Введение <бр>
MicroRNAs (микроРНК) небольшие (19-23 нуклеотидов) некодирующих РНК, которые функционируют как пост-транскрипционных регуляторов экспрессии генов и играют важную роль в регуляции многих биологических процессов, в том числе клеточной дифференцировки, пролиферации, и апоптоз [1]. МикроРНК было показано, что у онкогенных или подавления роста опухолей активностью, и дерегулированы экспрессию многих видов микроРНК была обнаружена в нескольких видов рака, что предполагает потенциальное применение микроРНК в качестве биомаркеров прогрессирования рака и метастазирования [2-5].
<Р> микроРНК завернутые в секреторных микропузырьков (например, экзосомы апоптотических тел и проливают микровезикулы), которые экранируют микроРНК от деградации РНКазы и служат в качестве транспортных средств для секреции микроРНК в текущем межклеточное пространство и жидкости организма. Экзосомы небольшие Мембранные везикулы, которые участвуют в клеточных иммунных реакций; Тем не менее, в последнее время стало очевидным, что экзосомы содержат значительные количества РНК и могут быть вовлечены в иммунные независимые регулирующие механизмы. В настоящее время установлено, что экзосомы может выполнять межклеточную передачу микроРНК, таким образом, участвует в микроРНК основе сигнальных механизмов [6]. Более высокие уровни микроРНК-содержащие экзосомы также были обнаружены в плазме больных раком, чем в том, что у здоровых лиц [7], предполагая, что секреция микроРНК экзосом на основе участвует в развитии рака. Анализ экспрессии микроРНК аномальным в сыворотке, слюна, фекалии, и моча была использована для раннего обнаружения B-клеточной лимфомы, а также за полостью рта, кишечника, мочевого пузыря и рака [8-11].
<Р> Рак желудка (GC) является второй наиболее распространенной причиной, связанной с раком смерти во всем мире [12]. Брюшины является наиболее частым местом метастазирования и рецидива GC, и злокачественных асцит (MA), вызванное перитонеального распространением раковых клеток, были связаны с плохим прогнозом. В настоящее время нет надежных предикторов для развития злокачественных перитонеального асцита у больных ГЦ. Мирна содержащих экзосомы представляют собой новый механизм межклеточной сигнализации и может дать полное представление о среде, которая позволяет распространение рака в брюшине [13].
<Р> В этом исследовании экзосомы были выделены из МА и интраоперационного перитонеального лаважа (PLF) образцов, полученных от пациентов GC, и культуральную среду (СМ) высоко инвазивных перитонеальных клеточных линий, а также микроРНК затем были извлечены из этих образцов. Качество добываемых exosomal микроРНК и последовательность паттернов экспрессии микроРНК были проверены. экспрессии микроРНК профили MA, PLF и образцов КМ сравнивали и были определены кандидаты микроРНК, связанные с перитонеального распространения GC.
Материалы и методы
Пациенты
<р> Все пациенты или их опекуны дали письменное информированное согласие. Исследование было одобрено комитетом по этике Yokohama City University Hospital (Официальное утверждение № A110127001) с помощью.
<Р> МА и интраоперационных PLF образцы были собраны от GC больных с клинико-патологическими характеристиками, представленными в таблице 1. Все пациенты ранее были с диагнозом GC путем гистопатологического анализа образцов биопсии, взятых из первичных поражений и шесть пациентов МА был поставлен диагноз на наличие асцита брюшной компьютерной томографии (КТ). Асцит также анализировали с помощью цитологического и все они были подтверждены как положительные для злокачественных новообразований патологоанатомами; остальные образцы МА были использованы для микроРНК изоляции. PLF была интраоперативно собрана из 24 ГЦ пациентов (таблица 1). После лапаротомии, 100 мл физиологического раствора вливают в мешочке Дугласа и перитонеальный лаваж вода была собрана до хирургической резекции опухоли. PLF анализировали с помощью цитологического и используется для изоляции микроРНК. Среди 24 PLF образцов, шесть анализировали с помощью микроРНК микрочипов и 18 были проанализированы с помощью кПЦР.
Образцы для изоляции экзосома получали, как описано ранее [15]. Для того, чтобы удалить крупные частицы, и клеточные остатки клеток, МА, PLF, и СМ центрифугировали при 2000 × <ЕМ> г
в течение 15 мин при 4 ° С и фильтруют через фильтр с размером 0,22 мкм (Millipore, Billerica, MA). Супернатант хранили при -80 ° С до тех пор, пока требуется для извлечения микроРНК.
<Р> Для осаждения экзосомы, образцы центрифугировали при 110000 × <ЕМ> г
в течение 70 мин при температуре 4 ° С. Экзосом осадок промывали 11 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и снова центрифугировали, как описано. Осадок использовали для экстракции РНК.
Выбор перитонеального метастазирования конкретных микроРНК TaqMan микроРНК анализы (Life Technologies), были использованы для количественного определения относительного уровня экспрессии микроРНК-21 (для анализа ID. 000397), микроРНК-320c (анализ ID. 241053_mat), микроРНК-1225-5p (анализ ID. 002764) и микроРНК-16 (анализ ID. 000391). Обратную транскрипцию проводили с использованием набора TaqMan микроРНК RT (Life Technologies) при следующих условиях: 30 мин при 16 ° С, 30 мин при 42 ° С и 5 минут при 85 ° C. ПЦР проводили в 96-луночных планшетах с использованием 7500 система реального времени PCR (Life Technologies); Все реакции проводили в трех повторностях. Уровни экспрессии мишеней микроРНК были нормированы к тому, что из MIR-16, который был использован в качестве стабильно выраженного контроля [17]. При анализе наших микрочипов данные exosomal микроРНК в злокачественных образцах асцит, микроРНК-16 представлен самый низкий коэффициент вариации (CV = 4%) среди кандидатов внутренних стандартов, в том числе микроРНК-638 (CV = 8%), пусть-7а (CV = 8%), и 142-3p (CV = 23%). Статистический анализ Количественный анализ извлеченной exosomal РНК Производительность микроРНК микрочипов на сегодняшний день, данные не были доступны на профилей экспрессии exosomal микроРНК, связанных с перитонеальным распространения, из-за отсутствия нормальных жидкостей асцидные, по которым можно сравнивать профили экспрессии MA. Мы выбрали микроРНК, связанных с распространением перитонеального с использованием поэтапного подхода. Число микроРНК обычно захваченных в шести образцах МА 327. На этапах 1 и 2, 140 и 118 метастазирование конкретных микроРНК были выбраны в КМ и PLF групп, соответственно. Из этих 327, 140 и 118 микроРНК, пять микроРНК были выбраны в качестве кандидатов, связанных с перитонеальным распространения (рис 5). Два из них (MIR-1225-5p и микроРНК-320c) и микроРНК-21 с наибольшей интенсивностью сигнала среди MA конкретных микроРНК были оценено как дифференцированно выражены в 18 образцах PLF, используя КПЦР (таблица 3). Проверка экспрессии микроРНК кандидата КПЦР
<р> были проанализированы профили экспрессии микроРНК exosomal для выбора микроРНК, которые являются специфическими для GC брюшины распространение с использованием следующего поэтапного подхода. Шаг 1: микроРНК профили в КМ высоко метастатических перитонеальных клеток OCUM-2MD3 сравнивали с таковыми из родительских клеток неметастатической OCUM-2М, а дифференцированно, выраженные микроРНК (среднее Наклоняемый изменение, > 2) были выбраны <. BR> <р> Шаг 2: шесть PLF образцы были разделены на две группы: T4 (n = 4) и T1-T3 (п = 2), в соответствии со стадией рака по размеру опухоли и расширением (UICC-AJCC, 7 е издание). Этап Т4 ГХ характеризуется самой высокой частотой перитонеальных метастазов по сравнению с другими этапами [16]. Выражение микроРНК профили Т4 группы сравнивали с таковыми из группы T1-T3 и дифференциально выраженных микроРНК (среднее-кратное изменение, > 2) были выбраны
<р> Шаг 3:. Выбранные микроРНК, которые были общими для оба шага и которые были выражены в МА были дополнительно фильтруются в соответствии с интенсивностью сигнала. Те со значениями интенсивности больше, чем журнал <подразделам> 2 10 в МА и PLF были выбраны в качестве кандидатов микроРНК, связанных с перитонеальных метастазов; микроРНК-21 показал самую высокую среднюю интенсивность сигнала среди образцов МА. Дифференциальное выражение вида микроРНК, выбранный в шаге 3 было подтверждено в оставшихся 18 образцов PLF по QRT-PCR.
Количественный анализ экспрессии микроРНК перитонеального метастазирования специфичные по QRT-PCR
<р> Непрерывные переменные сравнивались с использованием Стьюдента т
-test. При необходимости, т
-test был изменен, чтобы сравнить неравные дисперсии. Различие между категориальными переменными оценивали с помощью точного критерия Фишера. Корреляция между двумя переменными оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона. Различия считались статистически значимыми при Р &ЛТ; 0.05. Статистический анализ был проведен с использованием SPSS 21,0 программного обеспечения для Windows (IBM, Армонк, штат Нью-Йорк).
Результаты
<р> Суммарную РНК экстрагировали из экзосомы изолированных от MA, интраоперационной PLF и клеток КМ. Средняя концентрация извлеченного exosomal РНК составила 4,4 нг /мкл (в диапазоне от 1,2 до 6,1 нг /мкл) для МА и 6,4 нг /мкл (от 1,7 до 16,4 нг /мкл) для PLF. Электрофореграммы показал значительную долю мелких видов РНК, присутствующих во всех КМ и клинических образцах, в то время как нет или очень мало загрязнения с 18S и 28S рибосомальной РНК (без каких-либо ярко выраженных пиков, расположенных на соответствующих молекулярной массе) не наблюдалось (рис 1).
<р> Чтобы проверить экспрессию exosomal микроРНК микрочипов в каждой группе образцов, мы исследовали количество обнаруженных микроРНК, процентиль интенсивности сигнала, количество обычно захваченных микроРНК, и соотношение выражение микроРНК среди групп. Число видов микроРНК, обнаруженных в каждой группе по микрочипе приведена на рис 2. В шесть МА и шесть PLF образцов, эти средние цифры были 490,1 (SD = 42,3; CV = 8,6%) и 367,5 (SD = 13,4; CV = 3,6%), соответственно. В каждой группе, изменчивость числа обнаруженных микроРНК среди образцов была низкой
<р> распределение интенсивности сигнала для каждой группы представлена на рис 3. это показывает, обработанные сигналы нормированные на 25, 50, 75 и 90 й процентиль в каждой группе. В 50 й процентиль, журнал <югу> 2 относительные интенсивности сигналов для МА (рис 3-1) и PLF (рис 3 и 2) образцов и среди трех групп (МА, PLF и СМ, рис 3 и 4) были 5,53 ± 0,19 (CV = 3,49%), 6,14 ± 0,24 (CV = 3,87%), и 4,97 ± стандартное отклонение (CV = 5,24%), соответственно. Изменчивость интенсивности сигнала среди образцов в каждой группе, а также среди групп была низкой.
<Р> Числа микроРНК часто встречающиеся среди образцов в группах МА, PLF и СМ были 327, 263 и 354 , соответственно, в то время как это было 194 для трех групп (рис 4).
<р> Таблица 2 показывает соотношение экспрессии микроРНК между каждыми двумя образцами. Самые высокие и самые низкие значения CC были 0,94 и 0,68 соответственно; средний СС всех образцов была 0,79 (CV = 8,86%). В МА, PLF и СМ групп, средние значения CC были 0,85, 0,88 и 0,90, соответственно, и изменчивость в выражении профилей для каждой группы была низкой.
Выбор кандидатов микроРНК, связанных с распространением перитонеального
<р> Восемнадцать PLF образцы были разделены на две группы в соответствии с метастатической стадии, T4 (перфорированная серозной, п = 9) и T1-T3 (subserosa или менее, п = 9), и выражение MIR-21, MIR-320C и MIR-1225-5p анализировали с помощью QRT-PCR. Рисунок 5 показывает, что уровни микроРНК-21 и MIR-1225-5p у больных ГХ Т4 стадии были значительно увеличены по сравнению с теми, в Т1-Т3 пациентов (MIR-21, P = 0,027, и микроРНК-1225-5p, P = 0,008; рис 5). Различие в экспрессии микроРНК-320C между двумя группами пациентов был незначимым (р = 0,928, рис 6).
<Р> Далее была изучена зависимость между уровнями микроРНК и клинической фоне пациентов GC (Таблица 4). Выражение MIR-21 и микроРНК-1225-5p была значительно выше у пациентов с раком T4 стадии, чем в Т1-Т3 стадии пациентов (р = 0,015). Нет существенной корреляции не было найдено между экспрессией микроРНК и других клинических параметров.
Обсуждение
<р> В данном исследовании мы исследовали, в первый раз, содержание микроРНК экзосом, выделенных из МА и PLF ГК пациентов. Наше исследование показывает, что exosomal микроРНК могут быть последовательно извлечены из МА и PLF и что профили экспрессии микроРНК может указывать на состояние брюшины у больных ГЦ.
<Р> Прогноз GC с серозной вторжения остается бедным даже после резекции R0, потому что высокой скорости рецидива, особенно перитонеальных метастазов (ПМ) [18]. ПМ в GC является наиболее сложный вид рецидива, так как трудно предсказать, а также для диагностики. Несмотря на то, асцит является наиболее распространенным симптомом PM, многие пациенты GC с ПМ не развиваются асцит. Среди изображений на основе диагностических методов, высокоскоростной СКТ широко используется для оценки предоперационной постановки GC и после терапевтического наблюдения; Тем не менее, в случае ПМ ее диагностическая точность недостаточна, в основном из-за низкой чувствительности [19]. Использование ПЭТ-КТ для диагностики ПМ в GC также является спорным, поскольку сообщалось, что ФДГ-ПЭТ обладает низкой чувствительностью для обнаружения ТЧ в GC [20]. PLF стала следующей мишенью для диагностики и прогнозирования ТЧ в GC. Цитологическое исследование интраоперационного собранной PLF используется для прогнозирования перитонеального рецидива [21] и используется для GC постановки в Японии [22]. Тем не менее, некоторые исследователи сообщали, что PLF цитологии не обладает требуемой чувствительности для прогнозирования и обнаружения ПМ [21], и предложили использование молекулярных диагностических методов, таких как RT-PCR, для обнаружения микро- метастазов в истец В многоцентрового проспективного исследования, экспрессия мРНК генов, кодирующих карциноэмбриональный антиген (CEA) и цитокератин 20 (CK-20), оцененная с помощью RT-PCR, оказалась полезной для прогнозирования общей выживаемости и ТЧ в GC [23] , Тем не менее, недостаток диагностических методов, основанных мРНК является высокая склонность к деградации мРНК в ходе хирургических операций.
<Р> В отличие от этого, микроРНК, заключенные в экзосомы остаются стабильными и могут циркулировать в жидкостях организма, таких как сыворотка, плазма , слюна, моча, грудное молоко, и слезы, в течение длительных периодов времени [24, 25]; экзосомы также были выделены из МА при раке яичников [26].
<р> Насколько нам известно, не было ни одного доклада на exosomal микроРНК, выделенных из PLF больных GC. Levänen и др. собранные экзосомы из БАЛ и анализировали экспрессию exosomal микроРНК для выявления аллергии связанных видов микроРНК [27]. Лю и др. сообщил, что экзосомы выделенные из шеечно промывной жидкости содержали высокие уровни микроРНК-21, которые могут быть использованы в качестве биомаркеров рака шейки матки [28]. Здесь мы проанализировали профили экспрессии exosomal микроРНК в PLF больных GC по технологии микроРНК микрочипов с целью выявления кандидатов диагностики микроРНК биомаркеров для прогнозирования метастазирования в GC
. <Р> В нашем исследовании, первая лежала задача в количественном изоляции exosomal микроРНК из PLF. Вебер и др. оценивали экспрессию микроРНК в 12 жидкостях организма и сообщил, что общая концентрация РНК в перитонеальной жидкости было 775 мкг /л [25], который был меньше, чем мы получили от МА и PLF-4,400 и 6400 мкг /л, соответственно Причина для разница может быть методология, используемая для выделения тотальной РНК, так как Вебер и др. непосредственно экстрагируют РНК из перитонеальной жидкости, в то время как мы сначала выделяют экзосомы, а затем использовали их для экстракции РНК. Анализ качества РНК, выделенной из PLF продемонстрировал обилие мелких (&ЛТ; 200 нт) видов РНК в КМ и МА. Там не существовало четких 18S и 28S рибосомных РНК пики в препарате, что указывает на отсутствие загрязнения с внутриклеточной РНК.
<Р> Вторая проблема, возникающая в данном исследовании приняли участие последовательности в качества exosomal микроРНК изолированы. В нашем исследовании мы наблюдали низкую изменчивость количества обнаруженных видов микроРНК и интенсивности сигнала микроРНК и высокую корреляцию экспрессии микроРНК среди образцов в каждой группе. Среднее количество обнаруживаемых микроРНК в МА и PLF были 490 и 367, что находится в соответствии с количеством микроРНК (397), ранее обнаруженного в перитонеальной жидкости [25].
<Р> PLF и образцы МА показали низкую изменчивость интенсивность сигнала (CV = 3,87% для 50 й процентиль). Кроме того, паттерны экспрессии микроРНК сильно коррелировали между образцами в каждой группе (CC &GТ; 0,850), а также между группами (0,8 > CC > 0,7). Эти результаты показали, что PLF может быть источником с высоким выходом хорошего качества микроРНК, которые показывают последовательные паттерны экспрессии в анализе микрочипов.
<Р> Были проанализированы профили экспрессии микроРНК, чтобы выбрать микроРНК специфические для перитонеального метастазирования. MIR-21 показали более высокую экспрессию у больных с Т4 стадии рака, чем у тех, в группе T1-T3. Фаббри и др. сообщил, что микроРНК-21 и микроРНК-29а в рак выпустила экзосомы влияние рост опухоли и распространение путем связывания и активации TLRs в окружающих иммунных клеток и вызывая прометастатических воспалительную реакцию [29]; это поддержали идею о том, что полученные из опухоли экзосомы вклад в premetastatic микросреды [30, 31]. Это может означать, что Т4 карцинома происхождения экзосомы создать premetastatic нишу в брюшину, которая затем поддерживает перитонеальный вторжение после целебного резекции GC.
<Р> Использование поэтапного подхода, мы выбрали пять exosomal микроРНК (микроРНК-320c , микроРНК-1202, микроРНК-1225-5p, микроРНК-1207-5p и микроРНК-7270) и подтверждено выражение микроРНК-320 и miR1225-5p в PLF 18 пациентов CG по QRT-PCR. Мир-1225-5p показали более высокую экспрессию в Т4, чем в T1-T3 пациентов стадии CG, что подтверждает результаты, полученные с помощью микрочипов, в то время как не было никакого различия в уровнях микроРНК-320 между группами пациентов. Мир-1225 цели ген поликистоз почек, PKD1
, который часто мутирует при аутосомно-доминантное заболевание поликистоз почек; Таким образом, miR1225 может повлиять на прогрессирование этого заболевания [31]. Тем не менее, отношения между MIR-1225 и рак остается неясным. MIR-21 и микроРНК-1225-5p может подготовить premetastatic нишу в брюшине для распространения и урегулирования раковых клеток metastasising и, таким образом, может указывать на предрасположенность к перитонеального рецидива после резекции целебной GC.
<Р> PLF дает информацию о статусе брюшины, таких как изменения в популяции иммунных клеток и секреции факторов роста и цитокинов [32, 33]. Цитологические и молекулярно-диагностические анализы основаны на выявлении раковых клеток, в то время как профилирование микроРНК в PLF могут быть использованы для прогнозирования перитонеального premetastatic фенотипа в GC, обеспечивая более эффективных профилактических и лечебных мероприятий.
Ученые извлекли полный геном человека из «жевательной резинки» возрастом тысячи лет.
Микробиота кишечника может предсказать тяжесть COVID-19
Нездоровый микробиом кишечника снижает синаптическую обрезку мозга,
Ополаскиватель для рта влияет на эффект упражнений
Новый суперактивирующий рецептор макрофагов может объяснить гипервоспаление при тяжелой форме COVID-19
Потеря микробиома в результате использования антибиотиков влияет на реакцию на вакцину против гриппа
Наличие определенных кишечных бактерий у матери может защитить ребенка от пищевой аллергии
Исследователи из Университета Дикина в Австралии обнаружили, что определенные бактерии, присутствующие в кишечнике матери во время беременности, могут защитить их ребенка от развития пищевой аллергии
Иммунные клетки кишечника могут быть ответственны за изменения метаболизма, находит исследование
Новое исследование показало, что количество иммунных клеток в кишечнике может быть связано со скоростью метаболизма. Результаты нового исследования под названием, «Внутриэпителиальные Т-клетки кишечни
Микробы кишечника ос помогают бороться с пестицидами
Интригующее исследование, опубликованное в феврале 2020 года в журнале Клеточный хозяин и микроб сообщает, что когда осы подвергаются воздействию атразина, широко используемый пестицид, микробиом ки