PLoS ONE: Expression Profilering af stamcelle-gener i Neoadjuverende-behandlet gastrisk kræft: En NOTCH2, GSK3b og β-catenin Gene Signature Forudsiger Survival

Abstrakt

Cancer dæmme celle (CSC) baseret genekspression signaturer er forbundet med prognosen i forskellige tumortyper og CSCS foreslås at være særligt lægemiddelresistent. Formålet med vores undersøgelse var først at bestemme den prognostiske betydning af CSC-relateret genekspression i resttumorceller af neoadjuverende-behandlede gastrisk cancer (GC) patienter. For det andet, vi har ønsket at undersøge, hvorvidt udtryk forandringer mellem før og efter terapeutiske tumorprøver findes, i overensstemmelse med en berigning på lægemiddelresistente tumorceller. Ekspressionen af ​​44 gener blev analyseret i 63 formalinfikserede, paraffinindlejrede tumorprøver med delvis tumorregression (10-50% residual tumor) efter neoadjuverende kemoterapi ved kvantitativ realtids-PCR lav massefylde arrays. En underskrift kombineret GSK3b
^{høj, β-catenin (CTNNB1)
høj og NOTCH2
lav ekspression var stærkt korreleret med bedre patientoverlevelse (p < 0,001). En prognostiske relevans af disse gener blev også fundet at analysere offentligt tilgængelige genekspression data. Udtrykket af 9 gener blev sammenlignet mellem præ-terapeutiske biopsier og post-terapeutiske resektion prøver. En væsentlig post-terapeutisk stigning i HAK
2, LGR5
POU5F1
udtryk blev fundet i tumorer med forskellige tumor regression kvaliteter. blev ikke observeret nogen væsentlige ændringer for GSK3b
CTNNB1
. Immunhistokemisk analyse viste en kemoterapi-associeret stigning i intensiteten af ​​NOTCH2 farvning, men ikke i den procentdel af NOTCH2. Tilsammen GSK3b, CTNNB1
NOTCH2
udtryk signatur er en roman, lovende prognostisk parameter for GC. Resultaterne af den differentielle ekspression analysen viser en fremtrædende rolle for NOTCH2 og kemoterapi modstand i GC, som synes at være relateret til en virkning af lægemidlerne på NOTCH2 ekspression snarere end til en berigelse af NOTCH2 udtrykkende tumorceller.}

citation: Bauer L, Langer R, Becker K, Hapfelmeier A, Ott K, Novotny A, et al. (2012) Expression Profilering af stamcelle-gener i Neoadjuverende-Behandlet gastrisk kræft: En NOTCH2
, GSK3b
β-catenin
Gene Signature Forudsiger Survival. PLoS ONE 7 (9): e44566. doi: 10,1371 /journal.pone.0044566

Redaktør: Ju-Seog Lee, University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: Maj 16, 2012; Accepteret: August 8, 2012; Udgivet 10. september, 2012 |

Copyright: © Bauer et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af Deutsche Krebshilfe Mildred Scheel Stiftung, tildele nummer 108.524 til GK og KB. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Avancerede gastriske carcinomer (GC) behandles ofte ved Platin /5-fluorouracil (5FU) - baseret neoadjuverende kemoterapi [1]. Formålet med denne behandling er bl.a. at skrumpe tumoren før operation for at øge sandsynligheden for fuldstændig resektion og således forbedre patientens overlevelse. Men svarprocenter er lave, og der observeres komplet eller subtotal tumorregression i kun 20-40% af patienterne [1], [2]. , Kemoterapi modstand er således en væsentlig hindring for en vellykket behandling

Ifølge kræft stamceller hypotese, tumorceller er heterogene, og en øget resistens er en særlig fænotype af et mindretal af tumorceller -. Den såkaldte såkaldte cancer-initierende celler eller cancer stamceller (CSCS) [3] - [5]. En stigning i CSC population efter kemoterapi er blevet påvist [6], [7], og stamcellebaserede genekspression signaturer var forbundet med dårlig prognose i forskellige tumorer, herunder gastriske carcinomer [8] - [11]. CSC hypotese er stadig kontroversielt diskuteret, men der er tegn på eksistensen af ​​CSCS i flere tumorer og molekylære markører er blevet identificeret som fortrinsvis findes på disse celler [4], [5]. Aktiveringen af ​​embryonale signalveje, såsom Wnt, hak og Hedgehog veje, er blevet foreslået som en drivkraft for dannelsen af ​​CSCS [4], [12]. Data om kilden og eksistens af gastrisk CSCS forbliver resultatløse [13] - [17]. Hos mus, knoglemarvs- afledte celler eller en specifik cellepopulation i antrum udtrykker Wnt målmolekylet LGR5, er blevet forbundet med CSCS i maven [17], [18]. Desuden har CD44 og CD24 blevet foreslået som specifikke celleoverflademarkører, men data er inkonsekvent [19], [20].

neoadjuverende behandling protokol for GC giver en glimrende mulighed for at undersøge tumorceller før og efter kemoterapi i patienter. I denne undersøgelse, vi havde til formål at belyse først, om udtrykket af formodede CSC-relaterede gener i den post-terapeutisk residual tumor forudsiger patient overlevelse og for det andet, om bestemte gener udtrykkes forskelligt mellem præ-terapeutiske biopsier og post-terapeutiske tumor prøver i overensstemmelse med en berigelse af kemoterapi-resistent tumorceller som forudsagt af CSC koncept. Gruppen af ​​patienter, der demonstrerede stor tumor krympning efter neoadjuverende kemoterapi, men stadig havde tilstrækkelige tilbageværende tumorceller til rådighed for analyse (10-50% residual tumor) blev anset som den mest egnede gruppe til at starte med en screeningsanalyse for prognostiske relevante gener og for derefter at identificere relevante forskelle i genekspression mellem før og efter terapeutiske tumorprøver. Analyse disse resterende tumorceller vi identificeret en genekspression mønster omfatter GSK3b, CTNNB1
NOTCH2
, som i høj grad forudsiger prognosen af ​​patienterne. Vi viser, at effekten af ​​ GSK3b
CTNNB1
til denne signatur er ikke afhængig af kemoterapi og mere sandsynligt afspejler en egenskab af den primære tumor og vores data tyder endvidere, at især NOTCH2
kunne spille en rolle for kemoterapi modstand i GC.

Materialer og metoder

patienter

i alt 480 patienter med lokalt fremskreden GC (CT3 /4 ) blev behandlet af neoadjuverende, platin /5FU kemoterapi ved Institut for Kirurgi ved Technische Universität München mellem 1991 og 2007 og blev evalueret for respons baseret på en standardiseret histopatologiske protokol [2] - [22]. Tumor regression blev klassificeret i 3 kvaliteter: tumorregression bedømmelse (TRG) 1, som består af TRG1a (total tumorregression) og TRG1b (subtotal tumorregression: < 10% resterende tumor celler /tumor seng), TRG2 (delvis tumorregression: 10-50% resterende tumorceller /tumor seng) og TRG3 (minimal eller ingen tumor regression: > 50% residual tumor /svulst seng). Af de 480 patienter, 121 patienter viste TRG2 og 63 af disse blev analyseret i denne undersøgelse. Kriteriet Optagelsen var tilgængeligheden af ​​tilstrækkelige tumorvæv til analyse af patienter behandlet med mindst 50% af den forventede dosis kemoterapi. Patient karakteristika og behandlingsprotokoller er vist i tabel 1. For at bekræfte repræsentative karakter af de analyserede patienterne 63, blev distributionen af ​​deres klinisk-patologiske parametre i forhold til 121-patient-kohorte og viste ingen statistisk signifikante forskelle.

Følg -up blev beregnet ud fra den første behandlingsdag indtil datoen for den sidste kontakt med patienterne. Den mediane opfølgning var 77,1 måneder (interval: 28,5 til 108,5). Den kliniske endpoint i studiet var samlet overlevelse (OS), der blev defineret som tiden mellem den første dag i kemoterapi og død ved enhver årsag. Den mediane OS var 50,9 måneder (interval: 4,5 til 108,5, 95% CI: 25,6-76,3), og 37 af de 63 patienter døde under opfølgning. Denne prøve størrelsen og antallet af hændelser er tilstrækkeligt store til en ensartet vurdering af alle effektstørrelser undersøgte i denne eksplorative undersøgelse [23], [24].

Sammenligningen af ​​genekspression mellem tilsvarende præ- og post-terapeutisk tumorprøver blev udført for patienter med TRG2 og TRG3 (hver n = 22).

for immunhistokemisk analyse, før og efter terapeutiske tumor prøver fra 21 patienter med TRG1b, 21 patienter med TRG2, 22 patienter med TRG3 og af 16 patienter behandlet med kirurgi alene blev medtaget. Kriteriet for udvælgelse af disse analyser var tilgængeligheden af ​​tilsvarende præ-terapeutiske biopsier og post-terapeutiske tumorer.

Etik Statement

Undersøgelsen og brugen af ​​humane væv blev godkendt af den lokale Institutional Review bestyrelsen ved Technische Universität München (reference: 2158/08), og informeret samtykke blev opnået i overensstemmelse med de institutionelle regler

RNA Extraction og Reverse Transcription

Total RNA blev ekstraheret fra formalin-fikseret,. paraffinindstøbte (FFPE) væv efter manuel mikrodissektion af tumor områder bestående af mindst 50% tumorceller. RNA blev renset ved phenol og chloroform ekstraktion og blev omvendt transskriberet som beskrevet [25].

Gene Expression Analysis

De 44 gener, der blev udvalgt til analyse baseret på deres potentielle rolle i CSC biologi er medtaget i tabel 2. Genekspression blev analyseret ved kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) på specialfremstillede TaqMan® low density arrays (Applied Biosystems Inc., Foster City, USA). Passende referencepunkter gener blev bestemt ved en analyse af ti kandidat reference- gener i 8 gastriske carcinomer ved hjælp af geNorm-algoritmen [26]. IPO8
, POLR2A
UBC
blev bestemt til at være de mest egnede reference- gener og normalisering baseret på det geometriske gennemsnit af disse tre gener blev udført som beskrevet [26] . Reagenser, der cykelforhold og software er inkluderet i støtte herfor. Relativ genekspression blev kvantificeret ved hjælp af den sammenlignende ΔΔCt metoden [27].

Immunhistokemi

Det monoklonale NOTCH2 antistof (C651.6DbHN) blev opnået fra Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, The University of Iowa, Biologisk Institut, Iowa City, USA). Proceduren for farvning og undersøgelse af antistofspecificitet ved Western blotting er beskrevet i Støtte Information og figur S1A.

immunhistokemisk farvning blev scoret i en blindet måde ved to uafhængige forskere (L. B. og R. L). Cytoplasmatisk og nuklear farvning blev vurderet separat. Negative, svage, medium eller stærk farvning intensiteter blev bedømt som 0, 1, 2 og 3, henholdsvis. Procentdelen af ​​tumorceller med farvet cytoplasma /kerne blev scoret som 0 (negativ), 1 (< 10%), 2 (10 til < 50%), 3 (50 til < 80%) og 4 (≥80 %).

Statistisk analyse

Betingede inferens tests blev anvendt til at bestemme de optimale cut-off-værdier for genekspression for foreningen med patienten overlevelse og at bestemme p-værdier passende for maksimalt udvalgte statistikker [28]. Genekspression værdier over eller lig med den optimale afskæringsværdi blev defineret som høje ekspressionsniveauer og genekspression værdier under afskæringsværdien blev defineret som lav ekspression. Overlevelsesrater blev estimeret ifølge Kaplan-Meier kurver og blev sammenlignet med log-rank test. Relative risici blev estimeret ved at bestemme hazard ratio (timer) fra Cox proportional hazard-modeller. I den multivariate analyse blev trinvis fremad variabel udvælgelse foretaget på grundlag af likelihood kvotientkriteriet. Forholdet mellem antallet af variabler i modellen til antallet af begivenheder var begrænset til 1:10 [24].

Sammenligninger af klinisk-patologiske variabler mellem grupper blev udført ved Mann-Whitney-U test. Den χ ^{2-test og Fishers eksakte test blev anvendt til sammenligning af relative frekvenser, hvor det er relevant. Statistiske forskelle af genekspressioner mellem parrede prøver blev analyseret under anvendelse af Wilcoxon-test.}

Unsupervised hierarkisk klyngeanalyse blev udført med Cluster 3,0 software [29] og Java TreeView software (version 1.1.5r2) [30]. Relative mRNA udtryk data blev log-transformeret, median-centrerede og normaliseret før du anvender komplet kobling clustering med en afstand matrix baseret på Pearsons korrelation (uncentred).

En risiko score blev beregnet ved at opsummere produkterne af multiplikation af Cox regression koefficient på hvert gen i modellen med de normaliserede genekspression værdier for hver patient væsentlige som beskrevet [31] (detaljer i Materiale og metoder S1 og borde S4 og S6).

Alle statistiske tests var to Print automatisk og gennemføres på en eksplorativ måde med et signifikansniveau på 0,05 ved hjælp af SPSS 18,0 software (SPSS Inc., Chicago, IL 11.5) og R (R Foundation for Statistisk Computing, Wien, Østrig).

undersøgelse i overensstemmelse med rapporteringskravene anbefalinger til tumor markør prognostiske undersøgelser (NB kriterier) [32].

Analyse af Public Microarray data

offentligt tilgængelig genekspression array-data for gastriske carcinomer med beskrivelser af kliniske karakteristika og patient overlevelse [33] blev opnået fra BRB-Array Værktøj data arkiv (http://linus.nci.nih.gov/~brb/DataArchive_New.html) og analyseret ved hjælp af BRB-Array Tools [34] (Støtte Information) . Kun avancerede gastriske carcinomer (T3 /4) (n = 58) blev inkluderet i analysen. De optimale afskæringsværdier for GSK3b
, CTNNB1
, og NOTCH2
udtryk blev bestemt for en forening med patientens overlevelse af de betingede inferens test for maksimalt udvalgte statistikker som beskrevet ovenfor.

Resultater

Gene Expression og Patient Survival

genekspression profilering af de 63 tumorer i patienter med TRG2 viste, at høje ekspressionsniveauer af GSK3b
, DNMT1
CTNNB1
var signifikant forbundet med bedre overlevelse (betinget inferens test: p = 0,006, 0,041, og 0,043 henholdsvis). En moderat association med bedre overlevelse blev observeret for høj ekspression af ABCG2
OLFM4
(p = 0,051, p = 0,055) og for lav udtryk for NOTCH2
(p = 0,071) (tabel 3). Univariate Cox-regressionsanalyse viste omtrent overensstemmende resultater (tabel 4).

En multivariat Cox regressionsanalyse herunder GSK3b
, CTNNB1
, DNMT1
standard prognostiske variabler i GC, nemlig YPT, YPN, YPM og resektion kategori afslørede GSK3b
som den næstvigtigste uafhængig prognostisk faktor (HR: 0,128, 95% CI: 0,033-0,492, p = 0,003) efter fjernmetastaser (tabel S1).

en klynge analyse omfatter alle de analyserede gener afslørede ingen patientgrupper som udviste en forening med OS. En klynge analyse af Wnt- og Notch signalering-associerede gener produceret de mest signifikant sammenhæng med OS, når GSK3b
, CTNNB1
og NOTCH2
blev inkluderet (p = 0,002) (figur 1A og B). Ifølge resultaterne af klyngeanalyse, vi grupperet patienterne i tre grupper med forskellige kombinationer af høj eller lav ekspression af GSK3b
, CTNNB1
og NOTCH2
, som blev defineret ved de optimale cut-off-værdier for genekspression i samarbejde med patient overlevelse. Gruppen med GSK3b
^{høj, CTNNB1
høj og NOTCH2
lavt udtryk viste den bedste overlevelse, mens gruppen med GSK3b
lav, CTNNB1
lav og NOTCH2
høj ekspression havde den værste samlede resultat (p < 0,001, figur 1C).}

Beregning af en risiko score baseret på en multivariat Cox proportional hazard regression model af disse tre gener og dichotomisation af patienterne ifølge den optimale afskæringsværdi til OS i en høj (n = 37) og lav (n = 26) risikogruppe viste en statistisk signifikant forskel til OS (median overlevelse lav og høj risiko patienter: ikke nået, og 37 måneder henholdsvis; p < 0,001). Hertil kommer, at forskellen i de respektive overlevelsesrater på 1, 2, 3 og 5 år mellem lav og høj gruppe risiko var statistisk signifikant (tabel S5).

Differential Gene Expression Analysis mellem Tilsvarende Pre- og Post -therapeutic Tumorprøver

Vi næste fastslået, hvorvidt ekspressionsniveauerne af de gener, der udviste en betydelig eller moderat association med OS (p < 0,1, tabel 3 og 4) er forskellige præ-terapeutiske biopsier og deres tilsvarende indlæg -therapeutic tumor eksemplar. Derudover POU5F1
, LGR5
CCND1
blev analyseret, og tumor prøver af patienter med TRG2 eller TRG3 (hver n = 22) blev undersøgt.

Hos patienter med TRG2, udtryk for NOTCH2
, POU5F1
LGR5
steg betydeligt mellem præ- og post-terapeutiske prøver (p = 0,002, 0,028 og 0,017 henholdsvis) og udtryk for DNMT1
faldt (p = 0,009). I gruppen med TRG3, POU5F1
udviste et signifikant stigning (p = 0,002), mens DNMT1
CCND1
faldt betydeligt (p = 0,002 og 0,007 henholdsvis) .

med hensyn til udtryk for de prognostiske-relevant gener GSK3b
CTNNB1,
blev ikke observeret nogen statistisk signifikante forskelle mellem præ- og post-terapeutiske tumorprøver ( tabel 5 og tabel S2 og S3).

Analyse af offentligt tilgængelige Array data

for at vurdere den generelle prognostiske værdi af GSK3b
^{høj, CTNNB1
høj og NOTCH2
lav udtryk mønster, vi brugte et offentligt tilgængelige udtryk array-datasæt af gastriske carcinomer [33]. Datasættet omfattede generne af interesse og de relevante kliniske nødvendige oplysninger (OS, tumor fase) til at udføre en tilsvarende analyse. Bestemmelsen af ​​de optimale afskæringsværdier for genekspression for korrelation med overlevelse og evaluering af det kombinerede udtryk underskrift GSK3b
høj, CTNNB1
høj og NOTCH2
lav identificeret en gruppe på 10 patienter, som havde en signifikant længere overlevelse (p = 0,017, median OS: ikke nået) sammenlignet med de 47 resterende patienter (median OS: 14,0 mo, 95% CI: 8,7 -19,4) (Figur 1D).}

Beregning af partituret risiko for denne patientgruppe og dichotomisation af patienterne i henhold til den optimale cut-off værdi for OS viste en betydeligt længere OS for gruppen med lav risiko (n = 27) sammenlignet med højrisikogruppe (n = 30), selvom forskellen ikke var statistisk signifikant (median overlevelse 21 versus 13 måneder p = 0,110). I betragtning af forskellene i de respektive overlevelsesrater ved 1, 2 og 3 år demonstreret analoge resultater med den mest åbenlyse forskel på 2 år med en overlevelsesrate på 45% af patienterne i lav risiko og 21% af patienterne de højrisiko (p = 0,071 ) (tabel S7).

immunhistokemisk analyse af NOTCH2

for at vurdere forskellene i genekspression mellem de parrede før og efter terapeutiske tumorer på proteinet niveau, vi udførte immunhistokemi og fokuseret på NOTCH2 (fig S1B og C). Vi analyserede de samme patientgrupper, der var blevet undersøgt på mRNA-niveauet. Desuden blev 21 patienter med TRG1b og en kontrolgruppe af 16 patienter behandlet med kirurgi alene medtaget.

En sammenligning af cytoplasmatiske farvningsintensiteter mellem præ-terapeutiske biopsier og deres tilsvarende post-terapeutiske tumorer afslørede en statistisk signifikant stigning i farvning intensitet i de post-terapeutiske prøver fra patienter med TRG1b, 2 og 3 (p = 0,016, 0,001, og 0,017 henholdsvis). I modsætning hertil blev der ikke observeret forskelle hos patienter behandlet med kirurgi alene (p = 0,438) (figur 2). Procentdelen af ​​farvede celler blev ikke ændret signifikant. Med hensyn til nuklear farvning, blev et signifikant fald i farvning intensitet i de post-terapeutiske tumor eksemplar fundet i gruppen med TRG2 (p = 0,007), TRG3 (p = 0,015) og i kontrolgruppen ikke behandles med kemoterapi (p = 0,016) . Et signifikant fald i procentdelen af ​​celler med farvede kerner blev observeret i gruppen med TRG1b (p = 0,005), TRG2 (p < 0,001), TRG3 (p = 0,003) samt i kontrolgruppen (p = 0,001).

diskussion

Vores undersøgelse analysere ekspressionen af ​​CSC relaterede gener i resterende gastriske kræftceller efter neoadjuverende kemoterapi identificeret et gen signatur med en høj prognostisk effekt består af GSK3b
, den β-catenin
gen CTNNB1 og NOTCH2
. Interessant, høj ekspressionsniveauer af CTNNB1
og GSK3b
var forbundet med øget overlevelse. Β-catenin er en central molekyle i transmissionen af ​​Wnt signalering til kernen og driver flere cellulære processer [35]. Aberrant Wnt signalering er blevet påvist i op til 46% af GCS, og celleekspressionsvektorer signaturer angiver den respektive pathway aktivering blev forbundet med nedsat patientoverlevelse [36] både Wnt / β-catenin
og proliferation /stamceller. CTNNB1
mRNA-niveauer kan modulere Wnt signalering [37], og Wnt-aktivitet er blevet forbundet med kræft stemness i tyktarmen [38]. På baggrund af disse data, en negativ sammenslutning af CTNNB1
udtryk i tilbageværende tumorceller efter kemoterapi og overlevelse af patienterne ville have forventet. Men β
catenin er også en del af E-cadherin-cateninkomplekset og ændringer i denne celle adhæsion kompleks har været forbundet med dårligere prognose i forskellige tumorer [39]. I GC, modstridende resultater vedrørende sammenhængen mellem β
catenin udtryk og patient prognose findes [40], [41].

Det er vigtigt at bemærke, at GSK3b er også et multifunktionelt protein involveret i forskellige signalsystemer net og antagoniserer Wnt signalering ved at mediere nedbrydningen af ​​ β
catenin, selv om en Wnt-aktiverende funktion også er blevet beskrevet [42] - [44]. Øget ekspression af GSK3b
var forbundet med en gunstig prognose i vores undersøgelse, hvilket er i overensstemmelse med en rapport om højere GSK3b
mRNA-ekspression er forbundet med bedre overlevelse i æggestokkene høj kvalitet serøse carcinomer [45 ].

Højere NOTCH2
ekspressionsniveauerne korreleret med dårligere overlevelse i vores GC patienter. Den Notch receptor familien omfatter fire medlemmer, og NOTCH1 og NOTCH2 har været impliceret at forbedre mavekræft progression [46], [47]. Desuden er der rapporteret en sammenslutning af NOTCH1 udtryk med dårlig prognose [48], som ikke er i overensstemmelse med vores resultater; men på grund af forskellene i studiepopulationer disse resultater ikke direkte sammenlignelige.

I betragtning af den meget signifikant association af genet signatur omfatter CTNNB1
, GSK3b
NOTCH2
med patientens overlevelse og den betydelige risiko score-baseret klassifikation af patienterne i en høj og lav risiko gruppen, var vi særligt interesserede, hvis det var relateret til kemoterapi. Sammenligningen af ​​ GSK3b
CTNNB1
udtryk niveauer mellem før og efter terapeutiske tumorprøver viste ingen klare forskelle, mens en signifikant stigning i ekspressionen af ​​ NOTCH2
blev fundet. Dette fund tyder på, at CTNNB1
GSK3b
udtryk kan afspejle en ejendom af den primære tumor, der ændres ikke af kemoterapi, og at NOTCH2
udtryk i de resterende tumorceller er mindste delvis relateret til denne behandling.

en analyse af den prognostiske betydning af de tre gener i offentligt tilgængelige genom-dækkende udtryk data af avanceret GC viste en signifikant association for den specifikke genekspression mønster af GSK3b
^{høj, CTNNB1
høj og NOTCH2
lav udtryk og øget patient overlevelse og en lignende tendens overvejer risikoscore-baserede klassificering.}

Dette fund understøtter den fortolkning, at den prognostiske effekt observeret i vores undersøgelse primært afspejler en egenskab af den primære gastrisk tumor, hvilket tyder på en kritisk rolle for disse gener i biologi af disse tumorer. Desuden kan den prognostiske effekt observeret forøges ved en stigning i ekspressionen af ​​ NOTCH2
i den resterende tumor efter kemoterapi. Så hvis valideret i et prospektivt studie, kan denne tre gen signatur være nyttigt for risiko lagdeling af GC patienter og derudover kan guide postoperativ behandling efter neoadjuverende kemoterapi.

Vores resultater er minder om en nylig undersøgelse analyserer en CSC- afledt gen signatur, forudsiger tumor tilbagefald i tyktarmen og viser, at den forhøjede udtryk for Wnt målgener er tegn på en gunstig prognose [48]. Forfatterne giver dokumentation for, at denne forening mere sandsynligt afspejler differentiering status malignt væv snarere end antallet af CSCS [49].

I overvejer ændringer af NOTCH2
udtryk mellem tilsvarende præ- og post-terapeutiske tumorer, er det vigtigt at bemærke, at sammenligne genekspression på mRNA-niveau, ikke kan skelne, om disse ændringer afspejler en relativ berigelse af de celler, der udtrykker dette gen, hvad enten de skyldes de kemoterapeutiske midler, der påvirker gentranskription i celler per se
, eller om ændringerne afspejler blot prøveudtagning forskelle. For at afklare dette spørgsmål, vi analyserede NOTCH2 proteinekspression ved immunhistokemi og omfattede tumorer fra patienter behandlet med kirurgi alene. Baseret på den cytoplasmatiske farvning, vores resultater bekræfter en stigning i NOTCH2 udtryk på proteinniveauet i de post-terapeutiske tumorer, og de viser, at de observerede forskelle vil sandsynligvis være begrænset til patienter, der behandles med kemoterapi. Af note, blev stigningen i NOTCH2 Udtryk med relation til en stigning i cytoplasmatiske farvningsintensitet frem til en stigning i antallet af celler, der udtrykker NOTCH2. Dette resultat taler imod en berigelse af en subpopulation af NOTCH2-udtrykkende tumorceller og mere sandsynligt foreslår en kemoterapi-induceret stigning i genekspression i tumorceller, og som kan være relateret til tumoren biologiske funktioner efter neoadjuverende behandling. Dog kan en klar sondring mellem disse muligheder være begrænset af den semikvantitative vurdering af immunhistokemisk farvning. Som blev observeret lignende ændringer i nuklear farvning i alle tumor grupper herunder kontrollen vi betragtede disse ændringer som relateret til kemoterapi.

Uanset mekanismen og den sande natur af de resterende tumorceller, der udtrykker NOTCH2
kan vores resultater have terapeutiske implikationer. Notch signalering har vist sig som en potentiel ny terapeutisk mål, og gamma-sekretase hæmmere, som hæmmer behandlingen af ​​Notch-receptorerne, er ved at blive evalueret i kliniske forsøg [50]. Vores undersøgelse tyder på, at målrette Notch signalering også kan repræsentere en ny strategi til behandling af GC patienter. Som en negativ prognostisk effekt kun var forbundet med NOTCH2
og ikke NOTCH1
, vores data viser også, at en detaljeret karakterisering af de enkelte Notch receptorer og en grundig funktionel undersøgelse er obligatoriske og yderligere kraftigt favoriserer udvikling af Notch paralog-specifik hæmmende stoffer.

En betydelig stigning i POU5F1
udtryk blev observeret efter kemoterapi i de resektion prøver i vores undersøgelse. Den POU5F1 transskriptionsfaktoren er afgørende for opretholdelsen af ​​selvfornyelse, og dens høje ekspression i resterende cancerceller efter radiochemotherapy er korreleret med dårlig prognose i tyktarmskræft [51]. Interessant vi også observeret en forøget ekspression af LGR5
, en lovende intestinal CSC markering, efter kemoterapi i tumorer med TRG2 [18]. Disse resultater er kompatible med den mulige berigelse af lægemiddelresistente tumorceller, der udtrykker POU5F1
eller LGR5
, men den underliggende mekanisme for disse ændringer og de særlige egenskaber for cellerne, der udtrykker disse gener mangler at bestemmes

i vores undersøgelse, blev ingen sammenhæng med overlevelse observeret for celleoverflademolekyler CD44 eller CD133, som begge er ofte blevet brugt til at identificere formodede CSCS i forskellige tumorer [4] -. [11]. Dette resultat understøtter de seneste resultater der viser, at disse celleoverflademolekyler ikke identificerer CSCS i primære gastriske tumorer [20].

Tilsammen vores resultater viser, at udtrykket underskrift GSK3b
^{høj, CTNNB1
høj og NOTCH2
lav i kemoterapi-resistent resterende GC tumorceller er en stærk prædiktor for gunstig patient prognose. Denne prognostisk relevans blev også påvist for GC patienter ved hjælp af offentligt tilgængelige genekspression data. Resultaterne af den differentielle ekspression analyse af de før og efter terapeutiske tumor eksemplar antyder også, at virkningen af ​​ GSK3b
CTNNB1
til denne signatur er ikke afhængig af kemoterapi, men snarere relateret til en egenskab af den primære tumor. De har endvidere angive en fremtrædende rolle for NOTCH2 og kemoterapi modstand i GC, som er mere sandsynligvis relateret til en effekt af de kemoterapeutiske agenter på NOTCH2
udtryk snarere end til en berigelse af NOTCH2
udtrykke tumor celler.}

Støtte Information
figur S1.
Western blot og immunhistokemi med anti-NOTCH2 antistof. A) antistof rettet mod det NOTCH2 intracellulære domæne detekterer specifikt fuldlængde NOTCH2 protein over 250 kDa markøren samt de spaltede former NOTCH Ekstracellulær Trunkerede (NEXT) og NOTCH intracellulære domæne (NiCd) ved ca. 110 kDa. B) En svag cytoplasmatisk immunhistokemisk farvning i den præ-terapeutisk biopsiprøve og C) en stærk cytoplasmatisk farvning i den tilsvarende post-terapeutisk tumor med TRG2 vises. Scale søjler indikerer 50 um
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044566.s001
(TIF)
tabel S1.
Multivariat Cox regressionsanalyse. Genekspression af GSK3b, CTNNB1, DNMT1
og standard prognostiske variabler i GC, YPT, YPN, YPM og resektion kategori blev inkluderet i modellen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044566.s002 Hotel (DOC)
tabel S2.
Genekspression data for præ- og tilsvarende post-terapeutiske tumor prøver af patienter med TRG2
doi:. 10,1371 /journal.pone.0044566.s003
(DOC)
tabel S3.

• PLoS ONE: Den prognostiske værdi af høstede lymfeknuder og metastatisk lymfeknuder Ratio for mavekræft Patienter: resultaterne af en undersøgelse af 1.101 patienter
• PLoS ONE: N-myc Downstream Reguleret Gene 1 (NDRG1) Fremmer Metastase for Human scirrhous mavekræft Cells via Epithelial Mesenchymale Transition