Абстрактный
Фон &Amp; Цели
<р> Рак желудка является наиболее частым желудочно-кишечные опухоли у взрослых и является самой летальной формой рака у человека. Несмотря на улучшение ситуации в области лечения, лежащий в основе механизм желудочного канцерогенеза не очень хорошо известны. Для определения новых модуляторов, которые регулируют восприимчивость к tumorgenesis, мы сосредоточились на MIR-219-2-3p.
Финансирование:. Эта работа при поддержке грантов от Национального фонда естественных наук Китая [2012, 91129716, к JY] и Пекинского муниципального Наука &Amp; Технологии Комиссия [2010B071, к JY]. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение MicroRNAs (миРНК) представляют собой класс небольших молекул РНК, участвующих в регуляции трансляции и деградации мРНК [6 ]. МикроРНК связываются с комплементарными последовательностями в нетранслируемые области 3 '(UTR) их мРНК мишеней и вызывают деградацию мРНК или репрессии трансляции [7]. Наиболее известные функции микроРНК связаны с негативной регуляции гена: экспрессия генов микроРНК молчание, как правило, путем вмешательства стабильности мРНК или трансляции белка. В последние годы, микроРНК, как полагают, действуют как онкоген или ген-супрессор опухолей, а также способствовать инициации рака и прогрессии путем регуляции экспрессии генов [8]. Обнаружение рака конкретных вверх по течению области гиперметилированием многочисленных микроРНК продемонстрировала эпигенетической механизм отклоняющегося микроРНК выражения [9], [10]. микроРНК-219-2- 3p дифференцированно выражены в GC и клеточные линии GC МикроРНК модулировать ген выражение, взаимодействуя с их мРНК мишеней приводит к деградации мРНК или репрессии трансляции. Для дальнейшего изучения механизма MIR-219-2-3p в GC, мы bioinformatically (TargetScan Release 5.2 и miRDB) и функционально замешан MIR-219-2-3p в GC, и обнаружили гены, ориентированные на MIR-219-2- 3p (Таблица S2). Среди 371 предсказанных мишеней MIR-219-2-3p, 31 из них показали высокий потенциал, так как они были предсказаны обеих программ, в то время как другие были лишь предсказаны одной из программ. Из этих 31 генов, ErbB3, MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1, SOX4 были признаны онкоген или связанных с апоптозом генов предыдущими опубликованных работ. (Рис. 5В и 5С). Материалы и методы Tissue Особи Культуры клеток и трансфекция TaqMan RT-PCR для микроРНК выражения Выделение ДНК и бисульфит модификация Пролиферация клеток, апоптоз и клеточный цикл анализа гистологии
<р> рак желудка (GC) является 4 й наиболее распространенной формой рака и второй по значимости причиной смерти от рака во всем мире. В настоящее время, у пациентов с поздней стадией GC являются с общей 5-летней выживаемости примерно на 20% [1]. Рак развивается в результате накопления различных эндогенных и экзогенных причин. Пищевые привычки и увеличение Helicobacter pyloriinfection являются важными экзогенные причины для GC [2], в то время как генетические, а также диетическое, уровни гастрина гормона [3], а также других хронических желудочных воспаления, вызывающие факторы оказываются связаны с предрасположенностью к развитию рака. Генные изменения играют важную роль в GC, а также изменения в большом количестве онкогенов и генов-супрессоров опухолей уже сообщалось в GC.
<Р> Некоторые прогностические опухолевые биомаркеры в GC, такие как эпидермального роста человеческого рецептора фактора 2 (HER2 ), фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), были связаны с характеристиками заболевания и, следовательно, могут быть использованы для информирования лечения пациента. Например, у больных с опухолями, которые положительный результат теста на HER2 можно лечить с помощью трастузумаб в комбинации с химиотерапией [4], а также у больных с опухолями, которые испытывают позитв для VEGF можно лечить с помощью бевацизумаба в комбинации с химиотерапией [5]. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе развития GC остаются проблемой, таким образом, крайне необходимы дополнительно информативные биомаркеры.
<Р> У человека и у мышей, есть два геномных локусов (MIR-219- 1 и микроРНК-219-2), которые кодируют транскрипты-предшественников микроРНК-219. микроРНК-219-1 находится на хромосоме 6 (MI0000296) и MIR-219-2 находится на хромосоме 9 (MI0000740) [11] (рис. 1А). Обработка транскриптов-предшественников Dicer генерирует три зрелых микроРНК: MIR-219-5p от 5'-концах обоих предшественников и MIR-219-1-3p и MIR-219-2-3p от 3'-конца пре- микроРНК-219-1 и предварительно микроРНК-219-2, соответственно. Поскольку область семян этих трех зрелых продуктов уникален, каждый микроРНК предсказывается регулировать уникальные цели. Хотя микроРНК-219-5p, как известно, вниз регулируется в нескольких рака, таких как злокачественная астроцитома [12] и гепатоцеллюлярной карциномы [13], выражение MIR-219-1-3p и MIR-219-2-3p не имеет изучен. Интересно отметить, что микроРНК-199B и микроРНК-219-2-3p гены расположены в непосредственной близости к сегменту хромосомы 9q34.11 (рис. 1А). Предыдущее исследование показало, что микроРНК-199B-5p подавлялась в медуллобластомой метилирование острове CpG 3 кб вверх по течению от 5'-сайта микроРНК-199B-5p промотора [14]. Поскольку метилирование ДНК может влиять на крупные регионы хроматина и регулируют транскрипцию генов, далеких, необходимо исследовать вопрос о том микроРНК-219-2-3p подавляется и регулируется метилирования как MIR-199B-5p при раке. В этом исследовании мы обнаружили, что микроРНК-219-2-3p подавлялась в дс тканях и связанных с прогрессивными фенотипов GC. Кроме того, повторное введение MIR-219-2-3p снизило жизнеспособность GC клеток и индуцированных апоптоза клеток, предполагая, что микроРНК-219-2-3p был супрессоров кандидатом опухоли в GC. Дальнейший анализ метилирования микроРНК-219-2-3p промотора показал, что его экспрессия регулируется метилирования коррелированных CpG островов до некоторой степени. И, наконец, мы обнаружили, что микроРНК-219-2-3p действовал как подавитель опухоли путем ингибирования активности ERK1 /2 сигнального пути в GC клетки.
Результаты
<р> Для оценки экспрессии микроРНК-219-2-3p в ГХ, анализ TaqMan RT-PCR проводили в 113 пар GC тканей и соответствием соседних образцов нормальной ткани , По сравнению с нормальными образцами тканей, более половины первичных опухолей экспонируемых низкие уровни микроРНК-219-2-3p (58%, 65 из 113;. Фиг.1В). Кроме того, четыре пациентов, у которых экспрессия микроРНК-219-2-3p были значительными понижающей регуляции были выбраны (рис. 1D). МикроРНК-219-2-3p выражение в этих больных и четырех линий ГХ клеток (MGC-803, ГГК-27, MKN-45, SGC-7901) было проанализировано, чтобы показать, что микроРНК-219-2-3p также простои регулируется в GC клетки (рис. 1д). Эти результаты свидетельствуют о том, что подавляется микроРНК-219-2-3p была частым событием в человеческом GC и могут быть вовлечены в желудочном канцерогенезе. Из-за всеобщей понижающей регуляции MIR-219-2-3p в тестируемых линий GC клеток, MGC-803 и ГГК-27 были случайным образом выбраны для дальнейшего изучения.
Связь между клинико-патологическими факторами и MIR-219- 2-3p выражение в GC
<р> в исследование было включено 113 пациентов GC. Для того, чтобы оценить корреляцию между микроРНК-219-2-3p экспрессии и клинико-патологическими характеристиками, пациенты были разделены на группы с понижающей регуляции и повышающей регуляции. Как показано в таблице 1 и фиг.1с, наблюдалась статистически значимая связь между экспрессией микроРНК-219-2-3p и GC клинической стадии. У больных с более низкими уровнями микроРНК-219-2-3p выражения, казалось, связано с высокосортных и поздней стадии опухоли (р = 0,047, независимых образцов т тест). Эти данные свидетельствуют о том, что изменения СИК-219-2-3p могут быть вовлечены в прогрессии GC.
Гиперэкспрессия MIR-219-2-3p в GC клетках ингибирует клеточную пролиферацию и выживание клеток
<р> замечательное снижение микроРНК-219-2-3p экспрессии в образцах GC способствует нам, чтобы исследовать возможное биологическое значение MIR-219-2-3p в tumorgenesis. Учитывая, что микроРНК-219-2-3p играет определенную роль в регуляции клеточной пролиферации [15], MGC-803 и клетки ТЖК-27 были трансфицированы микроРНК-219-2-3p и скремблирования мимики и анализировали на рост клеток, клеток апоптоз и прогрессирование клеточного цикла соответственно. Прежде всего, RT-PCR использовали для измерения уровня MIR-219-2-3p после избыточной экспрессии экспериментов. Мы обнаружили, что микроРНК-219-2-3p увеличилась более чем на 100 складок в микроРНК трансфицировали MGC-803 и ГГК-27 клеток (Fig.2A). Кроме того, анализ пролиферации ССК-8 показали, что скорость роста клеток была снижена в микроРНК-219-2-3p подражает-трансфицированные MGC-803 и ГГК-27 клеток по сравнению с скремблирования трансфицируются клетками или необработанными клетками (рис. 2В). После трансфекции, степень ингибирования составила 26% (48 ч) и 28% (96 ч) в клетках МГЦ-803 и 13% (72 ч) и 14% (96 ч) в ТЖК-27 клеток. Эти результаты свидетельствуют о том, что микроРНК-219-2-3p действительно участвует в негативной регуляции клеточного роста. Тем не менее, не было никакого существенного влияния на остановке клеточного цикла в микроРНК-219-2-3p обработанных ГХ клеток (рис. S1). Для того, чтобы решить, будет ли повышающей регуляции MIR-219-2-3p индуцируют апоптоз клеток GC и гибель клеток, число ранних апоптотических MGC-803 и ГГК-27 клеток после обработки с микроРНК-219-2-3p мимике был рассмотрен. Как и следовало ожидать, несколько ранних апоптотических клеток (10% в MGC-803 или 2,9% в ТЖК-27) были обнаружены в скремблирования обработанных клеток, в то время как лечение микроРНК-219-2-3p имитирует увеличил процент ранних апоптотических клеток (17,5 % в MGC-803 или 8.3 в ТЖК-27), судя по аннексина V окрашивания (рис. 2в). Таким образом, мы пришли к выводу, что микроРНК-219-2-3p может повлиять на выживаемость клеток в GC клетки.
Гиперэкспрессия MIR-219-2-3p в GC клетках ингибирует клеточную миграцию и вторжение
<р> К дополнительно определять, является ли микроРНК-219-2-3p связано с прогрессированием GC, заживления ран и Transwell анализа проводили для анализа влияния микроРНК-219-2-3p экспрессии на миграционном и инвазивного поведения MGC-803 и HGC- 27 клеток. Мы обнаружили, что введение MIR-219-2-3p в MGC-803 и ТЖК-27 клеток привело к значительному снижению миграции клеток во время закрытия раны искусственного созданного над сливающийся монослой (рис. 3А). Эти клетки поддерживали в среде без сыворотки в течение раневого процесса, чтобы гарантировать, что любые дополненной миграционное поведение не может повлиять пролиферации клеток измененное. Кроме того, восстановление MIR-219-2-3p резко тормозил обычно сильный инвазивный потенциал MGC-803 и ГГК-27 клеток, осуществившего низкий эндогенный уровень MIR-219-2-3p (рис. 3б). Эти результаты показали, что микроРНК-219-2-3p избыточная экспрессия способствует регуляции GC подвижности клеток и прогрессии в пробирке.
MIR-219-2-3p выражение эпигенетически регламентированный
<р> На основании Вышеизложенные выводы, мы приходим к выводу, что микроРНК-219-2-3p был важным регулятором в GC. Тем не менее, регулирующие механизмы микроРНК-219-2-3p выражения еще не были известны. Поскольку многие микроРНК были идентифицированы в качестве мишеней регуляции метилирования, такие как MIR-9, MIR-34b /с и микроРНК-148а в метастатических карцином [16], и микроРНК-137 и MIR-193A в рака полости рта [17], зер- 193b и микроРНК-145 в раке простаты [18], [19], мы решили проанализировать механизм регулирования микроРНК-219-2-3p выражения из его геномной метилирования. После анализа геномной области, охватывающей ген микроРНК-219-2-3p, мы определили большой остров CpG (рис. 4А). Для того, чтобы исследовать, был ли микроРНК-219-2-3p эпигенетически регулируется в ГК, MGC-803, ТЖК-27 клетки обрабатывали ингибитором demethyltransferase, 5-аза-2'-дезоксицитидин (5-аза-СРВ) и гистона-деацетилаз ингибитор трихостатин A (TSA). Тогда выражение MIR-219-2-3p с помощью ОТ-ПЦР анализируют (рис. 4В). Результаты показали, что экспрессия микроРНК-219-2-3p был до регулируемой в двух ситуациях: для лечения 5-Аза-корд, экспрессия микроРНК-219-2-3p был повышающей регуляции в MGC-803 ( 5-аза-корд 1,5 мкмоль /л; 2,14 раза) и ТЖК-27 (5-аза-корд 0,5 мкмоль /л; 3,07 раза) по сравнению с ДМСО обрабатывали контрольной группой; для комбинированной терапии 5-аза-корд и TSA, экспрессия микроРНК-219-2-3p была значительно выше в MGC-803 (5-аза-корд 1,5 мкмоль /л, 1,98 раза) и ТЖК-27 (5 аза-корд 1,5 мкмоль /л; 1,28 раза) по сравнению с контрольной группой АСП. Эти результаты показали, что эпигенетические факторы могут повлиять на микроРНК-219-2-3p выражение в GC. Синергия деметилирования и гистондезацетилазы торможение привело к повторному экспрессии микроРНК-219-2-3p в GC. Для дальнейшего обнаружения, был ли микроРНК-219-2-3p, связанный с метилирования GC, мы исследовали статус метилирования микроРНК-219-2-3p вверх по течению области с использованием метилирования-специфической ПЦР (ПМП;. Рис 4в). были выбраны 22 пар тканей (первичных опухолей и их соответствием соседних нормальных тканей) в 113 пар, в том числе 11 пациентов, которые обладали более низкие MIR-219-2-3p уровни (понижающую регуляцию группа) и 11 пациентов, которые обладали более высокой MIR-219 -2-3p уровни (повышающую регуляцию группа). Мы обнаружили, что метилирование ДНК в добывающих регионах MIR-219-2-3p существовали в обоих смежно нормальные ткани и раковые ткани. Тем не менее, отношение гиперметилирование вверх по течению области микроРНК-219-2-3p гена в группе понижающего регулирования составил 63,6% (7 из 11), которая была выше, чем в группе, повышающая регуляция (36,3%, 4 из 11 ). Эти результаты свидетельствуют о том, что уровень метилирования вверх по течению CpG области MIR-219-2-3p была выше в MIR-219-2-3p вниз регулируется группу, чем в повышающей регуляции одного.
Гиперэкспрессия СИК-219-2-3p гасит ERK1 сигнализации /2 пути
<р> Активация ERK1 /2 пути был хорошо документированы в различных типах опухолей, таких как GC [20], рак поджелудочной железы [21] и рака молочной железы [ ,,,0],22]. Предыдущие исследования показали важность ERK1 /2 сигнального пути в регуляции миграции, инвазию и метастазирование раковых клеток линий [23]. Чтобы исследовать, влияет ли микроРНК-219-2-3p деятельность клеток через ERK1 /2 пути, уровень фосфорилирования ERK1 /2 в MGC-803 и ГГК-27 клеток исследовали после того, как микроРНК-219-2-3p избыточной экспрессии. Клеточные уровни п-ERK1 /2 значительно снизилась в микроРНК-219-2-3p подражает-трансфецированные клетки по сравнению с скремблирования трансфицируются или необработанными клетками. Тем не менее, нет очевидных различий не наблюдалось в общей ERK1 /2 уровня (рис. 5, а). Эти результаты свидетельствуют о том, что ускоренный рост клеток GC может быть частично связано с активированной ERK1 2 путей /.
Биоинформатика подход к поиску потенциальных мишеней микроРНК-219-2-3p
Обсуждение
<р> В последние годы накоплено доказательств привело онкологов предположить, что нераскрытые молекулярные факторы, в частности, некодирующей РНК, ранее классифицированных как "мусор" игра важную роль в онкогенеза и опухолевой прогрессии. В зависимости от их мРНК мишеней, микроРНК может функционировать в качестве супрессоров опухолей или стимуляторы онкогенеза. Тем не менее, механизмы, которые дизрегуляции микроРНК не были широко изучены, в том числе аберрантных микроРНК биогенеза и транскрипции [24], [25], эпигенетические изменения [26], [27], а также усиление или потери геномных областей, которые кодируют микроРНК [28] .
<р> Как показано в настоящем докладе, мы проанализировали экспрессию микроРНК-219-2-3p в 113 пациентов GC и обнаружили, что уровни кажутся ниже в GC. Хотя микроРНК-219-2-3p было сообщено, что тесно связано с диабетической ретинопатией [29], олигодендроциты [15], болезнь Альцгеймера [30] и глиобластомы [12], его функция в GC еще предстоит определить. Кроме того, мы показали, что повторное выражение MIR-219-2-3p в GC клетки приводит к индукции апоптоза клеток и снижению жизнеспособности клеток. Эти результаты позволили предположить, что понижающую регуляцию MIR-219-2-3p может обеспечить преимущество выживания для GC клеток. Тем не менее, механизм, ответственный за MIR-219-2-3p понижающая регуляция в GC до сих пор неизвестна. Потому что потери на 9q34.11, где находится микроРНК-219-2-3p, редко обнаруживается в GC [31], то маловероятно, что аллельные потери несет ответственность за ее понижающей регуляции. С другой стороны, мы обнаружили, что микроРНК-219-2-3p заметно повышающей регуляции при GC клетки, МГЦ-803 и ТЖК-27, обрабатывали обоими 5-аза-корд и ВСТ. Кроме того, вычислительный анализ показывает, что микроРНК-219-2-3p расположен на острове CpG на хромосоме 9q34.11. Таким образом, представляется возможным, что метилирование ДНК и гистонов деацетилирования могут быть связаны с микроРНК-219-2-3p регулирования. По МПВ, образцы метилирования частоты, обнаруженные в восходящем области MIR-219-2-3p находился в микроРНК-219-2-3p вниз регулируемой группе выше, чем в свою очередь регулируемой группы. Эта специфика меблирована гипотезу о взаимосвязи между микроРНК-219-2-3p экспрессии и метилирования ДНК. В целом, результаты свидетельствуют о том, что метилирование является важным механизмом для MIR-219-2-3p понижающего регулирования в GC.
<Р> Мы выполнили предсказание программ TargetScan и miRDB и обнаружили, что 6 генов могут быть потенциальными объектами MIR -219-2-3p. Среди кандидатов мишеней MIR-219-2-3p, тирозин киназ рецептора ErbB3 (эпидермальный фактор роста Семейство рецепторов) обращает наше внимание. Высокие уровни ErbB3 сильно связано с развитием опухоли и неблагоприятным прогнозом у больных с GC [32] - [34] и ингибиторы EGFR-киназы гефитиниб может предотвратить EGFR и ErbB2 активацию ErbB3. В то же время, выражение ErbB3 также служит эффективным показателем чувствительности к гефитиниб [35]. Известно, что подавляемый транскрипции ErbB3 угнетает сигнальных каскадов из ERK1 /2 путей [36]. Тем не менее, предсказанные гены-мишени должны быть дополнительно экспериментально подтверждено. Кроме того, микроРНК может функционировать в соответствии с комбинаторной модели схем, в которых один микроРНК может избирательно воздействовать на несколько мРНК, и несколько коэкспрессируются микроРНК может предназначаться одну мРНК. Недавние исследования показали, что биологическая концепция «один хит-множественные цели» могут быть использованы в клинической терапии [37]. Вполне вероятно, что конкретная микроРНК может функционировать на основе сотрудничества понижающей регуляции множественных целей и микроРНК функции также путем подавления перевода их генов-мишеней. Для того, чтобы изучить все последствия микроРНК, генома протеомическим исследований должно быть сделано.
<Р> В заключение, наше выражение и функциональные исследования показали, что микроРНК-219-2-3p дифференцированно выражается механизмом метилирования и имел опухолевый функция подавления путем регулирования ERK1 /2-связанные сигнальные пути в GC. В то же время, тем меньше экспрессия микроРНК-219-2-3p в образцах GC коррелировало с более высокого класса и более поздней стадии. Повторное введение экспрессии микроРНК-219-2-3p на GC клетках подавляемых клеточную пролиферацию, миграцию, инвазию и индуцированный апоптоз показали, что микроРНК на основе theraputic модели может служить основой для разработки новых потенциальных методов лечения рака желудка.
<р> опухоли желудка и их морфологически нормальных тканей (находится > 3 см от опухоли) были получены в период с ноября 2009 по ноябрь 2011 года из 113 пациентов GC проходит хирургии в больнице рака китайской академии медицинских наук (CICAMS, п = 21), китайская PLA General Hospital (301 больница, п = 31), а первый филиал больницы Шаньси медицинского университета (п = 61). Использование образцов тканей для всех экспериментов было одобрено этическим советом Института фундаментальных медицинских наук, Китайской академии медицинских наук. Все участники представили свое устное информированное согласие на участие в данном исследовании, и их устное информированное согласие были записаны. Этот процесс согласия был также одобрен советом по этике. Образцы тканей разрезают на две части, одна фиксировали 10% -ным формалином для гистопатологического диагноза, а другой был немедленно мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -196 ° С в жидком азоте до экстракции РНК. Эта группа состояла из 95 мужчин, 17 женщин и один без гендерной информации со средним возрастом 58 лет (диапазон 31-82 лет) .Formalin фиксировали парафином блоки ткани ГК были собраны из онкологической больницы Китайской академии Медицинские науки (CICAMS, п = 4) в период с 2009 по 2011 год из-за индивидуальных различий между пациентами, у нас отсутствует информация о некоторых клиникопатологическими данных. Использование образцов тканей для всех экспериментов был одобрен всеми пациентами и комитетом по этике учреждения путем. Характеристики пациентов приведены в таблице 1.
<р> В общей сложности 4 GC клеточных линий человека MGC-803 (коллоидный рак желудка, слабо дифференцированы), ТЖК-27 ( метастатического лимфоузла, недифференцированный рак), MKN-45 (Перстень карцинома слабо дифференцированы), SGC-7901 (аденокарцинома, умеренно дифференцированная) были рассмотрены в данном исследовании. MGC-803 ГГК-27, MKN-45, SGC-7901 клеточная линия была куплена от Cell ресурсный центр Института фундаментальных медицинских наук, Китайской академии медицинских наук и Пекинского объединенного медицинского колледжа (Пекин, Китай). МГЦ-803 размножали в модифицированной среде Дульбекко Eagle (Gibco; Invitrogen; Life Technologies, Германия), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS; РАА, Pasching, Австрия) и стрептомицина (100 мкг /мл), пенициллином (100 ед /мл). ТЖК-27, MKN-45, СГК-7901 поддерживали в среде RPMI 1640 (РАА), дополненной 10% FBS (РАА). ГХ клеточные линии человека MGC-803, ГГК-27 трансфицировали микроРНК-219-2-3p мимикой и отрицательных мимике управления микроРНК (GenePharma, Шанхай, Китай, таблица S1) в конечной концентрации 10 нмоль /л, используя Dharmafect 1 (Thermo Fisher, IL, USA) в соответствии с инструкциями производителя
<р> Суммарную РНК экстрагировали из клеток и тканей с Trizol реагента (Invitrogen, Calsbad. , штат Калифорния, США). МикроРНК были количественно ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan микроРНК анализа (Invitrogen, США). Первой нити комплементарной ДНК синтеза (кДНК) проводили с 1 мкг общей РНК в 12 мкл конечного объема, содержащего 2 М стволовой петли праймера, 10 мМ дНТФ смеси (Invitrogen, США). Смесь планшет при 65 ° С в течение 5 мин, а затем смешивают с 5 × RT буфера, 0,1 М ДТТ, 200 ед /мкл MultiScribe обратной транскриптазы и 40 ед /мкл ингибитора РНКазы (Invitrogen, США). Смесь планшет при 37 ° С в течение 55 мин, 70 ° С в течение 15 мин, а затем выдерживают при -20 ° С. ПЦР в реальном времени проводили с использованием стандартного протокола TaqMan PCR. В 20 мкл ОЗП реакции включали 1 мкл продукта RT, 1 × Универсальный TaqMan Master Mix и 1 × TaqMan зонд /смесь праймера (Invitrogen, США, таблица S1). Все реакции RT в том числе не-шаблона управления были в трех экземплярах. Все данные мРНК Количественное нормализовалось к U6. Относительное количество транскрипта была рассчитана с использованием сравнительного метода Ct.
5-Аза-корд и трихостатин Лечение клеточных линий
<р> линии GC клеток MGC-803 обрабатывали 5-аза 2'-дезоксицитидин (5-аза-корд, Sigma-Aldrich, США) при 0,7 мкмоль /л, 1,5 мкмоль /л, 3 мкмоль /л и ТЖК-27 обрабатывали 5-аза-корд в количестве 0,5 мкмоль /л, 1 мкмоль /л, 1,5 мкмоль /л в течение 3 дней или 300 нмоль /л трихостатин A (TSA; Sigma-Aldrich, США) в течение 24 часов. Для комбинированной обработки клетки обрабатывали 5-аза-корд в течение 48 часов, во-первых. Тогда АСП (300 нмоль /л) был добавлен, и клетки обрабатывали еще в течение 24 часов. Культуральную среду, содержащую лекарственное средство обновл ли каждые 24 часа. РНК клеточных линий очищали с реагентом TRIzol следуя инструкциям изготовителя. Синтез кДНК проводили, как описано ранее, и 1 мл разбавленного кДНК для каждого образца амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР с использованием протокола было описано выше.
<р> геномную ДНК была получена от -196 ° C в первичных опухолях азота жидкими, и их соответствие соседних нормальных тканей (п = 22, включают 11 пациентов, которые экспрессия микроРНК-219-2-3p были понижающей регуляции, а остальные были повышающей регуляции) и б Биомед ДНК Kit (Биомед, Пекин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Бисульфит лечение и восстановление образцов проводились с Epitect бисульфит (Qiagen, Hilden, Germany). Геномную ДНК (2 мкг) в 20 мкл воды использовали для каждой реакции и смешивают с 85 мкл бисульфита смеси и 35 мкл ДНК защиты буфера. Бисульфит превращение проводили на амплификатора следующим образом: 99 ° C в течение 5 мин, 60 ° С в течение 25 мин, 99 ° С в течение 5 мин, 60 ° С в течение 85 мин, 99 ° С в течение 5 мин, 60 ° С в течение 175 мин и 20 ° C на неопределенный срок. Бисульфита обработанные ДНК выделяли Epitect ротационную колонку, а затем секвенировали для подтверждения эффективности бисульфита преобразования.
Метилирование анализ
<р> MSP был использован для анализа метилирования MIR-219-2-3p вверх по течению область в клеточных линий и тканей. Methprimer использовали для конструирования MSP праймера (таблица S1). MSP реакции на новых праймеров были оптимизированы с использованием метилированного положительного контроля (М-ДНК), которая с помощью обычного человека лимфоцитов периферической ДНК обработанной в пробирке с Sss I метилтрансфераза (New England Biolabs, Beverly, MA). ДНК двух нормальных лимфоцитов периферической человека использовали в качестве нормального контроля. Касание ПЦР состоит из двух фаз: фаза 1 включали начальную денатурацию 95 ° С в течение 5 мин, а затем 45 циклов денатурации при 95 ° С в течение 30 с, отжиг при различных температурах в течение 30 секунд и удлинение при 72 ° С в течение 40 сек. В первом цикле, температура отжига устанавливали на 58 ° С, и, в каждом из 10 последовательных циклов, температура отжига была снижена на 0,6 ° С. Фаза 2 состояла из 35 циклов при 95 ° С в течение 30 с, 52 ° С в течение 30 с и 72 ° С в течение 40 сек. Продукты MSP анализировали на 3% полиакриламидном геле
<р> Клетки инкубировали в 10% ССК-8. (Dojindo; Кумамото, Япония), разбавленный в нормальной культуральную среду при температуре 37 ° С до конверсии визуальной цвета произошло. скорости пролиферации определяли при 0, 24, 48, 72, 96 часов после трансфекции. Оптическую плотность в каждой лунке измеряли при помощи микропланшет-ридера, установленного на 450 нм и 630 нм. Все эксперименты проводились в четырех повторностях. Анализ апоптоза проводили на MGC-803 и ТЖК-27 клеточных линий через 72 часа после трансфекции с использованием набора РЕ аннексина обнаружения V Апоптоз I (BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния, США) и анализировали с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS) , Анализ клеточного цикла проводили на MGC-803 и ТЖК-27 клеточных линий через 48 часов после трансфекции микроРНК-219-2-3p мимике и карабкаются соответственно. Клетки собирали, дважды промывали холодным PBS, фиксировали в охлажденной льдом 70% этанола, и инкубировали с пропидийиодидом (PI) и РНКазы А, а затем анализировали с помощью FACS. Каждый образец был запущен в трех экземплярах.
миграции клеток и вторжения анализы
<р> MGC-803 и ГГК-27 клетки выращивали до слияния на 12-луночных пластиковых чашках и обрабатывают карабкаются или MIR-219 -2-3p подражает. Через 24 часа после трансфекции, линейная царапины раны (в трех экземплярах) были созданы на монослоев сливающийся клеток с использованием 200 мкл кончиком пипетки. Для того, чтобы удалить клетки из клеточного цикла до начала ранении, клетки поддерживали в среде без сыворотки. Для визуализации мигрировавших клеток и заживление ран, изображения были взяты на 0, 12, 24, 36, 48, 60 и 72 ч часов. В общей сложности десять областей были выбраны случайным образом из каждой лунки и клетки в трех лунках каждой группы были определены количественно. Для вторжения анализов, после 24 часов трансфекции, 1 × 10 5 клеток в бессывороточной среде были посеяны Transwell миграции камер (8 мкм размер пор; Millipore, Швейцария), которые покрывали матригелем (Sigma-Aldrich; Сент-Луис, штат Миссури, США) в верхней палате. Среды, содержащие 20% FBS, добавляли в нижнюю камеру. Через 24 часа, не связанные с вторгшиеся клетки удаляли ватой, инвазивными клетками, расположенными на нижней поверхности камеры окрашивали Май-Грюнвальд-Гимза (Sigma Diagnostics; Сент-Луис, штат Миссури, США) и подсчитывают с помощью микроскопа (Olympus, Токио, Япония). Эксперименты были независимо друг от друга повторяют три раза.
Изоляция белка и Вестерн-блоттинга
<р> В указанное время, клетки MGC-803 и ГГК-27 клетки собирали в ледяном PBS и лизируют на льду в холодный приготовление модифицированного буфера радиоиммуноосажден дополненной ингибиторами протеазы. Концентрацию белка определяли с помощью ВСА Protein Assay Kit (Bio-Rad, Милан, Италия) и равные количества белков анализировали с помощью SDS-PAGE (10% акриламид). Гели электроблоттингу на нитроцеллюлозные мембраны (Millipore, Bedford, MA, USA). Для иммуноблота экспериментов, мембраны блокировали в течение 2 ч с 5% обезжиренным сухим молоком в Трис-буферном солевом растворе, содержащем 0,1% Tween-20, и инкубировали при 4 ° С в течение ночи с первичным антителом. Детектирование проводили с помощью пероксидаза-конъюгированными вторичными антителами с использованием усовершенствованной системы хемилюминесценции. Первичные антитела были использованы: GAPDH из Zhong-Shan Цзиньцяо (Пекин, Китай); ERK1 /2 (кролик анти-ERK1 /2, New England БиоЛАБ, NEB) и фосфо-ERK1 /2 (кролик анти-фосфо-ERK1 /2, New England БиоЛАБ, NEB)
<
Микробы кишечника могут быть связаны с депрессией
Бактериальные изменения кишечника влияют на результаты лечения волчанки во время беременности
Исследования показывают, как кишечные микробы влияют на желудочный грипп
Не бойтесь колоноскопии
Микробы могут предсказать летальный исход у пациентов с COVID-19 на ИВЛ
Язвенный колит и отсутствие микробов в кишечнике
Пластик, который сейчас обычно встречается в стуле человека
Ежегодно в океаны попадает около восьми миллиардов метрических тонн пластика. Это огромное количество пластика либо смывается на берег, либо распадается на крошечные кусочки диаметром менее 5 миллимет
Тесты, используемые для диагностики ГЭРБ
У некоторых пациентов мы можем подозревать гастроэзофагеальную рефлюксную болезнь, но симптомы пациента могут быть нетипичными. Или нам может просто потребоваться подтвердить наш диагноз. Для этого в
PENTAX Medical собирает 125 долларов,
000 для Всемирного фонда исследования рака в рамках кампании МИЛИ ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ ПЕНТАКС Медикал, ведущий поставщик решений для эндо-визуализации, празднует 100 th годовщина основания Asahi Optical Jo