PLOS ONE: Expression Profiling de tronco genes relacionados com celular no câncer gástrico Tratada-neoadjuvante: A NOTCH2, GSK3B e β-catenina Gene assinatura Prevê Survival

Abstract

Cancro Stem Cell (CSC) assinaturas de expressão gênica baseada está associado com prognóstico em diferentes tipos de tumores e CSCs são sugeridos como sendo particularmente resistente a medicamentos. O objetivo do nosso estudo foi o primeiro, para determinar o significado prognóstico da expressão do gene relacionado com o CSC em células tumorais residuais dos doentes tratados com neoadjuvante câncer gástrico (CG). Em segundo lugar, que pretendia examinar, se as alterações de expressão de entre as amostras de tumor pré e pós-terapêuticos existir, consistente com um enriquecimento de células tumorais resistentes a drogas. A expressão de 44 genes foram analisados, em 63 espécimes embebidos em parafina de tumor fixado em formalina com regressão parcial do tumor (10-50% do tumor residual) após a quimioterapia neoadjuvante por PCR quantitativa em tempo real matrizes de baixa densidade. A assinatura do combinado GSK3B
^{alta, β-catenina (CTNNB1)
alto e NOTCH2
baixa expressão foi fortemente correlacionada com a melhor sobrevida do paciente (p < 0,001). A relevância prognóstica destes genes também foi encontrada a análise de dados de expressão de genes publicamente disponíveis. A expressão de genes foi comparada 9 entre as biópsias pré-terapêuticos e espécimes ressecados pós-terapêuticos. Um aumento de pós-terapêutico significativo em NOTCH
2, LGR5
e POU5F1
expressão foi encontrado em tumores com diferentes graus de regressão do tumor. Não foram observadas alterações significativas para a GSK3B
e CTNNB1
. A análise imuno-histoquímica demonstrou um aumento associado à quimioterapia na intensidade de coloração NOTCH2, mas não na percentagem de NOTCH2. Tomados em conjunto, o GSK3B, CTNNB1
e NOTCH2
assinatura de expressão é um romance, prometendo parâmetro prognóstico para GC. Os resultados da análise da expressão diferencial indicam um papel proeminente para NOTCH2 e resistência à quimioterapia em GC, o que parece estar relacionado com um efeito das drogas sobre a expressão NOTCH2 em vez de a um enriquecimento de células tumorais que expressam NOTCH2.}

citação: Bauer G, Langer R, Becker K, Hapfelmeier A, K Ott, Novotny A, et al. Profiling (2012) Expressão de genes relacionados Stem-Cell no câncer gástrico neoadjuvante-tratado: A NOTCH2
, GSK3B
e β-catenina
Gene assinatura prediz sobrevida. PLoS ONE 7 (9): e44566. doi: 10.1371 /journal.pone.0044566

editor: Ju-Seog Lee, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de maio de 2012; Aceito: 08 de agosto de 2012; Publicação: 10 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Bauer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado pelo Deutsche Krebshilfe Mildred Scheel Stiftung, conceda número 108.524 a GK e KB. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinomas gástrico avançado (GC) são frequentemente tratados por Platin /5-fluorouracil (5-FU) - com base quimioterapia neoadjuvante [1]. O objectivo desta terapia é, entre outros, para reduzir o tumor antes da cirurgia, para aumentar a probabilidade de ressecção completa e, assim, melhorar a sobrevivência do paciente. No entanto, as taxas de resposta são baixas, e regressão completa do tumor ou subtotal é observada em apenas 20-40% dos pacientes [1], [2]. Assim, a resistência à quimioterapia é um grande obstáculo para o sucesso do tratamento

De acordo com a hipótese de células-tronco do câncer, as células tumorais são heterogêneos, e um aumento da resistência aos medicamentos é um fenótipo particular de uma minoria de células tumorais -. A so- chamadas células iniciadoras de cancro ou células-tronco cancerosas (CSCs) [3] - [5]. Um aumento na população CSC após a quimioterapia tem sido demonstrada [6], [7], e haste assinaturas de expressão de genes à base de células foram associado com prognóstico pobre em vários tumores incluindo os carcinomas gástricos [8] - [11]. A hipótese CSC é ainda controversa discutido, mas existe evidência para a existência de CSCs em vários tipos de tumores e marcadores moleculares foram identificados que são preferencialmente encontradas nestas células [4], [5]. A activação de vias de sinalização embrionárias, tais como a Wnt, Notch e Hedgehog vias, tem sido sugerida como uma força motriz para a formação de CSCs [4], [12]. Os dados relativos à origem e existência de CSCs gástricas permanecem inconclusivos [13] - [17]. Em ratinhos, de medula óssea ou células provenientes de uma população celular específica no antro expressando Wnt a molécula alvo LGR5, têm sido associados com CSCs no estômago [17], [18]. Além disso, CD44 e CD24 têm sido sugeridos como marcadores de superfície celular específicos, mas os dados são inconsistentes [19], [20].

O protocolo de tratamento neoadjuvante para GC proporciona uma excelente oportunidade para investigar as células de tumor antes e após quimioterapia em pacientes. Neste estudo, objetivou-se elucidar primeiro lugar, se a expressão de genes putativos relacionadas com a CSC no tumor residual pós-terapêutico prediz a sobrevida do paciente e, segundo, se os genes específicos são expressos diferencialmente entre biópsias pré-terapêuticas e as amostras tumorais pós-terapêuticas , consistente com um enriquecimento de células tumorais quimioterapia resistente como previsto pelo conceito CSC. O grupo de pacientes, que demonstraram redução do tumor considerável após a quimioterapia neoadjuvante, mas ainda tinha células tumorais residuais suficientes disponíveis para análise (10-50% tumor residual) foram considerados como o grupo mais adequado para começar com uma análise de rastreio de genes relevantes prognósticos e para, em seguida, identificar diferenças relevantes na expressão genética entre as amostras pré e pós-terapêuticas tumorais. Analisando estas células tumorais residuais identificamos um padrão de expressão de genes abrangendo GSK3B, CTNNB1
e NOTCH2
, que prediz fortemente o prognóstico dos pacientes. Mostra-se que o impacto de GSK3B
e CTNNB1
para esta assinatura não é dependente de quimioterapia e, mais provavelmente, reflecte uma propriedade do tumor primário e os nossos dados sugerem ainda, que, em particular NOTCH2
pode desempenhar um papel de resistência à quimioterapia em GC.

Materiais e Métodos

Os pacientes

no total, 480 pacientes com GC localmente avançado (CT3 /4 ) foram tratados por neoadjuvante, platina /quimioterapia à base de 5-FU no Departamento de Cirurgia da Technische Universität München, entre 1991 e 2007 e foram avaliados quanto à resposta com base em um protocolo padronizado histopatológico [2] - [22]. regressão do tumor foi classificada em 3 classes: Classe de regressão do tumor (TRG) 1, o qual consiste em TRG1a (regressão total do tumor) e TRG1b (regressão do tumor subtotal: < 10% de células tumorais cama residual /tumor), TRG2 (regressão parcial do tumor: 10-50% de células de tumor residual /leito tumoral) e TRG3 (mínima ou nenhuma regressão do tumor: > 50% de tumor residual /leito tumoral). Dos 480 pacientes, 121 pacientes demonstrou TRG2 e 63 destes foram analisados ​​neste estudo. O critério de inclusão era a disponibilidade de tecido tumoral suficiente para a análise dos doentes tratados com, pelo menos, 50% da dose projectada de quimioterapia. características e protocolos de tratamento do paciente são apresentados na Tabela 1. Para confirmar a natureza representativa dos 63 pacientes analisados, a distribuição de seus parâmetros clínico foi comparada com a coorte de 121 pacientes e não houve diferença estatisticamente significativa.

Siga -up foi calculada a partir do primeiro dia de tratamento, até a data do último contacto com os pacientes. O acompanhamento médio foi de 77,1 meses (intervalo: 28,5-108,5). O ponto final clínico do estudo foi a sobrevivência global (OS), o qual foi definido como o tempo entre o primeiro dia de quimioterapia e morte por qualquer causa. O OS mediana foi de 50,9 meses (intervalo: 4,5-108,5, IC 95%: 25,6-76,3), e 37 dos 63 pacientes morreram durante o acompanhamento. Este tamanho da amostra e número de eventos são suficientemente grande para uma estimativa consistente de todos os tamanhos de efeito investigados neste estudo exploratório [23], [24].

A comparação da expressão de genes entre correspondente pré e pós-terapêutica amostras de tumor foi realizada para pacientes com TRG2 e TRG3 (cada n = 22).

para a análise imuno-histoquímica, amostras de tumores pré e pós-terapêutica de 21 pacientes com TRG1b, 21 pacientes com TRG2, 22 pacientes com TRG3 e de 16 pacientes tratados por cirurgia sozinha foram incluídos. O critério de seleção para essas análises foi a disponibilidade de correspondente biópsias pré-terapêuticos e tumores pós-terapêuticos.

Ética Declaração

O estudo eo uso de tecidos humanos foi aprovado pela revisão institucional local Conselho na Technische Universität München (referência: 2158/08), e o consentimento informado foi obtido de acordo com os regulamentos institucionais

Extração de RNA e transcrição reversa

o RNA total foi extraído de formalina-fixo,. (FFPE) tecidos embebidos em parafina após microdissecção manual das áreas tumor composto de pelo menos 50% de células tumorais. O RNA foi purificado por fenol e clorofórmio e foi transcrito de forma inversa, como descrito [25].

Gene Expression Analysis

Os 44 genes que foram selecionados para a análise com base no seu potencial papel na CSC biologia estão incluídos na Tabela 2. a expressão de genes foi analisada por PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR) em TaqMan ® matrizes de baixa densidade feitos por medida (Applied Biosystems Inc., Foster City, EUA). genes de referência apropriados foram determinadas por uma análise de genes de referência de dez candidatos em 8 carcinomas gástricos usando o geNorm-algoritmo [26]. IPO8
, POLR2A
e UBC
foram determinados como sendo os genes de referência mais adequados e normalização com base na média geométrica destes três genes foi realizada como descrito [26] . Reagentes, condições de ciclismo e software estão incluídos na informação de apoio. expressão gênica relativa foi quantificada utilizando o método ΔΔCt comparativa [27].

Imunohistoquímica

O anticorpo monoclonal NOTCH2 (C651.6DbHN) foi obtido a partir de Estudos do Desenvolvimento Hibridoma Bank (DSHB, The University of Iowa, Departamento de Biologia, Iowa City, EUA). O processo de coloração e exame da especificidade do anticorpo por transferência de Western estão descritos nas Informações Apoiar e Figura S1A.

coloração imuno-histoquímica foi marcado de forma cega por dois investigadores independentes (L. B. e R.L.). coloração citoplasmática e nuclear foi avaliada separadamente. Negativa, fraca, média ou fortes intensidades de coloração foram classificados como 0, 1, 2 e 3, respectivamente. A percentagem de células tumorais com manchado citoplasma /núcleo foi pontuada como 0 (negativa), 1 (< 10%), 2 (10 a < 50%), 3 (50 a < 80%) e 4 (≥80 %).

Análise estatística

testes de inferência condicional foram utilizados para determinar o ponto de corte valores ideais de expressão do gene para a associação com a sobrevida do paciente e determinar os valores de p apropriado para maximamente estatísticas selecionadas [28]. Os valores de expressão de genes acima ou igual ao valor ideal de corte foi definida com valores elevados de expressão e de expressão gênica abaixo do valor de cut-off foram definidos como baixa expressão. As taxas de sobrevivência foram estimadas de acordo com as curvas de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. riscos relativos foram estimados por determinar taxas de risco (HR) a partir de modelos de risco proporcional de Cox. Na análise multivariada, por etapas de seleção de variáveis ​​forward foi realizada com base em testes de razão de verossimilhança. A razão entre o número de variáveis ​​no modelo para o número de eventos foi limitado a 1:10 [24].

As comparações de variáveis ​​clinicopatológicas entre grupos foram realizadas pelo teste de Mann-Whitney-U. A χ ^{2-teste e teste exato de Fisher foram utilizados para a comparação das frequências relativas se for o caso. As diferenças estatísticas de expressões de genes entre amostras pareadas foram analisados ​​utilizando o teste de Wilcoxon.}

análise de agrupamento hierárquico não supervisionado foi realizada com software Cluster 3.0 [29] e software Java TreeView (versão 1.1.5r2) [30]. dados de expressão de mRNA relativos foram log-transformados, mediana-centrada e normalizada antes de aplicar agrupamento ligação completa com uma matriz de distância baseado na correlação de Pearson (uncentred).

Um escore de risco foi calculada pela resumindo os produtos da multiplicação o coeficiente de regressão de Cox de cada gene no modelo com os valores de expressão gênica normalizados para cada paciente, essencialmente como descrito [31] (detalhes em material e Métodos S1 e Tabelas S4 e S6).

Todos os testes estatísticos foram dois -sided e conduzido de forma exploratória com um nível de significância de 0,05, utilizando o software SPSS 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL 11,5) e R (R Foundation for Statistical Computing, Viena, Áustria).

a estudo está em conformidade com as recomendações de relatórios de estudos prognósticos marcadores tumorais (critérios OBSERVA) [32].

Análise de dados Microarray Pública

dados de matriz expressão de genes disponível publicamente de carcinomas gástricos com descrições de características clínicas e sobrevida do paciente [33] foram obtidos a partir do arquivo de dados BRB-array Tools (http://linus.nci.nih.gov/~brb/DataArchive_New.html) e analisados ​​utilizando ferramentas BRB-array [34] (Informações de Apoio) . Apenas os carcinomas gástricos avançados (T3 /4) (n = 58) foram incluídos na análise. Os valores ideal de corte de GSK3B
, CTNNB1
, e NOTCH2
expressão foram determinados para uma associação com a sobrevida do paciente pelos testes de inferência condicional para as estatísticas maximamente selecionadas como descrito acima.

resultados

gene Expression e paciente sobrevivência

O perfil dos 63 tumores de pacientes com TRG2 expressão gênica mostrou, que os níveis de GSK3B alta expressão
, DNMT1
e CTNNB1
foram significativamente associados com melhor sobrevida (teste de inferência condicional: p = 0,006, 0,041 e 0,043, respectivamente). A associação moderada a melhor sobrevida foi observada em alta expressão de ABCG2
e OLFM4
(p = 0,051, p = 0,055) e para a baixa expressão de NOTCH2
(p = 0,071) (Tabela 3). Univariada de Cox-análise de regressão demonstrou resultados aproximadamente concordantes (Tabela 4).

A análise de regressão multivariada de Cox incluindo GSK3B
, CTNNB1
, DNMT1 Comprar e as variáveis ​​de prognóstico padrão em GC, a saber YPT, YPN, YPM e categoria de ressecção revelou GSK3B
como o segundo fator prognóstico independente mais importante (HR: 0,128, IC 95%: 0,033-0,492, p = 0,003) após metástases à distância (Tabela S1).

a análise de cluster que engloba todos os genes analisados ​​não revelaram grupos de doentes que apresentaram uma associação com o oS. A análise de cluster de Wnt- e Notch genes associados à sinalização produzidos a associação mais significativa com o sistema operacional quando GSK3B
, CTNNB1
e NOTCH2
foram incluídos (p = 0,002) (Figura 1A e B). De acordo com os resultados da análise de cluster, agrupamos os pacientes em três grupos com diferentes combinações de expressão alta ou baixa de GSK3B
, CTNNB1
e NOTCH2
, que foi definida por o ponto de corte valores ideais para a expressão do gene em associação com a sobrevida do paciente. O grupo com GSK3B
^{alta, CTNNB1
alto e NOTCH2
baixa expressão mostrou a melhor sobrevivência, enquanto que o grupo com GSK3B
baixa, CTNNB1
baixa e NOTCH2
alta expressão teve o pior resultado global (p < 0,001, Figura 1C).}

o cálculo de um escore de risco com base em um modelo multivariado proporcional de Cox de regressão de risco destes três genes e dicotomização dos pacientes de acordo com o valor ideal de corte para oS em uma alta (n = 37) e baixa (n = 26) grupo de risco demonstrou uma diferença estatisticamente significativa para OS (sobrevivência média de pacientes de baixo e alto risco: não atingidas e 37 meses, respectivamente; p < 0,001). Além disso, a diferença nas respectivas taxas de sobrevivência aos 1, 2, 3 e 5 anos entre o grupo de baixo e alto risco foram estatisticamente significativas (Tabela S5).

Gene Diferencial Análise Expressão entre Correspondente Antes e Depois as amostras de tumor -therapeutic

a seguir, determinado, se os níveis de expressão dos genes que apresentaram uma associação significativa ou moderada com oS (p < 0,1, Tabela 3 e 4) diferem entre biópsias pré-terapêuticas e seu posto correspondente -therapeutic espécime de tumor. Além disso, POU5F1
, LGR5
e CCND1
foram analisados, e tumorais amostras de pacientes com TRG2 ou TRG3 (cada n = 22) foram estudados.

Em pacientes com TRG2, a expressão de NOTCH2
, POU5F1
e LGR5
aumentou significativamente entre o pré e os espécimes pós-terapêuticos (p = 0,002, 0,028 e 0,017, respectivamente) e a expressão de DNMT1
diminuiu (p = 0,009). No grupo com TRG3, POU5F1
apresentaram um aumento significativo (p = 0,002), enquanto DNMT1
e CCND1
diminuiu significativamente (p = 0,002 e 0,007, respectivamente) .

em relação à expressão dos genes prognósticos relevantes GSK3B
e CTNNB1,
não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre o pré e as amostras de tumores pós-terapêuticos ( tabela 5 e Tabelas S2 e S3).

Análise de Publicamente disponível no array de dados

Para avaliar o valor prognóstico geral do GSK3B
^{alta, CTNNB1
alto e NOTCH2
baixo padrão de expressão, foi utilizado um publicamente disponíveis conjunto de carcinomas gástricos [33] dados de matriz expressão. O conjunto de dados incluiu os genes de interesse e a informação clínica relevante (OS, estágio do tumor) necessários para realizar uma análise análoga. A determinação dos valores de corte ótimos de expressão do gene para a correlação com a sobrevivência e avaliação da assinatura de expressão combinada de GSK3B
alta, CTNNB1
alto e NOTCH2
baixo identificou um grupo de 10 pacientes que tiveram um oS significativamente maior (p = 0,017, oS mediana: não atingido) em comparação com os pacientes 47 restantes (oS mediana 14,0 mo, IC 95%: 8,7 -19,4) (Figura 1D).}

o cálculo do escore de risco para este grupo de doentes e dicotomização dos pacientes de acordo com o valor ideal de corte para oS mostrou uma consideravelmente mais longa oS para o grupo de baixo risco (n = 27) em comparação com o grupo de alto risco (n = 30), embora a diferença não foi estatisticamente significativa (sobrevivência média de 21 contra 13 meses, p = 0,110). Considerando-se as diferenças nas respectivas taxas de sobrevivência em 1, 2 e 3 anos demonstrou resultados análogos com a diferença mais óbvia em 2 anos com uma taxa de sobrevivência de 45% dos pacientes de baixo risco e 21% dos pacientes de alto risco (p = 0,071 ) (Tabela S7).

imuno-histoquímica Análise de NOTCH2

Para avaliar as diferenças na expressão genética entre os tumores pré e pós-terapêuticos emparelhados no nível de proteína, foi realizada imuno-histoquímica e focado em NOTCH2 (Figura S1B e C). Analisou-se os mesmos grupos de pacientes que tinham sido estudados no nível de ARNm. Além disso, 21 pacientes com TRG1b e um grupo controle de 16 pacientes tratados por cirurgia sozinha foram incluídos.

Uma comparação das intensidades de coloração citoplasmática entre biópsias pré-terapêuticas e seus correspondentes tumores pós-terapêuticos revelou um aumento estatisticamente significativo na intensidade de coloração nas amostras pós-terapêutica de doentes com TRG1b, 2 e 3 (p = 0,016, 0,001, e 0,017, respectivamente). Em contraste, não foram observadas diferenças em pacientes tratados por cirurgia sozinha (p = 0,438) (Figura 2). A percentagem de células coradas não foi significativamente alterada. Em relação à coloração nuclear, uma diminuição significativa na intensidade de coloração no espécime de tumor pós-terapêutica foi encontrado no grupo com TRG2 (p = 0,007), TRG3 (p = 0,015) e no grupo de controlo não tratado por quimioterapia (p = 0,016) . Uma diminuição significativa na percentagem de células com núcleos corados foi observada no grupo com TRG1b (p = 0,005), TRG2 (p < 0,001), TRG3 (p = 0,003), bem como no grupo de controlo (p = 0,001).

Discussão

o nosso estudo da análise da expressão de genes relacionados CSC em células de câncer gástrico residual após a quimioterapia neoadjuvante identificada uma assinatura gênica com um alto impacto prognóstico composto por GSK3B
, o β-catenina
gene CTNNB1 e NOTCH2
. Curiosamente, os níveis de CTNNB1
e alta expressão GSK3B
foram associados com o aumento da sobrevida. Β-catenina é uma molécula-chave na transmissão da sinalização de Wnt ao núcleo e unidades de vários processos celulares [35]. sinalização Wnt aberrante tem sido demonstrada em até 46% dos GCs, e ambos Wnt / β-catenina
e proliferação /célula estaminal assinaturas de expressão, indicando a respectiva activação da via, foram associados com a diminuição da sobrevida do paciente [36]. CTNNB1
níveis de ARNm pode modular a sinalização de Wnt [37], e a actividade de Wnt tem sido associada a stemness cancro no cólon [38]. Tendo em conta estes dados, uma associação negativa do expressão CTNNB1
em células tumorais residuais após a quimioterapia ea sobrevida dos pacientes teria sido esperado. No entanto, -catenina β
também faz parte do complexo caderina-E-catenina e alterações neste complexo adesão celular têm sido associados com o pior prognóstico em vários tumores [39]. No GC, resultados conflitantes a respeito da associação entre β
-catenina expressão e prognóstico do paciente existir [40], [41].

É importante notar, que GSK3B também é uma proteína multifuncional envolvido em várias redes de sinalização e antagoniza a sinalização de Wnt por mediar a degradação de β
-catenina, embora uma função de Wnt-activação também tem sido descrita [42] - [44]. O aumento da expressão GSK3B
foi associada a um prognóstico favorável em nosso estudo, o que é consistente com um relatório da maior GSK3B
expressão de mRNA associado a melhor sobrevida em carcinomas serosos de alto grau de ovário [45 ].

Superior Notch2
níveis de expressão correlacionados com pior sobrevida em nossos pacientes do GC. A família de receptores Notch engloba quatro membros, e NOTCH1 e NOTCH2 têm sido implicados para melhorar cancro gástrico progressão [46], [47]. Além disso, uma associação de expressão NOTCH1 com mau prognóstico tem sido relatada [48], o que não é consistente com nossas descobertas; no entanto, devido às diferenças nas populações de estudo, estes resultados não são directamente comparáveis.

Dada a associação altamente significativa da assinatura gene abrangendo CTNNB1
, GSK3B Comprar e NOTCH2
à sobrevida do paciente ea classificação baseada em pontuação risco significativo de os pacientes em um grupo de alto e baixo risco, estamos particularmente interessados, se isso foram relacionados à quimioterapia. A comparação do GSK3B
e CTNNB1
níveis de expressão entre as amostras pré e pós-terapêuticas tumorais não revelou diferenças claras, enquanto que um aumento significativo na expressão de NOTCH2
foi encontrados. Esta descoberta sugere que CTNNB1
e GSK3B
expressão pode refletir uma propriedade do tumor primário, que não é alterada pela quimioterapia e que expressão NOTCH2
nas células tumorais residuais é pelo menos parcialmente relacionada com este tratamento.

uma análise do significado prognóstico dos-três genes em dados de expressão do genoma publicamente disponíveis de GC avançada demonstraram uma associação significativa para o padrão específico de expressão do gene de GSK3B
^{alta, CTNNB1
alto e NOTCH2
baixa expressão e aumento da sobrevida do paciente e uma tendência semelhante, considerando a classificação baseada no escore de risco.}

Esta descoberta apóia a interpretação de que o efeito prognóstico observado em nosso estudo reflete, principalmente, uma propriedade do tumor gástrico primário, sugerindo um papel crítico para estes genes na biologia destes tumores. Além disso, o efeito observado de prognóstico pode ser aumentada por um aumento na expressão de NOTCH2
no tumor residual após a quimioterapia. Assim, se validado em um estudo prospectivo, este gene assinatura de três pode ser útil para a estratificação de risco dos pacientes do GC e, adicionalmente, pode orientar o tratamento pós-operatório após a quimioterapia neoadjuvante.

Nossos resultados são uma reminiscência de um estudo recente análise de um CSC- assinatura gene derivado que prevê a recorrência de tumores no cólon e demonstra que a expressão elevada de genes alvo Wnt é indicativo de um bom prognóstico [48]. Os autores fornecem evidências de que essa associação mais provável reflete o estado de diferenciação do tecido maligno, em vez de o número de CSCs [49].

Ao considerar as alterações de expressão NOTCH2
entre pré correspondente e tumores pós-terapêutica, é importante notar que, comparando a expressão do gene no nível de ARNm, não se pode distinguir se essas alterações reflectem um enriquecimento relativo das células que expressam este gene, se são devido aos agentes quimioterapêuticos que afectam a transcrição de genes no células per se
, ou se as alterações refletem meras diferenças de amostragem. Para esclarecer esta questão, analisamos a expressão da proteína NOTCH2 por imuno-histoquímica e inclui tumores de pacientes tratados por cirurgia sozinha. Com base na coloração citoplasmática, os nossos resultados confirmam um aumento na expressão NOTCH2 ao nível da proteína em que os tumores de pós-terapêuticos e demonstram que as diferenças observadas são susceptíveis de ser restrita aos pacientes tratados por quimioterapia. É de notar que o aumento na expressão NOTCH2 foi relacionado com um aumento na intensidade de coloração citoplasmática em vez de a um aumento no número de células que expressam NOTCH2. Este resultado argumenta contra um enriquecimento de uma subpopulação de células tumorais que expressam NOTCH2 e mais provável sugere um aumento induzido por quimioterapia na expressão do gene nas células tumorais, que podem ser relacionadas com as características biológicas do tumor após o tratamento neoadjuvante. No entanto, uma clara distinção entre estas possibilidades podem ser limitados pela avaliação semiquantitativa de coloração imuno-histoquímica. Como foram observadas alterações semelhantes em coloração nuclear em todos os grupos de tumor incluindo o controle consideramos estas mudanças como não relacionada à quimioterapia.

Independentemente do mecanismo e da verdadeira natureza das células tumorais expressando residual NOTCH2
, os nossos resultados podem ter implicações terapêuticas. sinalização Notch tem emergido como um potencial alvo terapêutico novo, e inibidores de gama-secretase, que inibem o processamento dos receptores Notch, estão actualmente a ser avaliada em testes clínicos [50]. Nosso estudo sugere que a segmentação de sinalização Notch pode também representar uma nova estratégia para tratar pacientes GC. Como efeito prognóstico adverso só foi associada a NOTCH2
e não NOTCH1
, nossos dados também indicam que uma caracterização detalhada dos receptores Notch individuais e uma investigação funcional completa são obrigatórios e favorecer ainda mais fortemente o desenvolvimento de agentes inibidores específicos de parálogos Notch.

Um aumento significativo no foi observada POU5F1
expressão após a quimioterapia nos espécimes ressecados em nosso estudo. O factor de transcrição POU5F1 é essencial para a manutenção de auto-renovação, e a sua expressão elevada em células cancerosas residuais após radioquimioterapia está correlacionada com mau prognóstico no cancro do cólon [51]. Curiosamente observamos também um aumento da expressão de LGR5
, um marcador CSC intestinal promissor, após a quimioterapia em tumores com TRG2 [18]. Estes resultados são compatíveis com o potencial de enriquecimento de células tumorais resistentes a drogas expressam POU5F1
ou LGR5
, mas o mecanismo subjacente para estas alterações e as propriedades particulares das células que expressam estes genes para permanecer ser determinada

no nosso estudo, não houve associação com a sobrevivência foi observada para as moléculas de superfície celular CD44 ou CD133, ambos os quais têm sido largamente utilizados para identificar os CSCs putativos em vários tumores [4] -. [11]. Este resultado apoia descobertas recentes que demonstram que estas moléculas da superfície celular não identificam CSCs em tumores gástricos primários [20].

Em conjunto, nossos resultados demonstram que a assinatura do GSK3B
^{expressão alta, CTNNB1
alto e NOTCH2
baixa em células tumorais GC residual de quimioterapia-resistente é um forte preditor para o prognóstico do paciente favorável. Esta relevância prognóstica foi também demonstrada para pacientes GC usando dados de expressão gênica publicamente disponíveis. Os resultados da análise das amostras pré e pós-terapêuticas tumorais expressão diferencial também sugere que o impacto de GSK3B
e CTNNB1
para esta assinatura não é dependente da quimioterapia, mas sim relacionada nas uma propriedade do tumor primário. Eles indicam ainda um papel proeminente para NOTCH2 e quimioterapia resistência no GC, o que é mais provável relacionado a um efeito dos agentes quimioterápicos no NOTCH2
expressão ao invés de um enriquecimento de NOTCH2
expressar tumor células.}

Informações de Apoio
Figura S1.
transferência de Western e imuno-histoquímica com o anticorpo anti-NOTCH2. A) O anticorpo dirigido contra o domínio intracelular NOTCH2 detecta especificamente a proteína de comprimento completo NOTCH2 acima do marcador 250 kDa, bem como as formas truncadas clivadas NOTCH Extracelular (seguinte) e NOTCH domínio intracelular (NiCd) a cerca de 110 kDa. B) Uma fraca coloração imuno-histoquímica citoplasmática na amostra de biópsia pré-terapêutica e C) uma forte coloração citoplasmática no tumor pós-terapêutica correspondente com TRG2 é mostrado. Barras de escala indicam 50 mm
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044566.s001
(TIF)
Tabela S1. A análise de regressão multivariada
Cox. a expressão do gene da GSK3B, CTNNB1, DNMT1
e as variáveis ​​de prognóstico padrão em GC, YPT, YPN, YPM e categoria de ressecção foram incluídos no modelo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044566.s002
(DOC)
Tabela S2.
expressão gênica dados do pré e correspondente amostras de tumores pós-terapêuticas de pacientes com TRG2
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044566.s003
(DOC)
Tabela S3.

• PLOS ONE: o valor prognóstico da colhidas gânglios linfáticos eo Índice metastático Linfonodo para pacientes com câncer gástrico: Resultados de um estudo de 1.101 pacientes
• PLOS ONE: N-myc Gene Downstream Regulado 1 (NDRG1) Promove a metástase de células Scirrhosum câncer gástrico humano através epitelial mesenquimal Transição