42%). M0 генотип был преимущественно в антральном отделе (39%) в желудочном группы по изучению рака (рис S1). В группе без рака, то m1 генотип был наиболее распространенным на глазном дне (77%); 56% было в корпусе, а 43% было в антральном. M0 генотип был обнаружен в угловой части (62%), без статистически значимой разницы между исследовательскими группами (рис S1). Почти равномерное распределение различных генотипов были найдены в опухолевых участках, (рисунок 2). Там не было никакой разницы между анатомических зон и опухолевых участков у пациентов с раком желудка (рис 1 и 2) или между ранними и запущенными опухолями (рисунок 3).
<Р> Таблица 5 показывает анализ отчетливой Вака
генотипы найдены внутри каждого человека, для которых был изучен более одной биопсии. Девяносто два процента (12/13) больных раком имели более одного генотипа настоящего. Аналогичный вывод наблюдалась в группе без рака. Три субъектов в группе неонкологического были последовательно положительным для CaGa
гена, а еще три обладали оба типа (положительные и отрицательные) одновременно. В группе рака, шесть человек были положительными CaGa
и семь для обоих типов. Нет предметы не были последовательно отрицательными для этого гена. Рисунок 4 отображает количество биопсий на одного человека, а число различных Вака
сегмент сигнала гена (SS) генотипов. Наименьшее количество генотипов у больных с 10 или более биопсий было два года, а самый высокий был пять

Обсуждение
<р> Настоящее исследование привело к четырем основным выводам:. Во-первых, H. пилори
равномерно распределяется по всему животу у пациентов, имеющих только симптомы диспепсии; во-вторых, H. пилори
отдает предпочтение глазного дна и корпуса у больных раком желудка; В-третьих, у больных с симптомов диспепсии, Н. пилори-CaGa
имеет преимущественное распределение в глазном дне и корпус, и существует высокая частота смешанных CaGa
размеры; в-четвертых, s1b генотип преобладает в обеих группах, а S1A генотип присутствовал только в диспептического группе.
<р> Высокий H. Pylori
позитивности в глазном дне пациентов с раком желудка, может быть из-за своей близости к своду, зона, которая колонизирована в H. пилори
-индуцированное гастрит. Корпус-преобладающий атрофия, или потеря специализированных железистых типов клеток, таких как теменной и главных клеток, по-видимому, является критическим для прогрессирования рака [15], и вполне вероятно, что глазное дно участвует либо до, либо после того, как корпус является уже занимается рак.
<р> относительно высокая положительности для H. пилори
был найден на опухоль-сайте, несмотря на предыдущие заявления, H. пилори
не может развиваться в атрофированном слизистой оболочки и что кишечная метаплазия является неблагоприятным среда [16]. Тан и др.
, Однако, предположил, что H. пилори
мог выжить в желудочном эпителии в присутствии канцерогенного поражения [17]. Он также предположил, что некоторые факторы вирулентности могут играть важную роль в связи с сохранением H. пилори
в слизистой оболочке желудка [18].
<р> В настоящем исследовании мы обнаружили, что H. пилори
демонстрирует аналогичную колонизацию анатомических областей сайта желудка и опухоли. H. Pylori
позитивности в ранних и поздних желудочных групп рака было также установлено, что очень похожи; Тан и др
., Однако, наблюдается обратные результаты [17]. Мы полагаем, что наблюдаемая разница между этими двумя исследованиями связано с числом биопсий изученных у каждого пациента; мы показали, что систематический отбор изменяет ассоциацию H. пилори
с болезнью.
<р> Более высокая распространенность H. пилори CagA
ген-позитивности был найден в тела и дна желудка пациентов, страдающих от диспепсии. Ранее Semino-Mora и др
. показали, что эта модель не присутствует у пациентов с раком желудка [19], хотя мы использовали другой CaGa
фрагмент амплификации в настоящей работе. Желудочный неопластическая трансформация индуцируется и поддерживается, по крайней мере частично, В естественных условиях
внутриклеточная CaGa
выражение; этот эффект может играть роль не только на ранних стадиях канцерогенеза желудка, но, основываясь на наших данных, также может произойти позднее в этом процессе [19]. Мы заметили, что 15% штаммов обладали смесь CaGa
3 'повторить размеры региона, что предполагает наличие сочетанной инфекции с многократными H. пилори
штаммы, в основном, в группе без рака. Кидд и др
получены различные результаты. в то время как эти авторы изучали большее количество пациентов [20], мы изучили большее количество желудочных биопсий из которых включал в себя несколько специфических сайтов в желудке.
<р> Ранее мы наблюдали наличие генотипической разнообразия в язвенной корпус [8]. Это разнообразие было предложено, чтобы отразить синергического действия, которые связаны с этим процессом [21]. Преобладающий Вака
последовательность генотип сигнала обнаружена в обеих исследуемых группах была s1b, в соответствии с нашим предыдущим докладом [22].
<Р> Важные результаты нашего исследования, что есть топографические распределение кнопку Вака
сигнал последовательности, то s1b генотип обычно ассоциируется с группой неонкологического и s1b /комбинации s2 s2 или генотипов встречаются исключительно в желудочном группе рака. Ни одна из предыдущих исследований по пациентов с раком желудка не рассмотрели четыре зоны опухоли оцениваемых в данной работе. S1C генотип оказался наиболее распространенным генотипом в Азии; Тем не менее, его связь с раком желудка уменьшается [22], [23]. Разнообразие Вака
генотипа H. пилори
было объяснено с помощью модели коэволюции [21].
<р> Что касается Вака
середине область аллели, мы нашли m1 и m2 генотипы, в обеих исследуемых группах, с m1 генотип является наиболее частым в заданных областях оцениваемой желудка [8].
<р> в обеих исследованных группах, мы обнаружили, H. Pylori
штаммы, которые были untypeable для сигнала последовательности и среднего региона аллели в связи с существенным изменением Вака
гена [8], [24]. Мы последовательно нашли, что CaGa
- и Вака
-allele разнообразие было больше в опухоли, предполагая, что H. пилори
может оставаться в опухоли без нагрузки на окружающую среду.
<р> генотипическая разнообразие наблюдается через систематические целых органов и опухолей в данной работе было замечательно. Основным Практическим следствием этого вывода является необходимость поиска аналогичной исчерпывающей схеме выборки для того, чтобы ассоциировать фактор патогенности с болезнью. Мы обнаружили, что объединение одного изолята, полученных из одной биопсии, с заболеванием не является достаточным вследствие multistrain природы H. Pylori
инфекции продемонстрировано в данной работе.
<р> Ограничения данного исследования связаны с его наблюдательной природы и ее конструкции поперечного сечения. Мы не можем исключить возможность того, что существует Поразительным переменная связана как с наличием хеликобактерной
инфекции и рак или диспептических статуса. Кроме того, отсутствие продольного наблюдения не позволяет нам подтверждать последовательное появление событий, как развитие рака и первичной инфекции с штамма (ов) хеликобактер пилори
, что в конечном итоге были обнаружены.

Заявление о конфликте интересов

авторы заявляют нет конфликта интересов.

поддержка данных Рисунок S1
. .
Топографическая сигнальной последовательности и средняя область распространения аллеля гена Вака у пациентов с и без рака желудка
DOI: 10.1371 /journal.pone.0003849.s001
(3.81 MB TIF)

Подтверждения
<р> Мы благодарим Роза Изабель Amieva-Фернандес, Ана Карина Мартинес-Диас, Леонор Jacobo-Albavera и Фернандо Варгас-Ромеро за отличную техническую помощь с амплификации ДНК.

• PLoS ONE: Гипоксия-Индуцибельная фактор 1α Определяет рак желудка химиочувствительность с помощью модуляции р53 и…
• PLoS ONE: Intra-Опухолевый Неоднородность HER2, FGFR2, CMET и ATM в рака желудка: Оптимизация персонализированное здравоохра…