PLOS ONE: perfiles de expresión de genes de células madre relacionados con el cáncer gástrico en neoadyuvante Teñidos: Un NOTCH2, GSK3B y β-catenina gen predice la firma Survival

Extracto

Cáncer de Células Madre (CSC) de genes de expresión basada en firmas están relacionadas con el pronóstico en varios tipos de tumores y células madre cancerosas se sugiere que son particularmente resistentes a los medicamentos. El objetivo de nuestro estudio fue el primero, para determinar el significado pronóstico de la expresión de genes relacionados con el CSC en las células tumorales residuales de cáncer gástrico (CG) de los pacientes tratados con neoadyuvante. En segundo lugar, hemos querido examinar, si existen alteraciones de expresión entre las muestras de tumor pre-y post-terapéutica, consistente con un enriquecimiento de las células tumorales resistentes a los fármacos. La expresión de 44 genes se analizó en 63 muestras de tumores, incluidos en parafina fijado en formol con regresión tumoral parcial (10-50% de tumor residual) después de la quimioterapia neoadyuvante por PCR cuantitativa en tiempo real arrays de baja densidad. Una firma del combinado GSK3B
^{alta, β-catenina (CTNNB1)
alto y NOTCH2
baja expresión fue fuertemente correlacionada con una mejor supervivencia de los pacientes (p < 0,001). Una importancia pronóstica de estos genes también se encontró analizando los datos de expresión génica públicamente disponibles. La expresión de genes 9 se comparó entre las biopsias pre-terapéuticas y las piezas resecadas post-terapéuticos. Un aumento de post-terapéutica significativa en NOTCH página 2, LGR5
y POU5F1
se encontró expresión en los tumores con diferentes grados de regresión del tumor. No se observaron alteraciones significativas para GSK3B
y CTNNB1
. El análisis inmunohistoquímico demostró un aumento asociada a la quimioterapia en la intensidad de la tinción NOTCH2, pero no en el porcentaje de NOTCH2. En su conjunto, el GSK3B, CTNNB1
y NOTCH2
firma la expresión es una novela, prometiendo parámetro pronóstico para GC. Los resultados del análisis de la expresión diferencial indican un papel destacado para NOTCH2 y la resistencia a la quimioterapia en GC, lo que parece estar relacionado con un efecto de los fármacos sobre la expresión NOTCH2 en lugar de a un enriquecimiento de células tumorales que expresan NOTCH2.}

Cita: Bauer L, Langer R, Becker K, Hapfelmeier A, Ott K, Novotny A, et al. Perfilado (2012) Expresión de genes de células madre relacionados con el cáncer gástrico en Teñidos neoadyuvante: A NOTCH2
, GSK3B
y β-catenina
génica firma predice supervivencia. PLoS ONE 7 (9): e44566. doi: 10.1371 /journal.pone.0044566

Editor: Ju-Seog Lee, Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América

Recibido: 16 de mayo de 2012; Aceptado: August 8, 2012; Publicado: 10 Septiembre 2012

Copyright: © Bauer et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. El estudio fue apoyado por la Deutsche Stiftung Krebshilfe Mildred Scheel, el número de concesión de 108.524 KB y KB. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción quimioterapia neoadyuvante basan [1] -

carcinomas gástricos avanzados (GC) son tratados con frecuencia por platin /5-fluorouracilo (5-FU). El objetivo de esta terapia es, entre otros, para reducir el tumor antes de la cirugía para aumentar la probabilidad de una resección completa y mejorar así la supervivencia del paciente. Sin embargo, las tasas de respuesta son bajas, y la regresión completa o subtotal del tumor se observa en sólo el 20-40% de los pacientes [1], [2]. Por lo tanto, resistencia a la quimioterapia es un obstáculo importante para el éxito del tratamiento

De acuerdo con la hipótesis de las células madre del cáncer, las células tumorales son heterogéneas, y una mayor resistencia a los medicamentos es un fenotipo particular de una minoría de las células tumorales. - El así llamadas células iniciadoras del cáncer o células madre del cáncer (CSC) [3] - [5]. Un aumento en la población CSC después de la quimioterapia se ha demostrado [6], [7], y se derivan de células basadas firmas de expresión de genes estaban asociados con un mal pronóstico en diversos tumores, incluyendo los carcinomas gástricos [8] - [11]. La hipótesis CSC es todavía controvertida discutido, pero no hay pruebas de la existencia de células madre cancerosas en varios tipos de tumores y los marcadores moleculares han sido identificados que se encuentran preferentemente en estas células [4], [5]. La activación de vías de señalización embrionarias, tales como el Wnt, Notch y las vías de Hedgehog, se ha sugerido como una fuerza impulsora para la formación de células madre cancerosas [4], [12]. Los datos relativos a la fuente y la existencia de células madre cancerosas gástricas son concluyentes [13] - [17]. En ratones, la médula ósea o células derivadas de una población celular específica en el antro que expresa la molécula diana LGR5 Wnt, se han asociado con células madre cancerosas en el estómago [17], [18]. Además, CD44 y CD24 se han sugerido como marcadores de superficie celular específicos, pero los datos son inconsistentes [19], [20].

El protocolo de tratamiento neoadyuvante para GC proporciona una excelente oportunidad para investigar las células tumorales antes y después de la quimioterapia en los pacientes. En este estudio, encaminado a dilucidar en primer lugar, si la expresión de supuestos genes relacionados con el CSC en el tumor residual post-terapéutica predice la supervivencia y el segundo paciente, si los genes particulares se expresan diferencialmente entre las biopsias pre-terapéuticas y las muestras de tumor post-terapéuticos , consistente con un enriquecimiento de las células tumorales resistentes a la quimioterapia según lo predicho por el concepto de CSC. El grupo de pacientes, quienes demostraron una considerable reducción del tumor después de la quimioterapia neoadyuvante, pero todavía tenía suficientes células tumorales residuales disponibles para el análisis (10-50% de tumor residual) fueron considerados como el grupo más adecuado para comenzar con un análisis de detección de genes relevantes y pronósticos a continuación, identificar diferencias relevantes en la expresión génica entre las muestras pre y post-terapéuticos tumorales. El análisis de estas células tumorales residuales hemos identificado un patrón de expresión génica que abarca GSK3B, CTNNB1
y NOTCH2
, que predice fuertemente el pronóstico de los pacientes. Se demuestra que el impacto de GSK3B
y CTNNB1
a esta firma no es dependiente de la quimioterapia y más probable es que refleja una característica del tumor primario y nuestros datos sugieren además, que, en particular NOTCH2
podría desempeñar un papel para la resistencia a la quimioterapia en GC.

Materiales y Métodos

Los pacientes

en total, 480 pacientes con cáncer gástrico localmente avanzado (cT3 /4 ) fueron tratados por neoadyuvante, platino /quimioterapia basada en 5FU en el Departamento de Cirugía en la Universidad Técnica de Múnich entre 1991 y 2007, y se evaluó la respuesta en base a un protocolo estandarizado histopatológico [2] - [22]. regresión del tumor se clasifica en 3 grados: la regresión del tumor de grado (TRG) 1, que consiste en TRG1a (regresión total del tumor) y TRG1b (regresión del tumor subtotal: < 10% residual tumor células /lecho del tumor), TRG2 regresión tumoral parcial (: 10-50% células tumorales residuales /lecho tumoral) y TRG3 (mínima o ninguna regresión del tumor: > 50% de tumor residual /lecho tumoral). De los 480 pacientes, 121 pacientes demostraron TRG2 y 63 de ellos se analizaron en este estudio. El criterio de inclusión fue la disponibilidad de tejido tumoral suficiente para el análisis de los pacientes tratados con al menos 50% de la dosis prevista de la quimioterapia. características y protocolos de tratamiento los pacientes se muestran en la Tabla 1. Para confirmar el carácter representativo de los 63 pacientes analizados, la distribución de sus parámetros clínico se comparó con la cohorte de 121 pacientes y no mostró diferencias estadísticamente significativas.

Sigue -up se calculó a partir del primer día de tratamiento hasta la fecha del último contacto con los pacientes. La mediana de seguimiento fue de 77,1 meses (rango: 28,5 a 108,5). El criterio de valoración clínica del estudio fue la supervivencia global (OS), que se define como el tiempo entre el primer día de la quimioterapia y la muerte por cualquier causa. La mediana de SG fue de 50,9 meses (rango: 4,5 a 108,5; IC del 95%: 25,6-76,3), y 37 de los 63 pacientes murieron durante el seguimiento. Este tamaño de la muestra y el número de eventos son lo suficientemente grandes para una estimación consistente de todos los tamaños del efecto investigados en este estudio exploratorio [23], [24].

La comparación de la expresión de genes entre los correspondientes pre-y post-terapéutica las muestras tumorales se realizó en pacientes con TRG2 y TRG3 (cada n = 22).

para el análisis inmunohistoquímico, las muestras de tumor pre-y post-terapéuticas de 21 pacientes con TRG1b, 21 pacientes con TRG2, 22 pacientes con TRG3 y de 16 pacientes tratados con cirugía solamente se incluyeron. El criterio de selección para estos análisis fue la disponibilidad de los correspondientes biopsias pre-terapéuticas y tumores post-terapéuticos.

Ética Declaración

El estudio y el uso de tejidos humanos fue aprobado por el Institutional Review locales se obtuvo: (2158/08 referencia), y el consentimiento informado de acuerdo a las regulaciones institucionales

la extracción de RNA y transcripción reversa

el ARN total fue extraído a partir fijo-formol, tabla en la Technische Universität München. (FFPE) los tejidos embebidos en parafina después de microdisección manual de las zonas tumorales, compuestos por al menos 50% de células tumorales. El ARN se purificó por extracción con fenol y cloroformo y se transcribió de forma inversa como se describe [25].

Análisis de Expresión Génica

Los 44 genes que fueron seleccionados para el análisis en función de su posible papel en la biología CSC están incluidos en la Tabla 2. La expresión génica se analizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) en TaqMan arrays de baja densidad a medida (Applied Biosystems Inc., Foster City, EE.UU.). genes de referencia adecuados se determinaron mediante un análisis de los genes de referencia de diez candidatos en 8 carcinomas gástricos utilizando el geNorm-algoritmo [26]. IPO8
, POLR2A
y UBC
se determinó que los genes de referencia más adecuados y la normalización sobre la base de la media geométrica de estos tres genes se realizó tal como se describe [26] . Reactivos, condiciones de los ciclos y el software se incluyen en la información de apoyo. la expresión génica relativa se cuantificó utilizando el método comparativo ΔΔCt [27].

La inmunohistoquímica

El anticuerpo monoclonal NOTCH2 (C651.6DbHN) se obtuvo del Banco hibridoma Estudios del Desarrollo (DSHB, La Universidad de Iowa, Departamento de Biología, Iowa City, EE.UU.). El procedimiento de tinción y examen de la especificidad del anticuerpo por Western Blot se describen en la información de apoyo y la Figura S1 A.

La tinción inmunohistoquímica se obtuvo de una manera ciega por dos investigadores independientes (L. B. y R. L). La tinción citoplasmática y nuclear se evaluó por separado. intensidades de tinción negativa, débil, media o fuerte se puntuaron como 0, 1, 2 y 3, respectivamente. El porcentaje de células tumorales con manchado citoplasma /núcleo se puntuó como 0 (negativo), 1 (< 10%), 2 (10 a < 50%), 3 (50 a < 80%) y 4 (≥80 %).

Análisis estadístico

se utilizaron pruebas de inferencia condicional para determinar el punto de corte valores óptimos de la expresión génica para la asociación con la supervivencia del paciente y determinar los valores de p apropiado para máximamente estadísticas seleccionadas [28]. los valores de expresión génica por encima o igual al valor de corte óptimo se definieron como de alta expresión y la expresión de genes valores por debajo del valor de corte se definieron como una baja expresión. Las tasas de supervivencia se estimaron de acuerdo con las curvas de Kaplan-Meier y se compararon mediante el log-rank pruebas. Los riesgos relativos se calcularon mediante la determinación de los coeficientes de riesgo (HR) de los modelos de riesgo proporcional de Cox. En el análisis multivariante, por etapas de selección de variables de avance se hizo sobre la base de pruebas de coeficiente de riesgo. La relación entre el número de variables en el modelo para el número de eventos se limita a 1:10 [24].

Las comparaciones de variables clinicopatológicas entre grupos se realizaron mediante pruebas de Mann-Whitney-U. La χ ^{2-test y la prueba exacta de Fisher se utilizaron para la comparación de las frecuencias relativas en su caso. Se analizaron las diferencias estadísticas de las expresiones de genes entre pares de muestras mediante el test de Wilcoxon.}

análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado se realizó con el software Cluster 3,0 [29] y el software de Java TreeView (versión 1.1.5r2) [30]. los datos de expresión de ARNm relativos fueron log-transformados, centrado en la mediana y se normalizó antes de la aplicación completa vinculación agrupación con una matriz de distancia basados ​​en la correlación de Pearson (descentrado).

Una puntuación de riesgo se calculó con un resumen de los productos de la multiplicación de el coeficiente de regresión de Cox de cada gen en el modelo con los valores de la expresión génica normalizados para cada paciente esencialmente como se describe [31] (detalles en material y Métodos S1 y S4 y S6 Tablas).

Todas las pruebas estadísticas fueron dos -sided y llevado a cabo de una manera exploratoria con un nivel de significación de 0,05 usando el software SPSS 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL 11.5) y R (R Fundación para la Computación de estadística, Viena, Austria).

la estudio cumple con las recomendaciones de informes para marcadores tumorales estudios de pronóstico (criterios OBSERVACIÓN) [32].

el análisis de datos de microarrays Pública

genes expresión serie de datos a disposición del público de los carcinomas gástricos con la descripción de las características clínicas y la supervivencia de los pacientes [33] se obtuvieron a partir del archivo de datos Herramientas BRB-array (http://linus.nci.nih.gov/~brb/DataArchive_New.html) y se analizaron usando herramientas BRB-array [34] (información de apoyo) . Sólo carcinomas gástrico avanzado (T3 /4) (n = 58) se incluyeron en el análisis. Los valores óptimos de corte de GSK3B
, CTNNB1
, y NOTCH2
expresión se determinaron para una asociación con la supervivencia del paciente mediante las pruebas de inferencia condicional para las estadísticas seleccionadas como máximo se ha descrito anteriormente.

resultados

expresión génica y la supervivencia del paciente

El perfil de expresión génica de los 63 tumores de pacientes con TRG2 mostró, que los altos niveles de expresión de GSK3B
, DNMT1
y CTNNB1
se asociaron significativamente con una mejor supervivencia (prueba de inferencia condicional: p = 0,006, 0,041, y 0,043, respectivamente). Se observó una asociación moderada con una mejor supervivencia para alta expresión de ABCG2
y OLFM4 gratis (p = 0,051, p = 0,055) y para la baja expresión de NOTCH2 gratis (p = 0,071) (Tabla 3). Univariado de regresión de Cox-análisis demostró resultados aproximadamente concordantes (tabla 4).

Un análisis multivariado de regresión de Cox incluyendo GSK3B
, CTNNB1
, DNMT1 Opiniones y las variables pronósticas estándar en GC, a saber categoría de resección YPT, ypN, yardas por minuto y reveló GSK3B
como el segundo factor pronóstico independiente más importante (HR: 0,128; IC del 95%: 0,033 a 0,492, p = 0,003) después de metástasis a distancia (Tabla S1).

un análisis de conglomerados que abarca la totalidad de los genes analizados no reveló los grupos de pacientes que mostraron una asociación con el sistema operativo. Un análisis de agrupamiento de Wnt y Notch de señalización asociadas a los genes produce la asociación más significativa con el sistema operativo cuando GSK3B
, CTNNB1
y NOTCH2
fueron incluidos (p = 0,002) (Figura 1A y B). De acuerdo con los resultados del análisis de conglomerados, se agruparon los pacientes en tres grupos con diferentes combinaciones de alta o baja expresión de GSK3B
, CTNNB1
y NOTCH2
, que fue definido por los fuera de los valores de corte óptimos para la expresión de genes en asociación con la supervivencia del paciente. El grupo con GSK3B
^{alta, CTNNB1
alto y NOTCH2
baja expresión mostró la mejor supervivencia, mientras que el grupo con GSK3B
bajo, CTNNB1
baja y NOTCH2
alta expresión tenido el peor resultado global (p < 0,001, Figura 1C).}

el cálculo de una puntuación de riesgo basado en un modelo multivariante de Cox proporcional de regresión de riesgos de estos tres genes y dicotomización de los pacientes de acuerdo con el valor de corte óptimo para el sistema operativo en un alto (n = 37) y baja (n = 26) grupo de riesgo demostró una diferencia estadísticamente significativa para el sistema operativo (mediana de supervivencia de los pacientes con bajo y alto riesgo: no alcanzadas y 37 meses, respectivamente; p < 0,001). Además, la diferencia en las respectivas tasas de supervivencia a 1, 2, 3 y 5 años entre el grupo de bajo y alto riesgo fueron estadísticamente significativas (Tabla S5).

génica diferencial entre el Análisis de Expresión correspondiente Antes y Después las muestras tumorales -therapeutic

a continuación se determinó, si los niveles de expresión de los genes que mostraron una asociación significativa o moderada con OS (p < 0,1, Tabla 3 y 4) difieren entre las biopsias pre-terapéuticas y su correspondiente puesto -therapeutic muestra tumoral. Además, POU5F1
, LGR5
y Se estudiaron CCND1
fueron analizadas, y tumores muestras de pacientes con TRG2 o TRG3 (cada n = 22).

En los pacientes con TRG2, la expresión de NOTCH2
, POU5F1
y LGR5
aumentó significativamente entre el pre y las muestras post-terapéuticas (p = 0,002, 0,028 y 0,017, respectivamente) y la expresión de DNMT1
disminuyó (p = 0,009). En el grupo con TRG3, POU5F1
exhibió un aumento significativo (p = 0,002), mientras que DNMT1
y CCND1 de
disminuido significativamente (p = 0,002 y 0,007, respectivamente) .

En cuanto a la expresión de los genes de pronóstico relevante GSK3B
y CTNNB1, España no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre el pre y las muestras de tumores post-terapéuticas ( Tabla 5 y los cuadros S2 y S3).

Análisis de la matriz de datos a disposición del público

Para evaluar el valor pronóstico general de la GSK3B
^{alta, CTNNB1
alto y NOTCH2
patrón de expresión baja, se utilizó una expresión serie de datos públicamente disponibles que se establecen los carcinomas gástricos [33]. El conjunto de datos incluye los genes de interés y la información clínica relevante (OS, el estadio tumoral) necesaria para llevar a cabo un análisis similar. La determinación de los valores de corte óptimos de la expresión génica de correlación con la supervivencia y la evaluación de la firma la expresión combinada de GSK3B
alta, CTNNB1
alto y NOTCH2
bajo identificado un grupo de 10 pacientes que tuvieron una supervivencia general significativamente mayor (p = 0,017, la mediana de SG: no se ha alcanzado) en comparación con los pacientes restantes 47 (mediana de SG: 14,0 meses; IC del 95%: 8.7 -19,4) (Figura 1D).}

el cálculo de la puntuación de riesgo para este grupo de pacientes y la dicotomización de los pacientes de acuerdo con el valor de corte óptimo para el sistema operativo mostró un sistema operativo mucho más tiempo para el grupo de bajo riesgo (n = 27) en comparación con el grupo de alto riesgo (n = 30), aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa (mediana de supervivencia de 21 frente a 13 meses, p = 0,110). Teniendo en cuenta las diferencias en las respectivas tasas de supervivencia a 1, 2 y 3 años demostró resultados análogos con la diferencia más obvia a los 2 años con una tasa de supervivencia del 45% de los pacientes de bajo riesgo y 21% de los pacientes de alto riesgo (p = 0,071 ) (Tabla S7).

Análisis inmunohistoquímico de NOTCH2

Para evaluar las diferencias en la expresión génica entre los tumores pre-y post-terapéuticos emparejados en el nivel de proteínas, se realizó inmunohistoquímica y se centró en NOTCH2 (Figura S1B y C). Se analizaron los mismos grupos de pacientes que habían sido estudiados en el nivel de ARNm. Además, se incluyeron 21 pacientes con TRG1b y un grupo control de 16 pacientes tratados con cirugía sola.

Una comparación de la intensidad de la tinción citoplásmica entre las biopsias pre-terapéuticas y sus correspondientes tumores post-terapéuticos reveló un aumento estadísticamente significativo en intensidad de la tinción en las muestras post-terapéuticas de pacientes con TRG1b, 2 y 3 (p = 0,016, 0,001, y 0,017, respectivamente). En contraste, no se observaron diferencias en los pacientes tratados con cirugía sola (p = 0,438) (Figura 2). El porcentaje de células teñidas no se alteró significativamente. En cuanto a la tinción nuclear, una disminución significativa en la intensidad de tinción en la muestra de tumor post-terapéuticos se encontró en el grupo con TRG2 (p = 0,007), TRG3 (p = 0,015) y en el grupo de control no tratado por quimioterapia (p = 0,016) . Se observó una disminución significativa en el porcentaje de células con núcleos teñidos en el grupo con TRG1b (p = 0,005), TRG2 (p < 0,001), TRG3 (p = 0,003), así como en el grupo control (p = 0,001).

Discusión

Nuestro estudio el análisis de la expresión de genes relacionados con la CSC en células de cáncer gástrico residual después de la quimioterapia neoadyuvante identificó un gen firma con un alto impacto pronóstico compuesto por GSK3B
, la β-catenina
gen CTNNB1 y NOTCH2
. Curiosamente, los niveles elevados de expresión de CTNNB1
y GSK3B
se asociaron con un aumento de la supervivencia. Β-catenina es una molécula clave en la transmisión de la señalización de Wnt en el núcleo y las unidades de múltiples procesos celulares [35]. la señalización de Wnt aberrante se ha demostrado en hasta un 46% de GC, y ambos Wnt / β-catenina y la proliferación
/célula madre firmas de expresión que indica la activación de la vía respectiva, se asociaron con una disminución de la supervivencia de los pacientes [36]. CTNNB1
niveles de mRNA puede modular la señalización de Wnt [37], y la actividad de Wnt se ha relacionado con el cáncer de troncalidad en el colon [38]. Teniendo en cuenta estos datos, una asociación negativa de se habría esperado CTNNB1
expresión en células tumorales residuales después de la quimioterapia y la supervivencia de los pacientes. Sin embargo, β-catenina
también es parte del complejo de la E-cadherina-catenina y alteraciones en este complejo de adhesión celular se han asociado con un peor pronóstico en diversos tumores [39]. En GC, resultados contradictorios con respecto a la asociación entre el β-catenina
expresión y el pronóstico del paciente existen [40], [41].

Es importante señalar, que GSK3B es también una proteína multifuncional involucrado en varias redes de señalización y antagoniza la señalización de Wnt por la mediación de la degradación de β-catenina
, aunque una función de Wnt-activación también se ha descrito [42] - [44]. El aumento de expresión de GSK3B
se asocia con un pronóstico favorable en nuestro estudio, lo cual es coherente con un informe de alto GSK3B
la expresión del ARNm asociado con una mejor supervivencia en los carcinomas serosos de alto grado de ovario [45 ].

Superior NOTCH2
niveles de expresión correlacionó con una peor supervivencia de nuestros pacientes GC. La familia del receptor Notch abarca cuatro miembros, y NOTCH1 y NOTCH2 han sido implicados para mejorar la progresión de cáncer gástrico [46], [47]. Por otra parte, una asociación de expresión NOTCH1 con mal pronóstico se ha comunicado [48], lo cual no es consistente con nuestros hallazgos; Sin embargo, debido a las diferencias en las poblaciones de estudio, estos resultados no son directamente comparables.

Dada la asociación altamente significativa de la firma genética que abarca CTNNB1
, GSK3B Opiniones y NOTCH2
con la supervivencia del paciente y la clasificación significativa basada en la puntuación de riesgo de los pacientes en un grupo de alto y bajo riesgo, y nos ha interesado, si esto se relaciona con la quimioterapia. La comparación de los GSK3B
y CTNNB1
niveles de expresión entre las muestras pre y post-terapéuticos tumorales no reveló diferencias claras, mientras que un aumento significativo en la expresión de NOTCH2
se encontró. Este hallazgo sugiere que CTNNB1
y GSK3B
expresión puede reflejar una propiedad del tumor primario que no se altera por la quimioterapia y que NOTCH2
expresión en las células tumorales residuales es al menos en parte relacionado con este tratamiento.

un análisis de la importancia pronóstica de los tres genes en públicamente disponibles en todo el genoma de datos de expresión de CG avanzado demostró una asociación significativa para el patrón de expresión génica específica de GSK3B
^{alta, CTNNB1
alto y NOTCH2
baja expresión y el aumento de la supervivencia del paciente y una tendencia similar teniendo en cuenta la clasificación basada en la puntuación de riesgo.}

Este hallazgo apoya la interpretación de que el efecto pronóstico observado en nuestro estudio refleja principalmente una propiedad del tumor gástrico primario, lo que sugiere un papel crítico para estos genes en la biología de estos tumores. Además, el efecto pronóstico observado podría ser mejorada por un aumento en la expresión de NOTCH2
en el tumor residual después de la quimioterapia. Por lo tanto, si se ha demostrado en un estudio prospectivo, esta firma de tres genes podría ser útil para la estratificación del riesgo de pacientes con cáncer gástrico y, además, pueden guiar el tratamiento postoperatorio después de la quimioterapia neoadyuvante.

Nuestros resultados son una reminiscencia de un reciente estudio que analiza un CSC- firma gen derivado que predice la recurrencia del tumor en el colon y demuestra que la elevada expresión de los genes diana de Wnt es indicativo de un pronóstico favorable [48]. Los autores proporcionan evidencia de que esta asociación más probable es que refleja el estado de diferenciación del tejido maligno más que el número de células madre cancerosas [49].

Al considerar las alteraciones de NOTCH2
expresión entre pre correspondiente y tumores post-terapéuticos, es importante tener en cuenta que la comparación de la expresión génica en el nivel de mRNA, no puede distinguir si estas alteraciones reflejan un enriquecimiento relativo de las células que expresan este gen, ya sea que se deben a los agentes quimioterapéuticos que afectan a la transcripción de genes en el células per se
, o si las alteraciones reflejan meras diferencias de muestreo. Para aclarar esta cuestión se analizó la expresión de proteínas mediante técnicas de inmunohistoquímica NOTCH2 y se incluyeron los tumores de los pacientes tratados con cirugía sola. Sobre la base de la tinción citoplásmica, nuestros resultados confirman un aumento en la expresión NOTCH2 a nivel de proteínas en los tumores post-terapéuticos y demuestran que las diferencias observadas son susceptibles de ser restringido a pacientes tratados por quimioterapia. Es de destacar que el aumento de la expresión NOTCH2 se relacionó con un aumento en la intensidad de la tinción citoplasmática en lugar de a un aumento en el número de células que expresan NOTCH2. Este resultado se opone a un enriquecimiento de una subpoblación de células tumorales que expresan NOTCH2 y más probable sugiere un aumento inducida por quimioterapia en la expresión génica en las células tumorales, que pueden estar relacionados con las características biológicas del tumor después del tratamiento neoadyuvante. Sin embargo, una distinción clara entre estas posibilidades puede estar limitado por la evaluación semicuantitativa de la tinción inmunohistoquímica. Como se han observado alteraciones similares en la tinción nuclear en todos los grupos de tumores incluyendo el control se consideraron estos cambios como no relacionada con la quimioterapia.

Independientemente del mecanismo y la verdadera naturaleza de las células tumorales que expresan residual NOTCH2
, nuestros resultados pueden tener implicaciones terapéuticas. la señalización de Notch ha surgido como una posible nueva diana terapéutica, y los inhibidores de la gamma-secretasa, que inhiben el procesamiento de los receptores Notch, que actualmente están siendo evaluados en ensayos clínicos [50]. Nuestro estudio sugiere que la orientación de señalización Notch también puede representar una nueva estrategia para el tratamiento de pacientes con cáncer gástrico. Como un efecto pronóstico adverso se asoció sólo con NOTCH2 Opiniones y no NOTCH1
, nuestros datos también indican que una caracterización detallada de los receptores Notch individuales y una investigación exhaustiva funcional son obligatorios y aún más fuertemente a favor el desarrollo de agentes inhibidores de Notch-paralog específica.

Un aumento significativo en se observó POU5F1
expresión después de la quimioterapia en las piezas resecadas en nuestro estudio. El factor de transcripción POU5F1 es esencial para el mantenimiento de la auto-renovación, y su alta expresión en células de cáncer residual después de radioquimioterapia se correlaciona con mal pronóstico en cáncer de colon [51]. Curiosamente también se observó un aumento de la expresión de LGR5
, un prometedor marcador intestinal CSC, después de la quimioterapia en los tumores con TRG2 [18]. Estos resultados son compatibles con el enriquecimiento potencial de las células tumorales resistentes a los medicamentos que expresa POU5F1
o LGR5
, pero el mecanismo subyacente de estas alteraciones y las propiedades particulares de las células que expresan estos genes permanecen a determinarse

en nuestro estudio, se observó ninguna asociación con la supervivencia de las moléculas de superficie celular CD44 o CD133, ambos de los cuales han sido ampliamente utilizados para identificar células madre cancerosas putativas en diversos tumores [4] -. [11]. Este resultado apoya los hallazgos recientes que demuestran que estas moléculas de la superficie celular no se identifican células madre cancerosas en tumores gástricos primarios [20].

En conjunto, nuestros resultados demuestran que la expresión de la firma GSK3B
^{alta, CTNNB1
alto y NOTCH2
baja en las células tumorales residuales GC resistentes a la quimioterapia es un fuerte predictor de pronóstico favorable de pacientes. Esta relevancia pronóstica también se demostró para los pacientes GC utilizando los datos de expresión génica públicamente disponibles. Los resultados del análisis de la expresión diferencial de la muestra de pre y post-terapéuticos tumorales también sugiere que el impacto de GSK3B
y CTNNB1
a esta firma no es dependiente de la quimioterapia, sino más bien en relación con una propiedad del tumor primario. Indican, además, un papel destacado para el NOTCH2 y la quimioterapia resistencia en GC, que está más probablemente relacionado con un efecto de los agentes quimioterapéuticos en NOTCH2
expresión más que a un enriquecimiento de NOTCH2
tumor que expresa las células.}

Apoyo a la Información
Figura S1.
de transferencia de Western e inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-NOTCH2. A) El anticuerpo dirigido contra el dominio intracelular NOTCH2 detecta específicamente la proteína de longitud completa NOTCH2 por encima del marcador de 250 kDa, así como las formas escindidas NOTCH extracelular truncadas (NEXT) y Notch intracelular de dominio (NICD) a aproximadamente 110 kDa. B) Se muestra una débil tinción inmunohistoquímica citoplasmática en la muestra de biopsia pre-terapéutica y C) una fuerte tinción citoplásmica en el tumor post-terapéutica correspondiente con TRG2. Las barras de escala indican 50 micras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044566.s001 gratis (TIF)
Tabla S1. El análisis de regresión multivariante de Cox
. La expresión génica de GSK3B, CTNNB1, DNMT1
y las variables pronósticas estándar en GC, YPT, ypN, categoría de resección yardas por minuto y se incluyeron en el modelo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044566.s002 gratis (DOC) sobre Table S2.
La expresión génica de datos de la pre y correspondientes muestras de tumores post-terapéuticas de los pacientes con TRG2
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044566.s003 gratis (DOC) sobre Table S3.

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