Финансирование:. Это исследование была частично поддержана Национальным научно-исследовательским и фонд развития рака Центр (23-а-9), а также грантами-в помощи научных исследований (KAKENHI, пп. 20591573, 22390262 и 23390329) из Министерства образования, науки, спорта, культуры и технологии Японии. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
Конкурирующие интересы:. Авторы имеют следующие интересы. KS, TS, и AM являются сотрудниками Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd. Ki26894, которая была использована в данном исследовании, является продуктом Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd. Там нет других патентов, продукты в разработке или продаваемые продукты объявить , Это не меняет приверженность авторов на всех политик PLoS ONE на данных и материалов обмена, как подробно на сайте в руководстве для авторов.
Материалы и методы
Культура клеток и клеточных линий
<р> было использовано семь линий рака желудка клеток. OCUM-2MD3 [25], OCUM-12 [26], OCUM-2М [27], КАТО-III [28], и MKN-45 [29] были получены из карциномы диффузного типа желудка. MKN-74 [29] и MKN-7 [29] были получены из кишечного типа. OCUM-2М, OCUM-2MD3 и OCUM-12 были establised в нашей лаборатории, как сообщалось ранее [25] - [27]. Вкратце, OCUM-12was, полученные из асцита, связанных с диффузного типа желудочной карциномы, и клетки OCUM-2MD3, линии дочерней клетки с высоким потенциалом перитонеального метастазирования, были созданы из клеток OCUM-2М с использованием ортотопической модели опухоли, клеточная линия, асцит родителей связанная с карциномой желудка диффузного типа. Другие клеточные линии были получены из банка клеток JCRB (Осака, Япония) или Американской коллекции типовых культур (Rockville, MD). Клетки культивировали при 37 ° С в 21% O <суб> 2 (нормоксии) или 1% O <суб> 2 (гипоксия). Гипоксических условия были сохранены с использованием модульного инкубатора камеры (Хирасава, Токио, Япония) с 5% CO <суб> 2 и 1% O <суб> 2 сбалансированы с N <югу> 2 газа. Культуральная среда состояла из модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM;. Nikken Bio, Осака, Япония) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (. Nichirei Bio), 100 МЕ /мл пенициллина (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA), 100 мкг /мл стрептомицина (ICN Biomedicals), и 0,5 мМ пирувата натрия (Cambrex, Walkersville, MD).
Морфологические изменения
<р> Раковые клетки культивировали под нормоксических или гипоксических условиях в течение 24 ч, и морфология клеток наблюдалась микроскопически. ЕМТ определяли, когда полигональный или шпиндель форма была найдена в раковых клетках с помощью фазово-контрастного микроскопа. Частота EMT оценивали по скорости полигональных или веретенообразных клеток во всех раковых клеток; EMT скорость = количество ломаных или шпинделя ячеек формы /общее количество клеток × 100 (%).
Количественные в режиме реального времени с использованием обратной транскриптазы-полимеразы цепной реакции (RT-PCR) Результаты Влияние гипоксии на раковых клеток морфологии эффекты гипоксии на <ЕМ> TGF 1 эффекты гипоксии на Smad2 фосфорилирования клеточных линий рака желудка в OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток, Smad2 фосфорилирования была увеличена при гипоксических условиях, по сравнению с тем под нормоксических состояние. В противоположность этому, Smad2 фосфорилирования не была увеличена при гипоксических условиях в клетках OCUM-2М (рис. 4). Эффекты гипоксического состояния на факторы, связанные с EMT. В последнее время некоторые исследования сообщили, что гипоксической микросреда окружающих твердых опухолевых клеток может способствуют раку прогрессии [30] - [34]. Однако молекулярные механизмы, ответственные за прогрессирования рака в условиях гипоксии остаются неясными. Сообщалось, что гипоксия является одним из триггеров для EMT [35]. В настоящем исследовании, гипоксической состояние индуцированного EMT в диффузного типа желудочных линий раковых клеток OCUM-2MD3 и OCUM-12, но не в клетках кишечного типа. Диффузный тип рака желудка характеризуется более высокой злокачественности, чем рак кишечного типа желудка [36]. ЕМТ потенциал раковых клеток при гипоксии может быть одной из причин высокой злокачественного потенциала рака желудка диффузного типа. Поддержка информации Рисунок S1
<р> Количественный ОТ-ПЦР проводили для изучения TGF 1
, TGFβRI, TGFβRII,
и выражения виментин
мРНК. Раковые клетки инкубировали при нормоксических условиях и в условиях гипоксии в течение 24 ч. После инкубации общее клеточную РНК экстрагировали с использованием реагента тризола (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя. После удаления геномной ДНК с помощью ДНКазы, кДНК получали из 2 мкг РНК с Малони вируса мышиного лейкоза обратной транскриптазы (Invitrogen) с использованием метода случайных праймеров (Invitrogen). Для определения изменения Сложить в каждом гене, в режиме реального времени RT-PCR проводили на ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), используя коммерчески экспрессии генов анализов доступны для TGF 1
(Hs00998130,), TGFβRI
(Hs00610319), TGFβRII
(Hs00559661), виментин
(Hs00958116), Twist
(Hs01675818), Zeb1 <бр> (Hs 00232783), Snail1
(Hs00195591), VEGFA
(Hs00900055). ПЦР проводили при температуре 95 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 60 сек в течение 40 циклов. Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) использовали в качестве внутреннего стандарта, чтобы нормализовать уровни мРНК для различий в концентрации образца и нагрузки. Сложите изменения в экспрессии каждой мРНК-мишени по отношению к GAPDH была рассчитана на основе порогового цикла (Ct), как 2 -Δ (Δ CТ), где Δ CТ = Ct мишенями Ct GAPDH и Δ (Δ CТ) = Δ CТ <суб> гипоксией Δ CТ <суб> нормоксии. Количественные ПЦР-реакции проводили в трех повторностях.
Вестерн-блот-анализ
<р> Для изучения влияния гипоксии на Smad2 фосфорилирования, раковые клетки инкубировали при нормоксических или гипоксических условиях в течение 24 ч, соответственно. Клетки подвергали лизису в буфере для лизиса, и аликвоты, содержащие 50 мкг общего белка подвергали электрофорезу с додецилсульфатом натри в полиакриламидном геле; белковые полосы были переданы поливинилидендифторидную мембрану (Millipore, Billerica, MA). Мембрану инкубировали в TBS-T (10 мМ TBS и 0,05% Tween 20), дополненной 5% обезжиренное молоко или 5% бычьего альбумина (Sigma) при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем мембрану помещают в раствор TBS-T, содержащий первичное антитело, р-Smad2 (сир 465/467; 1: 1000; Cell Signaling Technology), или Smad2 /3 (1: 1000; Cell Signaling Technology), Виментин (1: 1000; Cell Signaling Technology), анти-βactin (1: 1000; Sigma) и давали прореагировать при 4 ° с в течение ночи. Затем каждое антитело трижды промывали TBS-T в течение 10 мин, и меченых пероксидазой вторичное антитело (GE Healthcare, Buckinghamsire, Великобритания) реагирует с добавляли первичное антитело. Полосы детектировали с использованием усовершенствованной системы хемилюминесценции (WAKO, Осака, Япония).
иммуноферментного анализа (ИФА)
<р> Производство TGF 1 из раковых клеток измеряли с помощью количественного сэндвич-фермента метод иммуноанализа с использованием набора Quantikine человеческого TGF 1 ELISA, в соответствии с инструкцией (R s изготовления &Amp; D Systems). Раковые клетки инкубировали при гипоксии или нормоксии в течение 24 ч, затем среду замен ли на 3 мл DMEM, содержащей сыворотку. Клетки инкубировали при гипоксии или нормоксии, в течение дополнительных 24 ч. Условный средний (СМ) собирали из каждой чашки и центрифугировали при 1000 <ЕМ> г
в течение 5 мин. Уровень TGF 1 в сыворотке крови свободного CM измеряли с помощью ELISA набора. ИФА обнаружен как активный и латентный TGF-beta.
Статистический анализ
<р> Сравнения между наборами данных были сделаны с Студента т
-test или Крускала-Уоллиса однофакторного дисперсионного анализа с помощью ряды с последующим многократным сравнительного теста Данна. Различия считались статистически значимыми, когда значение P было &л;. 0,05
<р> гипоксического состояние значительно увеличилось число полигональных или веретенообразных клеток, подвергающихся EMT среди OCUM-2MD3 или OCUM-12 клеток, но не входит в число OCUM-2М, MKN-7, MKN-45, MKN-74 или клеток КАТО-III (рис. 1А и фиг. S1). Морфология клеток из OCUM-2MD3 и OCUM-12 начали менять через 4 ч в гипоксических культуре. Через 12 ч культуры, увеличение скорости EMT наблюдалась в обеих клеточных линиях. Скорость ТЭИ OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток была самой высокой в 24 ч гипоксического культуры (рис. 1В). Поскольку морфологические изменения были очевидны в 24 ч культивирования при гипоксии, молекулярные механизмы ЕМТ были проанализированы в 24 ч культивирования в условиях гипоксии с использованием OCUM-2MD3, OCUM-12 и OCUM-2М клетки.
Влияние различных факторов роста на клетки рака морфологии
<р> Растворимые факторы были использованы при концентрациях 10 или 100 нг /мл. OCUM-2MD3 и OCUM-12 клетки стали веретенообразный с последующим добавлением TGF 1 или HGF, но не после добавления EGF, FGF2, FGF7, IGF1, VEGF или PDGF-BB через 24 ч при нормоксии (таблица 1). В противоположность этому, OCUM-2М клетки не показали изменения морфологического после добавления каких-либо факторов (рис. 2).
Эффекты нейтрализующих антител на раковых клеток морфологии при гипоксии
<р> ЕМТ, индуцированный гипоксией было частично ингибируется анти-TGF- 1 антителом при 100 мкг /мл, а не с помощью анти-HGF антитела (таблица 2).
, TGFβRI
и TGFβRII
экспрессия мРНК клеток рака желудка
<р> уровень экспрессии TGF-beta
была существенно (р &л; 0,001) увеличилась при гипоксических условиях во всех OCUM -2MD3, OCUM-12, и OCUM-2M клеток, по сравнению с уровнем при нормоксии (рис. 3, а). Уровни экспрессии TGFβRI
и TGFβRII
были значительно увеличены при гипоксических условиях в клетках OCUM-2MD3. В противоположность этому, уровни TGFβR1
и TGFβR2
выражение значительно уменьшилось при гипоксических условиях в клетках OCUM-2М (рис. 3, б).
Влияние гипоксии на производство TGF 1 высвобождается из клеток рака желудка
<р> TGF 1 продукция из OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток достоверно (р &л; 0,001) увеличилась в условиях гипоксии по сравнению с нормоксии, но не то, что из клеток OCUM-2М (рис 3C. ).
Влияние ингибиторов киназы фосфорилирования на EMT и экспрессию виментина в гипоксия
<р> В любом из
TGFβR ингибиторы фосфорилирования, Ki26894 и SB431542, тормозил морфологические изменения OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток под гипоксического состояния, но три других ингибиторов, Лапатиниб, Сунитиниб и PHA665752, не сделал (рис 5A, 5B). С другой стороны, ни один из ингибиторов не имели никакого влияния на морфологию OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток под нормоксии (данные не показаны). Уровень экспрессии виментина
, который был использован в качестве маркера ЕМТ, была значительно увеличена гипоксией, и была уменьшена либо из ингибиторов TGFβR Ki26894 и SB431542 (5С). Уровень Виментин белка также увеличивается при гипоксии, и была уменьшена либо ингибиторов TGFβR Ki26894 и SB431542 (рисунок 5D).
<р> Гипоксическая состояние значительно увеличилось VEGF-A
уровня мРНК в OCUM-2М, OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток. Уровень экспрессии Twist
или Zeb1
была значительно увеличена гипоксией в OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток, но была снижена в клетках OCUM-2М. Повышенная экспрессия Twist
или Zeb1
была снижена либо из ингибиторов TGFβR Ki26894 и SB431542 в OCUM-12 клеток. Гипоксическая состояние не влияет на уровень экспрессии Snail1
(Рисунок 6).
Обсуждение
<Р> Многие исследования показали, что некоторые молекулы могут повлиять на EMT раковых клеток, в том числе TGF-beta [23 ], [37], EGF [38], и PDGF [39]. В настоящем исследовании, стимулировали TGF-beta ТЭИ OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток, но EGF и PDGF не сделал. Кроме того, EMT индукция при гипоксических условиях значительно снизилась анти-TGF-beta нейтрализующих антител или ингибиторы фосфорилирования TGFβR в обоих OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток. В совокупности эти результаты указывают на то, что уровень производства TGF-beta в раковых клетках была значительно увеличена при гипоксии, а также уровни экспрессии TGFβR и Smad2 фосфорилирования были увеличены на гипоксию. Виментин является характерным компонентом мезенхимальных клеток и, как правило, не выражены в эпителиальных клетках. Поскольку выражение <ЕМ> виментин
в эпителиальных клетках играет существенную роль в EMT через взаимодействие с актином и других промежуточных филаментов [40], виментин был использован в качестве маркера ЕМТ в данном исследовании. Уровень экспрессии виментин
была значительно увеличена на гипоксию, а также была уменьшена с помощью ингибиторов фосфорилирования TGFβR Ki26894 и SB431542. Эти результаты свидетельствуют о том, что EMT при гипоксических условиях связано с акустической сигнализации аутокринная TGF-beta /TGFβR при раке желудка диффузного типа. Несколько исследований сообщили о корреляции между ЕМТ и TGF-beta сигнализации в условиях гипоксии. [2], [21], [23], [32], [37] При раке желудка, сообщалось, что ЕМТ коррелирует с злокачественности раковых клеток и отвечает за вторжение и метастазирование раковых. Однако механизмы, ответственные за ТЭИ клеток рака желудка остаются неясными. В данной статье уточнено, что EMT желудка раковых клеток индуцировали с помощью TGF-beta сигнализации при гипоксии. ингибиторы TGFβR может таким образом быть перспективными агентами для лечения желудка раковых метастаз.
<р> Гипоксия стимулировала EMT клеток OCUM-2MD3, но не то, что из клеток OCUM-2М. ЕМТ участвует в развитии инвазию и метастазирование раковых. В то время как OCUM-2MD3 является "дочка" клеточная линия OCUM-2М [25], [34], OCUM-2MD3 клетки имеют более высокий потенциал для метастазирования к брюшине у голых мышей, чем клетки OCUM-2М [25], [34] , Раковые клетки свободные мигрировать в брюшной полости подвергаются гипоксии из-за отсутствия проксимальный питающего сосуда [41]. Уровень экспрессии TGF 1
мРНК при гипоксии была значительно выше, чем при нормоксии во всех трех клеточных линий. В отличие от этого, уровень экспрессии TGFβRI
и TGFβRII
мРНК была значительно увеличена гипоксией в клетках OCUM-2MD3, но не в клетках OCUM-2М. Различные ответы TGFβR
выражение между нормоксии и гипоксии может быть одним из ключевых причин гипоксии, вызванной ЕМТ. Ранее мы сообщали, что желудочные раковые клетки при гипоксии показали EMT и высокие миграционные и инвазивные мероприятия по сравнению с раковыми клетками в нормоксии [34]. Повышающая регуляция EMT гипоксических раковых клеток может быть одной из причин более высокого потенциала для метастазами в брюшину в клетках OCUM-2MD3 по сравнению с клетками OCUM-2М.
<Р> состояние Гипоксическая значительно повысило уровень экспрессии из Twist
и Zeb1
в OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток, но не то, что в клетках OCUM-2М. Гипоксией повышение активности Twist
и Zeb1
выражение было снижено с ингибиторами TGFβR (Ki26894 и SB431542) в OCUM-12 клеток. ЕМТ в условиях гипоксии может быть частично регулируется факторами транскрипции, Twist
и Zeb1.
<Р> Несмотря на то, что HGF влияние морфологии клеток рака в OCUM-2MD3 и OCUM-12 клеток, гипоксия-индуцированный EMT не ингибируется анти-HGF нейтрализующих антител или ингибитора с-Met в любом OCUM-2MD3 или OCUM-12 клеток. производство HGF не был обнаружен в OCUM-2MD3 или OCUM-12 клеток при гипоксии либо и нормоксии (данные не показаны). Большинство HGF происходит из стромальных клеток при раке желудка [42]. В то время как HGF, не может играть важную роль для гипоксия-индуцированного EMT, HGF, может стимулировать EMT раковых клеток через взаимодействие с раком стромальных
. <Р> гипоксия-индуцированный EMT клеток OCUM-2MD3 частично ингибируется ингибиторами TGFβR , но различные другие ингибиторы, включая ингибитор с-Met, ингибитор PDGF, ингибитор EGFR и ингибитор VEGFR, не имел никакого влияния на гипоксия-индуцированного EMT в данном исследовании. Эти данные свидетельствуют о том, что другой фактор (ы) может быть связано с гипоксией, вызванной ЕМТ в некоторых раковых клетках. В будущих исследованиях, будет необходимо рассмотреть другие новые факторы, которые могут изменить морфологию рака
. <Р> В заключение аутокринная TGF-beta /TGFβR сигнализации при гипоксии может быть одним из факторов, связанных с агрессивным фенотипом ЕМТ в желудочные клетки карциномы. Ингибиторы сигнализации TGF-beta /TGFβR, как представляется, терапевтически перспективными при раке желудка.
.
Морфологические изменения клеток желудка под гипоксического состояния. В MKN-7, MKN-45, MKN-74 и КАТО-III, морфологические изменения не были найдены при гипоксии
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0062310.s001
(TIF)