Plos ONE: Izražanje profiliranje izvornih celic Povezane genov v-neoadjuvantni Obdelan Rak želodca: A NOTCH2, GSK3B in β-catenin Gene Podpis napoveduje preživetje

Povzetek

Rak matičnih celic (CSC), ki temeljijo gen izraz podpisi so povezani z napovedjo v različnih vrstah tumorjev in CSCS so predlagali še posebej zdravila odporen. Namen naše raziskave je bil najprej določiti napovedni pomen povezanega s CSC genske ekspresije v preostalih tumorskih celicah raka želodca bolnikih, neoadjuvantni zdravljenih (GC). Drugič, smo želeli preučiti, ali obstajajo izražanje spremembe med pred- in post-terapevtske vzorcev tumorjev, v skladu z obogatitvijo drog tumorskih celic zaščito. Izražanje 44 genov smo analizirali v 63-formalin določen, parafin vgrajeni tumorskih vzorcev z delno regresijo tumorjev (10-50% ostanka tumorja) po novi dopolnilni kemoterapiji s kvantitativno PCR v realnem času nizi nizke gostote. Podpis kombiniranega GSK3B
^{visoka, P-catenin (CTNNB1)
visoka in NOTCH2
nizka izraz je močno povezana z boljšo preživetje bolnika (p < 0,001). Napovedno pomen teh genov je tudi ugotovila, analiziranje javno razpoložljive podatke genske ekspresije. Izraz 9 genov smo primerjali med pre-terapevtskih biopsije in post-terapevtske odstranjenimi osebkov. Pomemben post-terapevtska povečanje Notch
2, LGR5
in POU5F1
izraz je bilo v tumorjih z različnimi tumor regresijskih ocen. za GSK3B
in CTNNB1
niso opazili nobenih pomembnih sprememb. Imunohistokemijsko analiza je pokazala povečanje povezanega s kemoterapijo v intenzivnosti NOTCH2 barvanjem, vendar ne v odstotku NOTCH2. Skupaj, GSK3B, CTNNB1
in NOTCH2
izraz podpis je roman, obeta napovedni parameter za GC. Rezultati analize razlika izražanja kažejo na pomembno vlogo NOTCH2 in odpornost kemoterapijo v PK, za katero se zdi, da so povezani z vplivom drog na NOTCH2 izražanja, ne pa do obogatitvijo NOTCH2 izražajo tumorske celice.}

citat: Bauer L, Langer R, Becker K, Hapfelmeier A Ott K, Novotny A, et al. (2012) Izražanje profiliranje izvornih celic Povezano genov v neoadjuvantno-Treated želodca raku: A NOTCH2
, GSK3B
in β-catenin
Gene Podpis napoveduje preživetje. PLoS ONE 7 (9): e44566. doi: 10,1371 /journal.pone.0044566

Urednik: Ju-Seog Lee, Univerza v Teksasu MD Anderson Cancer Center, Združene države Amerike

Prejeto: 16. maj 2012; Sprejeto: 8. avgust 2012; Objavljeno: 10. september 2012

Copyright: © Bauer et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Študija je bil podprt s strani Deutsche Krebshilfe Mildred Scheel Stiftung odobri številko 108524 za GK in KB. Financer imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Dodatne želodčni karcinomi (GC), se pogosto obravnava Platin /5-fluorouracil (5-FU) - temelji na novi dopolnilni kemoterapiji [1]. Cilj terapije je, med drugim, da se skrči tumor pred operacijo, da bi povečali verjetnost popolno resekcijo in da se s tem izboljša preživetje bolnikov. Vendar pa je stopnja odziva so nizke, in popolno ali vmesnega seštevka tumor regresija je opaziti le v 20-40% bolnikov [1], [2]. Tako, odpornost kemoterapija je glavna ovira za uspešno zdravljenje

V skladu z rakom matičnih celic hipotezo o, tumorske celice so heterogene in povečana odpornost na zdravila, je zlasti fenotip manjšine tumorskih celic -. V SO- imenovane rakave celice ali sprožitev rak matične celice (FT) [3] - [5]. Povečanje populacije CSC po kemoterapiji bila dokazana [6] [7], in matičnih celic na osnovi genske ekspresije podpisi so bili povezani s slabo prognozo na različnih tumorjev, vključno želodčnih karcinomov [8] - [11]. CSC hipoteza je še vedno sporno razpravljali, vendar obstajajo dokazi za obstoj CSCS v več vrstah tumorjev in molekularnih markerjev so bile ugotovljene, ki so prednostno najdemo na teh celic [4], [5]. Aktivacija zarodkov signalnih poti, kot je NT, Notch in jež poti, je bilo predlagano kot gonilna sila za oblikovanje FT [4], [12]. Podatki o izvor in obstoj želodčnih FT še vedno neuspešen [13] - [17]. Pri miših, kostnega mozga, pridobljene celice ali posebna populacija celic v antruma izraža NT tarčne molekule LGR5, so bile povezane s FT v želodcu [17], [18]. Poleg tega, CD44 in CD24 so bila predlagana kot posebnih celičnih površinskih označevalcev, vendar podatki niso v skladu [19], [20].

neoadjuvantnem protokol za zdravljenje GC je odlična priložnost, da razišče tumorske celice pred in po kemoterapiji pri bolnikih. V tej študiji smo želeli najprej pojasnimo, ali je izraz domnevnih genov, povezanih z CSC v post-terapevtske preostalega tumorja napoveduje preživetje bolnikov in drugič, ali so posamezni geni različno izražena med pre-terapevtskih biopsije in post-terapevtske tumorskih vzorcev , v skladu z obogatitvijo kemoterapijo odporna tumorskih celic, kot jih je koncept CSC napovedanih. Skupina bolnikov, ki je pokazalo, velik tumor krčenje po novi dopolnilni kemoterapiji, a še vedno je bilo so bili upoštevani kot najprimernejšo skupino zadostne preostale tumorske celice, ki so na voljo za analizo (10-50% ostanka tumorja), da začnete z analizo presejalnega prognostičnih ustreznih genov in potem opredeliti ustrezne razlike v izražanju genov med pred- in post-terapevtske vzorcev tumorjev. Analize teh preostale tumorske celice smo identificirali gen, izražanje vzorec zajemal GSK3B, CTNNB1
in NOTCH2
, ki odločno napoveduje prognozo bolnikov. Pokazali smo, da je vpliv GSK3B
in CTNNB1
, da ta podpis ni odvisna od kemoterapije in bolj verjetno odraža lastnost primarnega tumorja in naši podatki še naprej kažejo, da se je zlasti NOTCH2
lahko vlogo za odpornost na kemoterapijo v GC.

materiali in metode

bolniki

skupaj 480 bolnikov z lokalno napredovalo GC (CT3 /4 ) so bili zdravljeni s neoadjuvantno, platina /, ki temelji na 5-FU kemoterapijo na oddelku za kirurgijo na Technische Universität München med letoma 1991 in 2007 so bili ocenjeni za odgovor, ki temelji na standardizirani histopatološko protokola [2] - [22]. Tumorja regresija je bil razvrščen v 3 razrede: tumor regresija razred (TRG) 1, ki je sestavljen iz TRG1a (skupno tumor regresijsko) in TRG1b (Vmesni seštevek regresijo tumorjev: < 10% preostali tumor celic /tumor ležišče), TRG2 (delno regresijo tumorja: 10-50% preostale tumorske celice /tumor postelja) in TRG3 (minimalne ali ne tumor regresijski: > 50% ostanka tumorja /tumor ležišče). Od 480 bolnikov, 121 bolnikov dokazali TRG2 in 63 od teh so bili analizirani v tej študiji. Kriterij Vključitev je razpoložljivost zadostnih tumorskega tkiva za analizo bolnikov, zdravljenih z vsaj 50% načrtovanega odmerka kemoterapije. Bolnik lastnosti in protokoli zdravljenja so prikazani v tabeli 1. Za potrditev reprezentativne narave obravnavanih bolnikov, 63, je porazdelitev njihovih clinicopathological parametre v primerjavi z kohorti 121 bolniki in ni pokazala statistično pomembnih razlik.

Sledi -up je bil izračunan na prvi dan zdravljenja do dneva zadnjega stika z bolniki. Mediana spremljanje bila 77,1 mesecev (razpon: 28,5-108,5). Klinični cilj študije je bilo celotno preživetje (OS), ki je definiran kot čas med prvim dnem kemoterapijo in smrt zaradi kateregakoli vzroka. Mediana OS je bila 50,9 mesecev (razpon: 4,5-108,5, 95% IZ: 25,6-76,3), in 37 od 63 bolnikov je umrlo med spremljanjem. Ta velikost vzorca in število dogodkov, so dovolj velike za dosledno ocenjevanje vseh velikosti učinka raziskanih v tem raziskovalna študija [23], [24].

Primerjava izražanja genov med ustrezno pred- in post-terapevtski vzorci tumor je bila opravljena pri bolnikih z TRG2 in TRG3 (vsak n = 22).

za imunohistokemičnim analizo, pred in po terapevtskih tumorskih vzorcev 21 bolnikov z TRG1b, 21 bolnikov z TRG2, 22 bolnikov z so bili vključeni TRG3 in 16 bolnikov, zdravljenih s samo operacijo. Merilo za izbor teh analiz je bila razpoložljivost ustrezne pre-terapevtske biopsije in post-terapevtske tumorje.

Etika Izjava

Študija in uporaba človeških tkiv bil odobren s strani lokalne institucionalne Review Board na Technische Universität München (referenca: 2158/08), privolitev je bila pridobljena v skladu z institucionalnimi predpisi

RNA Pridobivanje in Reverse Transcription

Total RNA je bila vzeta iz formalina določen. -parafin vgrajeni (FFPE) tkiva po ročnem mikrodisekcijo tumorskih območij, sestavljenih iz vsaj 50% tumorskih celic. RNA smo očistili s fenolom in ekstrakcijo s kloroformom in je bil reverzno prepisana, kot je opisano v [25].

Gene Expression
Analiza

44 genov, ki so bili izbrani za analizo, ki temelji na njihovo morebitno vlogo pri CSC biologije so vključene v tabeli 2. izražanja genov smo analizirali s kvantitativno PCR v realnem času (QRT-PCR) o prilagojenih TaqMan® nizi nizko gostoto (Applied Biosystems Inc., Foster City, ZDA). Primerna referenčna geni so bili določeni z analizo desetih kandidatk referenčnih genov v 8 želodčnih karcinomov uporabljajo geNorm algoritma [26]. IPO8
, POLR2A
in UBC
bilo ugotovljeno, da je najprimernejši referenčne geni in normalizacija, ki temeljijo na geometrično povprečje teh treh genov smo izvedli, kot je opisano [26] . Reagenti, so vključeni kolesarske pogoji in programske opreme na dodatne informacije. Relativno izražanje genov je količinsko z metodo primerjalne ΔΔCt [27].

Imunohistokemija

protitelo monoklonsko NOTCH2 (C651.6DbHN) dobimo iz Razvojne študije hibridoma banke (DSHB, Univerza v Iowa, Oddelek za biologijo, Iowa City, ZDA). Postopek barvanja in pregled specifičnosti protiteles z Western blot, so opisani v spremnem informiranje in slika S1A.

Imunohistokemijsko je dosegel v slepi način z dvema neodvisnima raziskovalcev (L.B. in R.L). Citoplazme in jedrska madeži so ocenjevali ločeno. Negativne, šibke, srednje ali močno intenzivnosti barvanje smo ocenili kot 0, 1, 2 in 3, oz. Odstotek tumorskih celic z obarvanih citoplazemskim /jedra je dosegel kot 0 (slabo), 1 (< 10%), 2 (10 do < 50%), 3 (50 < 80%) in 4 (≥80 %).

Statistična analiza

Pogojno testi sklepanja so bili uporabljeni za določitev optimalnih cut-off vrednosti genske ekspresije v povezavi s preživetjem bolnikov in za določitev vrednosti p primerna za maksimalno izbrani statistični podatki [28]. Gene izraz vrednosti enaka ali večja od optimalne mejne vrednosti so opredeljeni kot visoko izražanja in izražanja genov vrednosti ne padejo pod mejne vrednosti so opredeljeni kot nizko izražanja. Stopnje preživetja so bile ocenjene po metodi Kaplan-Meier krivulj in jih primerjali s testom log-ranga. Relativni tveganja smo ocenili z določitvijo razmerje ogroženosti (h) iz Cox modelov sorazmerna nevarnosti. V multivariatne analize, je bil postopen naprej spremenljivka izbor izvaja na podlagi testov razmerje verjetnosti,. Razmerje števila spremenljivk v modelu s številom dogodkov bila omejena do 1:10 [24].

Primerjave clinicopathological spremenljivk med skupinami smo izvedli s testom Mann-Whitney-U. Χ so ^{2-test in Fisherjev test, ki se uporablja za primerjavo relativnih frekvenc, kjer je to primerno. Statistične razlike v genskih izrazov med odvisne vzorce smo analizirali z uporabo Wilcoxonovim testom.}

Nenadzorovana hierarhične cluster analiza je bila opravljena s kasetnim 3,0 programske opreme [29] in Java drevesni programske opreme (različica 1.1.5r2) [30]. Podatek izražanje mRNA so log-preoblikoval, mediana-centered in normalizirana pred uporabo popolne povezave, povezovanje z matriko na daljavo, ki temelji na korelaciji Pearson (uncentred).

A ocena tveganja, je bila izračunana s povzetkom izdelkov za razmnoževanje Cox regresijski koeficient vsakega gena v modelu z normiranimi izražanja genov vrednosti za vsakega bolnika, v bistvu, kot je opisano [31] (podrobnosti v Materiali in metode S1 in tabel S4 in S6).

Vsi statistični testi so bili dve -sided in poteka v material za raziskovanje način, s stopnjo pomembnosti 0,05 uporabo programske opreme SPSS 18,0 (SPSS Inc., Chicago, IL 11,5) in R (R fundacija za statistični računalništvo, Dunaj, Avstrija).

študija je v skladu s priporočili poročanja za tumor marker prognostičnih študij (merila pripomba) [32].

Analiza javnega Mikromrežni podatkov

javno voljo genski podatki izraz paleto želodčnih karcinomov z opisi kliničnih značilnosti in preživetje bolnika [33] smo pridobili iz arhiva podatkov BRB-Array Orodja (http://linus.nci.nih.gov/~brb/DataArchive_New.html) in analizirali z BRB-Array Tools [34] (dodatne informacije) . Samo napredne želodčni karcinomi (T3 /4) (n = 58) so bile vključene v analizo. Vrednosti optimalno cut-off GSK3B
, CTNNB1
in NOTCH2
izraz so se za združenje z preživetju bolnikov, ki ga pogojnih testov sklepanja za maksimalno izbrane statistične podatke, saj opisano zgoraj.

Rezultati

Gene Expression in Patient preživetje

izražanje genov profiliranje 63 tumorjev pri bolnikih z TRG2 je pokazalo, da visoko raven izražanja GSK3B
, DNMT1
in CTNNB1
so bistveno povezana z boljšim preživetjem (pogojno testni sklepanje: p = 0.006, 0.041 in 0.043, v tem zaporedju). Opazili so zmerno povezanost z boljšim preživetjem za visoko ekspresijo ABCG2
in OLFM4
(p = 0,051, p = 0,055) in za nizko izražanje NOTCH2
(p = 0,071) (tabela 3). Univariatne Cox-regresijska analiza je pokazala približno skladnih rezultatov (tabela 4).

A multivariatna Cox regresijska analiza, vključno z GSK3B
, CTNNB1
, DNMT1
in standardne napovedne spremenljivke v GC, in sicer YPT, YPN, YPM in kategoriji resekcijo pokazala GSK3B
kot drugi najpomembnejši neodvisni prognostični dejavnik (HR: 0,128, 95% iZ: 0,033-0,492, p = 0,003), po oddaljene metastaze (tabela S1).

A cluster analiza, ki zajema vseh analiziranih genov niso pokazali skupine pacientov, ki razstavljene povezavo z OS. Analiza grozd Wnt- in Notch signalno povezano genov proizvaja najbolj pomembno povezavo z OS ko je GSK3B
, CTNNB1
in NOTCH2
bili vključeni (p = 0,002) (slika 1A in B). Glede na rezultate analize grozda, smo združeni bolnikov v tri skupine z različnimi kombinacijami visoko ali nizko izražanje GSK3B
, CTNNB1
in NOTCH2
, ki je opredeljeno v optimalnih cut-off vrednosti za izražanje genov v povezavi z preživetju bolnikov. Skupina s GSK3B
^{visoka, CTNNB1
visoka in NOTCH2
nizka izraz pokazala najboljšo preživetje, medtem ko je v skupini s GSK3B
nizka, CTNNB1
nizka in NOTCH2
visoka izraz je imel najslabši izid (p < 0,001, slika 1C).}

Izračun rezultatom tveganja, ki temelji na Večvariantna Cox proporcionalne regresije nevarnost modela teh treh genov in dichotomisation bolnikov glede na optimalne mejne vrednosti za OS v visoko (n = 37) in nizko (n = 26) rizična skupina pokazala statistično značilno razliko za OS (mediana preživetja bolnikov z nizko in visoko stopnjo tveganja: niso dosegle in 37 mesecev, v tem zaporedju; p < 0,001). Poleg tega so bile statistično značilne (preglednica S5) je razlika v davčnih stopnjah preživetja na 1, 2, 3 in 5 let med skupino z nizkim in visokim tveganjem.

diferenciala Gene Expression Analiza med Vodilni pred in po -therapeutic tumorja Vzorci

Naslednja določi, ali je raven izražanja genov, ki so izkazovali močno ali zmerno povezavo z OS (p < 0.1, tabeli 3 in 4) se razlikujeta od pre-terapevtskih biopsije in njihovo ustrezno delovno mesto -therapeutic tumorski vzorec. Poleg tega, POU5F1
, LGR5
in so preučevali CCND1
so bili analizirani in vzorcih tumorjev bolnikov s TRG2 ali TRG3 (vsak n = 22).

pri bolnikih z TRG2, izraz NOTCH2
, POU5F1
in LGR5
znatno povečala med pred- in post-terapevtske osebkov (p = 0,002, 0.028 in 0.017, v tem zaporedju) in izraz DNMT1
zmanjšala (p = 0,009). V skupini z TRG3, POU5F1
pokazal znatno povečanje (p = 0,002), medtem ko je DNMT1
in CCND1
bistveno zmanjšala (p = 0,002 in 0,007, v tem zaporedju) .

Glede na izražene prognostičnih pomembnih genov GSK3B
in CTNNB1
so med pred- in post-terapevtske vzorcev tumorjev opazili nobenih statistično značilnih razlik ( Tabela 5 in Tabele S2 in S3).

Analiza javno dostopnih Array podatkov

za oceno splošnega napovedno vrednost GSK3B
^{visoka, CTNNB1
visoka in NOTCH2
nizka izraz vzorec smo uporabili javno dostopnih podatkov izraz nizov iz želodca karcinomov [33]. Nabor podatkov, vključenih genov interesov in ustrezne klinične informacije (OS, stopnja tumor) treba opraviti podobne analize. Določitev optimalne vrednosti, cut-off izražanja genov v povezavi z preživetje in vrednotenje kombiniranega izražanja podpisa GSK3B
visoka, CTNNB1
visoka in NOTCH2
nizka opredelila skupina 10 bolnikov, ki so imeli bistveno dlje OS (p = 0,017, mediano OS: ni dosežen) v primerjavi s 47 ostalih bolnikov (mediano OS: 14,0 mo, 95% iZ: 8,7 -19,4) (slika 1D).}

Izračun oceno tveganja za to skupino bolnikov in dichotomisation bolnikov glede na optimalne mejne vrednosti za OS pokazala precej daljšo OS za skupino z nizkim tveganjem (n = 27) v primerjavi s skupino z visokim tveganjem (n = 30), čeprav razlika ni bila statistično značilna (mediana preživetja 21 v primerjavi z 13 meseci, p = 0,110). Glede na razlike v davčnih stopnjah preživetja na 1, 2 in 3 letih pokazala podobne rezultate z najbolj očitne razlike v 2 letih s stopnjo preživetja 45% bolnikov z nizkim tveganjem in 21% bolnikov z visokim tveganjem (p = 0,071 ) (tabela S7).

Imunohistokemično Analiza NOTCH2

za oceno razlike v izražanju genov med seznanjenimi pred in po terapevtskih tumorjev na ravni proteina, smo izvedli imunohistokemično in osredotočena na NOTCH2 (Slika S1B in C). Analizirali smo iste skupine pacientov, ki so bili preučevali na nivoju mRNA. Poleg tega je bilo vključenih 21 bolnikov z TRG1b in kontrolno skupino 16 bolnikov, zdravljenih s samo operacijo.

Primerjava citoplazme obarvanje intenzivnosti med pre-terapevtskih biopsije in njihove ustrezne post-terapevtske tumorjev pokazala statistično pomembno povečanje v obarvanje intenzivnosti v post-terapevtske vzorcev pri bolnikih z TRG1b, 2 in 3 (p = 0.016, 0.001 in 0.017, v tem zaporedju). V nasprotju s tem so pri bolnikih, zdravljenih s samim kirurškim posegom (p = 0,438) (slika 2) opazili nobenih razlik. Odstotek obarvanih celic ni bistveno spremenila. Glede jedrske obarvanjem, je znatno zmanjšanje barvanja intenzivnosti post-terapevtske tumorskih vzorcem najdemo v skupini s TRG2 (p = 0,007), TRG3 (p = 0,015) in v kontrolni skupini niso zdravljeni s kemoterapijo (p = 0,016) . Znatno zmanjšanje deleža celic z obarvanih jeder opazili v skupini s TRG1b (p = 0,005), TRG2 (p < 0,001), TRG3 (p = 0,003), kot tudi v kontrolni skupini (p = 0,001).

Pogovor

Naša raziskava analizira izražanje povezanih CSC genov v preostalih želodčnih rakavih celic po novi dopolnilni kemoterapiji identificirala gen podpis z visoko prognostičnih vpliv, ki ga sestavljajo GSK3B
je β-catenin
gen CTNNB1 in NOTCH2
. Zanimivo je, da visoka raven izraz za CTNNB1
in GSK3B
so povezane s povečano preživetje. Β-catenin je ključna molekula pri prenosu NT signalizacije do jedra in vozi več celičnih procesov [35]. Aberrant NT signalizacija je bila dokazana pri največ 46% GK, in tako NT / β-catenin
in širjenje /matičnih celic izraz podpisi, ki kažejo na ustrezno pot aktivacije, so bile povezane z zmanjšano preživetje bolnikov [36]. CTNNB1
ravni mRNA lahko modulirajo NT signalizacijo [37], in NT dejavnost je povezana z rakom stemness v debelem črevesu [38]. Glede na te podatke, negativen združenje bi bilo pričakovati CTNNB1
izraz v preostalih tumorskih celicah po kemoterapiji in preživetju bolnikov. Vendar pa je β
-catenin je tudi del kompleksa E-kadherina-catenin in spremembami v tem celične adhezije kompleksa so bili povezani s slabšo prognozo v različnih tumorjih [39]. V GC, nasprotujočih si rezultatov glede povezave med β
-catenin izražanja in prognoza bolnika obstaja [40], [41].

Pomembno je omeniti, da je GSK3B tudi večnamenski protein sodeluje pri različnih signalnih mrež in antagonist NT signalizacija s posredovanjem razgradnjo β
-catenin, čeprav se NT-aktivira funkcija tudi bila opisana [42] - [44]. Povečano izražanje GSK3B
je bila povezana z ugodno prognozo v naši raziskavi, ki je v skladu s poročilom o višji GSK3B
mRNA izraz povezan z boljšim preživetjem v jajčnikih visoko kvalitetnega resni karcinomov [45 ].

Višja NOTCH2
stopnje izraženosti povezana s slabše preživetje v naših bolnikov GC. Družina Notch receptor zajema štiri člane, in NOTCH1 in NOTCH2 so bili vpleteni za povečanje raka želodca napredovanja [46], [47]. Poleg tega so poročali združenje NOTCH1 izražanja s slabo prognozo [48], ki ni v skladu z našimi ugotovitvami; Vendar pa zaradi razlik v študijskih populacijah so ti rezultati niso neposredno primerljivi.

Glede na zelo pomembno združenje genskega podpisa vključuje CTNNB1
, GSK3B
in NOTCH2
s preživetjem bolnikov in znatno temelji ocena tveganja, razvrščanje bolnikov v visoko in nizko rizično skupino, smo bili še posebej zanima, če bi bilo povezano s kemoterapijo. Primerjava GSK3B
in CTNNB1
stopnje izraženosti med pred- in post-terapevtske vzorcev tumorjev ni pokazala jasne razlike, ker je znatno povečanje izražanju NOTCH2
je našel. Ta ugotovitev kaže, da je CTNNB1
in GSK3B
izraz lahko odraža lastnost primarnega tumorja, ki se ne spreminja s kemoterapijo in NOTCH2
izraz v preostalih tumorskih celic vsaj delno povezan s tem zdravljenjem.

analiza prognostično pomenu treh genov v javno dostopnih genoma vsej izraz podatkov naprednih GC pokazali značilno združenje za posebne genske ekspresije vzorec GSK3B
^{visoka, CTNNB1
visoka in NOTCH2
nizko izražanje in povečano preživetje bolnikov in podobno težnja glede razvrstitve temelji ocena tveganja.}

Ta ugotovitev potrjuje razlago, da je napovedni učinek opazili pri naši raziskavi v glavnem odraža lastnost primarnega tumorja želodca, kar kaže na ključno vlogo pri teh genov v biologiji teh tumorjev. Poleg tega bi lahko prognostično učinek opazili treba povečati s povečanjem izražanje NOTCH2
v preostali tumor po kemoterapiji. Torej, če potrjene v prospektivni študiji, bi to lahko tri gen podpis koristni za stratifikacijo tveganja bolnikov GC, poleg tega pa lahko vodijo pooperativno zdravljenje po novi dopolnilni kemoterapiji.

Naši rezultati so spominja na nedavne študije, ki analizira na CSC- pridobljen gen podpis, ki napoveduje tumorja ponovitev v debelem črevesu in dokazuje, da je povišana ekspresija NT ciljnih genov kaže ugodno prognozo [48]. Avtorji predložiti dokaze, da je ta povezava bolj verjetno odraža stanje diferenciacije v malignega tkiva in ne število FT [49].

Pri obravnavi adaptacije NOTCH2
izraz med ustrezno pred- in post-terapevtske tumorji, je treba poudariti, da primerjamo izražanje genov na ravni mRNA, ne more razlikovati, ali so te spremembe odražajo relativno obogatitev celic, ki izraža ta gen, ali so posledica kemoterapevtikov, ki vplivajo na gensko transkripcijo v celice per se
, ali se spremembe odražajo zgolj razlike vzorčenja. Da bi razjasnili to vprašanje smo analizirali izražanje NOTCH2 proteinov z imunohistokemijo in vključeni tumorjev pri bolnikih, zdravljenih samo z operacijo. Na podlagi citoplazemskega barvanja, naši rezultati potrjujejo povečanje NOTCH2 izražanja na ravni beljakovin v post-terapevtske tumorjev in dokažejo, da so opažene razlike verjetno omejena na bolnikih, zdravljenih s kemoterapijo. Note, je povečanje NOTCH2 ekspresije povezano s povečanjem citoplazemskega intenzitete barvanja namesto do povečanja števila celic, ki izražajo NOTCH2. Ta rezultat navaja pred obogatitvijo v podskupini-NOTCH2 izražajo tumorske celice in bolj verjetno kaže povečanje kemoterapije pri izražanju genov v tumorskih celicah, ki so lahko povezani z biološkimi značilnostmi tumorjev po neadjuvantno zdravljenju. Vendar pa lahko jasno razlikovati med temi možnostmi je omejena z semikvantitivnimi vrednotenje imunohistokemičnim barvanjem. Kot pri vseh tumorskih skupine so opazili podobne spremembe v jedrski obarvanja vključno s kontrolo smo upoštevali te spremembe, saj niso povezani s kemoterapijo.

Ne glede na mehanizem in prave narave preostala tumorskih celic, ki izražajo NOTCH2
, naši rezultati lahko terapevtske posledice. Notch signalizacija je pojavila kot potencialno novo terapevtsko tarčo, in gama-sekretaze inhibitorji, ki zavirajo obdelavo zarezo receptorjev, so trenutno v kliničnih preskušanjih [50]. Naša raziskava kaže, da lahko ciljanje spektakel signalizacijo predstavljajo tudi novo strategijo za zdravljenje bolnikov GC. Ker je bil neugoden prognostični učinek povezan le z NOTCH2
in ne NOTCH1
, naši podatki tudi kažejo, da so podrobno opredelitev posameznih zarezo receptorje in temeljito funkcionalno preiskavo obvezno in dodatno dajejo prednost razvoj zareza paralog specifične zaviralnih dejavnikov.

znatno povečanje POU5F1
izraz opazili po kemoterapiji v odstranjenimi osebkov v naši raziskavi. Faktor POU5F1 prepisu je bistvenega pomena za vzdrževanje samo-obnove, in visoka izraz preostale rakave celice po radiokemoterapijo je v korelaciji s slabo prognozo raka na debelem črevesu [51]. Zanimivo smo opazili tudi povečano izražanje LGR5
, obetaven črevesno CSC marker, po kemoterapiji v tumorjih z TRG2 [18]. Ti rezultati so skladni z morebitno obogatitev tumorskih celic zdravila odpornih izraža POU5F1
ali LGR5
, vendar je osnovni mehanizem za te spremembe in posebne lastnosti celic, ki izražajo te gene ostajajo določi

v naši raziskavi niso opazili nobene povezave s preživetjem za celični površini molekul CD44 in CD133, ki sta bili pogosto uporablja za identifikacijo domnevna CSCS v različnih tumorjih [4] -. [11]. Ta rezultat podpira nedavne ugotovitve dokazujejo, da so te celične površinske molekule ne prepoznajo CSCS v primarnih želodčnih tumorjev [20].

Če povzamemo, naše ugotovitve kažejo, da je izraz podpis GSK3B
^{visoka, CTNNB1
visoka in NOTCH2
nizka kemoterapijo odporen preostala GC tumorskih celicah je močan napovednik za ugodno prognozo bolnikov. To prognostični pomen se je pokazala tudi pri bolnikih, GC, ki uporabljajo javno razpoložljive podatke genske ekspresije. Rezultati analize razlika ekspresije pred- in post-terapevtske tumorskih vzorcu kažejo tudi, da je vpliv GSK3B
in CTNNB1
, da ta podpis ni odvisna od kemoterapije, ampak povezana z lastnost primarnega tumorja. Nadalje kažejo na pomembno vlogo NOTCH2 in kemoterapije odpornosti pri GC, ki je bolj verjetno povezano z učinkom od kemoterapevtikov na NOTCH2
izraz namesto k obogatitvi NOTCH2
izražanje tumor celice.}

Podpora Informacije
Slika S1.
Western blot in imunohistokemija z anti-NOTCH2 protitelesa. A) protitelo, usmerjeno proti znotrajcelično domeno NOTCH2 posebej zazna polno dolžino NOTCH2 beljakovin nad kDa marker 250 kakor tudi razcepi oblike zarezo zunajcelično odrezana (NEXT) in zarezo znotrajcelične domen (NICD) na približno 110 kDa. B) šibko citoplazemskega Imunohistokemijsko v predterapevtsko biopsijo vzorca in C) močno citoplazemskega obarvanje v ustreznem post-terapevtske tumorja z TRG2 je prikazano. Lestvica palice kažejo 50 um
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044566.s001
(IOD)
Tabela S1.
Multivariatno Cox regresijska analiza. Gene izraz GSK3B, CTNNB1, DNMT1
in standardne napovedne spremenljivke v GC, YPT, YPN, YPM in kategoriji resekcijo so bili vključeni v model
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044566.s002
(DOC)
tabeli S2.
Izražanje genov Podatki o pred- in ustrezne post-terapevtske tumorskih vzorcev bolnikov z TRG2
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044566.s003
(DOC)
Tabela S3.

• Plos ONE: napovednih Vrednost obranega bezgavk in Ratio metastatskega limfnih vozlov pri želodčnih bolnikih z rakom: Rezultati študije 1101 Patients
• Plos ONE: N-myc nadaljnjega urejeno Gene 1 (NDRG1) Spodbuja metastaze Human Scirrhous želodca raka celic preko epitelijskih mezenhimskih Transition