PLoS One: a mikro-RNS-219-2-3p funkciók tumorszuppresszorként gyomorrákban, és szabályozza a DNS metiláció

absztrakt katalógusa

Háttér & Célok

gyomorrák a leggyakoribb gastrointestinalis tumor felnőtteknél, és ez a legtöbb halálos formája az emberi rák. Annak ellenére, hogy a javulás kezelések, a mögöttes mechanizmus a gyomor karcinogenezis nem ismert. Hogy meghatározza az új modulátorok, amelyek szabályozzák a hajlamot daganatkeltés közös összpontosítottunk miR-219-2-3p. Katalógusa

Módszerek

A kvantitatív RT-PCR-t alkalmaznak, hogy vizsgálja meg a szintet a miR-219-2 -3p a gyomorrák (GC) szövetekben (n = 113) és ezek párosított szomszédos normális szövetekben (n = 113). In vitro sejt proliferáció, apoptózis vizsgálatokhoz, sejtmigráció és inváziós vizsgálati eljárásokat végeztünk, hogy feltárja biológiai hatásainak miR-219-2-3p. Mivel hangtompító miRNS promoter metiláció CpG-szigetre is fontos mechanizmus daganatkeltés közös, GC-sejteket kezeltünk 5-aza-2'-dezoxicitidin és trichostatin A és expressziós változást miR-219-2-3p később vizsgálta kvantitatív RT-PCR-rel. Végül a metiiációs állapotát CpG-szigetre upstream miR-219-2-3p analizáltuk metiláció-specifikus PCR-GC szövetekben (n = 22).

Eredmények

miR-219- 2-3p volt alulszabályozott GC és sejtvonalakban. Ezen túlmenően, a kísérletek dokumentált alsó expresszióját miR-219-2-3p GC példányok magasabb fokozatú és későbbi szakaszban daganatok. Eközben a miR-219-2-3p gyakorolt ​​antiproliferatív, apoptózist segítő és antimetasztatikus szerepek és csökkent a p-ERK1 /2 GC sejtekben. Továbbá, az 5-aza-2'-dezoxicitidin és trichostatin A fokozott expressziójának (-2-szeres) a miR-219-2-3p GC sejtekben. Metilációval-specifikus PCR, DNS metiláció az upstream régiójában miR-219-2-3p volt kimutatható a két szomszédos normál szövetben és a rákos szövet. Ahogy az várható volt, a metilációs szintje jóval magasabb volt a miR-219-2-3p leszabályozott csoportban, mint akár szabályozott csoport. Katalógusa

Következtetések katalógusa

miR-219-2-3p potenciálisan részt gyomorrák progresszió és metasztázis szabályozása által az ERK1 /2-kapcsolatos szignál utak, amely lehet, hogy egy új terápiás stratégia kezelésére gyomorrák. Metilációs mechanizmus lehet vonni modulációs expressziós szintje a miR-219-2-3p gyomorrákban. Katalógusa

Citation: Lei H, Zou D, Li Z, Luo M, L Dong, Wang, B. és munkatársai . (2013) a mikro-RNS-219-2-3p funkciók tumorszuppresszorként gyomorrákban, és szabályozza a DNS metiláció. PLoS ONE 8 (4): e60369. doi: 10,1371 /journal.pone.0060369 katalógusa

Szerkesztő: Arun Rishi, Wayne State University, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: december 14, 2012; Elfogadva: február 26, 2013; Megjelent: április 23, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Lei et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka ben támogatták a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína [2012, 91129716, a JY] és a pekingi Városi Science & Technológiai Bizottság [2010B071, a JY]. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák (GC) a 4 ^{th leggyakoribb rák és a második legmagasabb rákos halálok világszerte. Manapság betegek késői szakaszában a GC egy általános 5 éves túlélés megközelítőleg 20% ​​[1]. Rák alakul eredményeként felhalmozódását a különböző endogén és exogén okokat. Étkezési szokások és a növekedés Helicobacter pyloriinfection fontos exogén okai GC [2], míg a genetikai, valamint a diétás, a hormon gasztrin, [3] és más krónikus gyomor gyulladás okozó faktorok találtuk, hogy kapcsolatos a hajlam rák kialakulásához. Gene elváltozások fontos szerepet játszanak a GC, és változtatások számos onkogének és tumorszuppresszor gének már beszámoltak GC.}

Néhány prognosztikai tumor biomarkerek GC, mint a humán epidermális növekedési faktor receptor 2 (HER2 ), a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF), az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR), összefüggésbe hoztak betegség jellemzői, és ezért felhasználható, hogy tájékoztassa a beteg kezelésére. Például, a betegek tumorokban teszt pozitív HER2 lehet kezelni trastuzumab plusz kemoterápia [4], és a betegek tumorokban teszt pozitív VEGF lehet kezelni bevacizumab + kemoterápia [5]. A molekuláris mechanizmusa fejlesztése GC továbbra is kihívást jelent, így még informatív biomarkerek sürgősen szükség van. Katalógusa

A mikroRNS (miRNS) van egy osztály a kis RNS-molekulák szabályozásában szerepet fordításával lebomlása mRNS [6 ]. MiRNS kötődnek komplementer szekvenciák a 3 'nem régióban (UTR) az a cél mRNS és indukálják mRNS lebomlás vagy transzlációs elnyomás [7]. A legtöbb ismert funkciója miRNS kapcsolatos negatív gén szabályozása: miRNS csend génexpresszió, általában zavarja az mRNS stabilitását vagy fehérjeszintézist. Az elmúlt években, miRNS hitték jár onkogén vagy tumor szuppresszor gén, és hozzájárul a rák kialakulásában és progressziójában szabályozása által génexpresszió [8]. A felfedezés a rák-specifikus upstream régió hipermetiláció számos miRNS bebizonyította epigenetikus mechanizmus aberráns miRNS expressziós [9], [10]. Katalógusa

A humán és egér, van két genom loci (miR-219- 1 és miR-219-2) kódoló miR-219 prekurzor átiratát. miR-219-1 kromoszómán található 6 (MI0000296) és mir-219-2 kromoszómán helyezkedik el a 9 (MI0000740) [11] (1A.). Feldolgozása a prekurzor transzkriptumok által Dicer generál három érett miRNS: Mir-219-5p az 5 'végei mindkét prekurzorok és miR-219-1-3p és miR-219-2-3p a 3' végén a pre- miR-219-1 és előre-miR-219-2, ill. Mivel a mag régió három kiforrott termék egyedi, minden egyes miRNS az előrejelzések szerint szabályozza egyedi célokat. Bár miR-219-5p ismert, hogy lefelé szabályozni több rák, például rosszindulatú astrocytoma [12] és a hepatocellularis carcinoma [13], a kifejezés miR-219-1-3p és miR-219-2-3p még nem vizsgálták. Érdekes módon, a miR-199b és miR-219-2-3p gének találhatók közelsége egy szegmense kromoszóma 9q34.11 (1A.). Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a miR-199b-5P-t alulszabályozott medulloblastoma által metilezésével egy CpG-szigetre 3 kb upstream a 5'-helyén a miR-199b-5p-promoter [14]. Mivel a DNS metiláció befolyásolhatja nagyrégiók kromatin és szabályozzák a transzkripció távoli gének, meg kell vizsgálni, hogy a miR-219-2-3p van leszabályozott, és szabályozza metiláció a miR-199b-5p a rák. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy a miR-219-2-3p volt alulszabályozott GC szövetek és kapcsolódó progresszív fenotípusok a GC. Sőt, újra bevezetése miR-219-2-3p csökkent életképességét GC sejtek által indukált apoptózis, ami arra utal, hogy a miR-219-2-3p jelölt volt tumor szupresszor GC. További metilációs elemzés miR-219-2-3p promoter jelezte, hogy expressziót szabályozza metiláció korrelált CpG szigetek bizonyos mértékig. Végül azt találtuk, hogy a miR-219-2-3p járt tumorszuppresszorként keresztül aktivitásának gátlására ERK1 /2 jelátviteli út GC sejtekben. Katalógusa

Eredmények katalógusa

miR-219-2- 3P-ben differenciáltan kifejezve GC és GC-sejtvonalak

Annak megállapítására expressziójának miR-219-2-3p GC, TaqMan RT-PCR elemzést végeztünk 113 pár GC szövetek és kiegyenlített szomszédos normál szövetmintákat . Összehasonlítva a normális szövetminták, több mint a fele a primer tumorok mutatott alacsony szintű miR-219-2-3p (58%, 65 113; ábra. 1B). Továbbá, négy beteg, amelynek expressziója a miR-219-2-3p szignifikáns leszabályozott választottunk (ábra. 1D). A miR-219-2-3p kifejezés azoknál a betegeknél, valamint négy GC sejtvonalak (MGC-803, HGC-27, MKN-45, SGC-7901) elemezték, hogy felfedje, hogy a miR-219-2-3p is le- szabályozott GC sejtek (ábra. 1E). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a leszabályozott miR-219-2-3p volt gyakori esemény az emberi GC és érintett lehet a gyomorrák kialakulásában. Mivel az egyetemes leszabályozza a miR-219-2-3p tesztelt GC sejtvonalak, MGC-803 és HGC-27 véletlenszerűen választottuk ki további tanulmányozásra. Katalógusa

közötti kapcsolat klinikopatológiai faktorok és miR-219- 2-3p kifejezést GC katalógusa

Ez a vizsgálat 113 GC betegeknél. Értékelni a korreláció miR-219-2-3p kifejezés klinikopatológiai jellemzők betegeket két csoportra osztottuk a down-szabályozás és up-szabályozás. Amint az 1. táblázatból látható, és fig.1C, statisztikailag szignifikáns asszociáció volt megfigyelhető között expressziója miR-219-2-3p és GC klinikai fázisban. A betegek alacsonyabb miR-219-2-3p kifejezés tűnt társulhat magas minőségű és a késői stádiumú daganatok (p = 0,047, független-mintás t-teszt). Ezek az adatok azt javasolta, hogy a megváltozott miR-219-2-3p lehetne vonni GC progresszióját. Katalógusa

túltermelése miR-219-2-3p GC sejtekben gátolja a sejtek szaporodását és a sejt túlélését katalógusa

a figyelemre méltó csökkenése miR-219-2-3p expresszió GC minta támogatni minket, hogy vizsgálja meg az esetleges biológiai jelentősége miR-219-2-3p a daganatkeltés közös. Tekintettel arra, hogy a miR-219-2-3p szerepet játszott szabályozásában sejtburjánzást [15], MGC-803 és HGC-27 sejteket a miR-219-2-3p kódoltakat utánozza, és elemezzük a sejtnövekedést, a sejtek apoptózis és a sejtciklus progressziójában volt. Először is, az RT-PCR-t alkalmaztunk szintjének mérésére miR-219-2-3p után overexpresszió kísérletek. Azt találtuk, hogy a miR-219-2-3p nőtt több mint 100 ráncokat miRNS transzfektált MGC-803 és HGC-27 sejtek (Fig.2A). Továbbá a CCK-8 proliferációs vizsgálati kimutatták, hogy a sejt növekedési ráta csökkent miR-219-2-3p utánozza transzfektált MGC-803 és HGC-27 sejtek összehasonlítva Scramble-transzfektált sejtek vagy a kezeletlen sejtek (ábra. 2b). A transzfekciót követően a gátlás aránya 26% volt (48 h) és 28% (96 h) a MGC-803 sejteket és a 13% -os (72 h) és 14% (96 h) A HGC-27 sejtekben. Ezek az eredmények azt sugallták, hogy a miR-219-2-3p valóban részt vesz a negatív sejtnövekedés szabályozásában. Azonban nem volt jelentős hatással a sejtciklus miR-219-2-3p kezelt GC-sejtek (ábra. S1). Annak megállapítása, hogy ki-szabályozása miR-219-2-3p váltana GC apoptózis és a sejthalál, a számos korai apoptotikus MGC-803 és HGC-27 sejtek kezelést követően miR-219-2-3p utánozza vizsgáltuk. Ahogy az várható volt, néhány korai apoptotikus sejtek (10% MGC-803 vagy 2,9% HGC-27) detektáltunk a Scramble-kezelt sejtek, míg a miR-219-2-3p utánozza kezelés növelte a százalékos korai apoptotikus sejtek (17,5 % -ban MGC-803 vagy 8.3 HGC-27) megítélése szerint, Annexin V festés (ábra. 2C). Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a miR-219-2-3p befolyásolhatja a sejtek túlélését GC sejtekben. Katalógusa

túltermelése miR-219-2-3p GC sejtekben gátolja a sejtek migrációs és behatolás katalógusa

további érzékeli, hogy a miR-219-2-3p társul progressziója GC, sebgyógyulást és transzwell vizsgálatot végeztünk, milyen hatást gyakorol a miR-219-2-3p kifejezés a sejtvándorlását az MGC-803 és HGC- 27 sejtekben. Azt találtuk, hogy bevezetése miR-219-2-3p figyelembe MGC-803 és HGC-27 sejtek szignifikáns csökkenését sejtmigráció zárása közben a mesterséges seb létre, több mint egy konfluens egyrétegű (ábra. 3A). Ezeket a sejteket tartottunk fenn szérummentes tápközegben során sebgyógyulás annak biztosítására, hogy bármely kiegészített vándorló viselkedés nem befolyásolja a megváltozott sejtek proliferációját. Emellett helyreállítása miR-219-2-3p drámaian gátolja a normális erős invazív képességét MGC-803 és HGC-27 sejtekben, amely végzett alacsony endogén szintje miR-219-2-3p (ábra. 3B). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a miR-219-2-3p túltermelése hozzájárul szabályozásában GC sejtek mozgékonyságát és progresszió in vitro. Katalógusa

miR-219-2-3p kifejezés epigenetikusan szabályozott katalógusa

Ennek alapján a fenti megállapítások arra a következtetésre jutottunk, hogy a miR-219-2-3p volt fontos szabályozója a GC. Ugyanakkor a szabályozó mechanizmusok miR-219-2-3p kifejezés még nem ismert. Mivel sok miRNS azonosítottak célokat metilációs szabályozás, mint a miR-9, miR-34b /c és miR-148a áttétes karcinóma [16], és a miR-137 és miR-193a a szájüregi rák [17], miR 193b és miR-145 prosztatarákos [18], [19], úgy döntöttünk, hogy elemezze a szabályozási mechanizmust miR-219-2-3p kifejezést genomi metiláció. Elemzése után a genomi régióban átívelő miR-219-2-3p gént azonosítottunk egy nagy CpG-sziget (4A.). Annak vizsgálatára, hogy a miR-219-2-3p ben epigenetikusan szabályozott GC, MGC-803, HGC-27 sejteket kezeltünk demethyltransferase gátló, 5-aza-2'-dezoxicitidin (5-aza-CDR) és a hiszton-dezacetiláz inhibitor trichosztatin A (TSA). Ezután a kifejezés a miR-219-2-3p RT-PCR-t analizáltuk (ábra. 4B). Az eredmények kimutatták, hogy a kifejezés a miR-219-2-3p volt, akár szabályozott két esetben: az 5-Aza-CdR kezelés, a kifejezés miR-219-2-3p volt up-szabályozott MGC-803 ( 5-aza-CdR 1,5 nmol /l; 2,14-szeres) és HGC-27 (5-aza-CdR 0,5 nmol /l; 3,07-szeres), mint a DMSO-val kezelt kontroll-csoport; az 5-aza-CDR TSA kombinációs kezelés, a kifejezés a miR-219-2-3p sokkal magasabb volt MGC-803 (5-aza-CdR 1,5 nmol /l; 1,98-szeres) és HGC-27 (5 aza CDR 1,5 nmol /l; 1,28-szeres), mint a TSA kontroll csoportban. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az epigenetikai tényezők befolyásolhatják miR-219-2-3p kifejezést GC. Szinergia demetilációja és hiszton dezacetiláz gátlással vezetett újbóli kifejezése miR-219-2-3p GC. Ahhoz, hogy tovább felismerni, hogy a miR-219-2-3p társult metilációs GC megvizsgáltuk a metilációs állapotát miR-219-2-3p upstream régió segítségével metiláció-specifikus PCR (MSP mutatja be. 4C). 22 pár szövetek (primer tumor és kiegyenlített szomszédos normál szövetben) a 113 párban is választott, köztük 11 beteg, akik rendelkeztek alacsonyabb miR-219-2-3p szintek (leszabályozza csoport) és 11 beteg, akik rendelkeztek magasabb miR-219 -2-3p szintek (up-reguláció csoport). Azt találtuk, hogy a DNS-metiláció upstream régiójában miR-219-2-3p létezett mindkét szomszédos normál szövetben és a rákos szövet. Azonban hipermetilációja aránya upstream régió miR-219-2-3p gén leszabályozza csoport 63,6% (7. 11), ami magasabb, mint a fel-szabályozás csoportban (36,3%, 4. 11 ). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a metilációs szintje az upstream CpG régió miR-219-2-3p magasabb volt a miR-219-2-3p alulszabályozott csoportban, mint a fel-szabályozott egyet. Katalógusa

túltermelése a miR-219-2-3p csillapítja ERK1 /2 jelátviteli katalógusa

aktiválása ERK1 /2 útvonal jól dokumentált a különböző tumor típusok, mint a GC [20], hasnyálmirigyrák [21] és a mellrák [ ,,,0],22]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy fontos a ERK1 /2 jelátviteli útvonal szabályozásában a migráció, invázió és metasztázis a rákos sejtvonalak [23]. Annak vizsgálatára, hogy a miR-219-2-3p befolyásolja sejt tevékenységek révén ERK1 /2 útvonal, a foszforilezési szintje az ERK1 /2 MGC-803 és HGC-27 sejteket vizsgáltuk után miR-219-2-3p overexpresszió. A celluláris szintjét p-ERK1 /2 jelentősen csökkent miR-219-2-3p utánozza-transzfektált sejteket képest Scramble-transzfektált vagy nem kezelt sejtekben. Azonban nem egyértelmű különbség volt megfigyelhető a teljes ERK1 /2 szint (ábra. 5A). Ezek az eredmények azt javasolta, hogy a gyorsított GC sejtnövekedést lehet részben annak köszönhető, hogy aktivált ERK1 /2 útvonalakat. Katalógusa

Bioinformatikai megközelítést keresni a potenciális célpontjai miR-219-2-3p katalógusa

miRNS modulálják gén expresszió kölcsönhatásban áll a cél mRNS eredményező mRNS lebomlás vagy transzlációs elnyomás. Ahhoz, hogy tovább vizsgálja a mechanizmus a miR-219-2-3p GC, mi bioinformatically (TargetScan Release 5.2 miRDB) és funkcionálisan érintett miR-219-2-3p GC, és megállapította, a gének által megcélzott miR-219-2- 3p (táblázat S2). Között 371 megjósolt célpontjai miR-219-2-3p, ezekből 31 látható nagy potenciállal, mivel ezek által jósolt mindkét program, míg mások csak megjósolta a programok egyikét. Ezen 31 gének, ErbB3 MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1, SOX4 találtuk onkogént vagy apoptózissal kapcsolatos gének által előző közzétett papírokat. (Ábra. 5B és 5C). Katalógusa

Vita katalógusa

Az elmúlt években felhalmozott bizonyítékok vezetett onkológusok a feltételezés, hogy feltáratlan molekuláris tényezők, különösen a nem kódoló RNS-ek előzetesen a "szemét", játék fontos szerepet tumorigenezis és a tumor progresszióját. Attól függően, hogy az mRNS célok miRNS funkcionálhatnak tumorszupresszorokkal vagy támogatói onkogenezis. Azonban azok a mechanizmusok, hogy diszreguláit miRNS nem széles körben tanulmányozták, beleértve az aberráns miRNS biogenezist és transzkripciós [24], [25], epigenetikus módosítás [26], [27], és az amplifikáció vagy elvesztése genomiális régiók kódoló miRNS [28] .

Ahogy ebben a jelentésben, elemeztük a kifejezése miR-219-2-3p 113 GC betegek és megállapította, hogy a szinteket úgy tűnik, hogy alacsonyabb GC. Azonban a MIR-219-2-3p leírták, hogy szorosan kapcsolódik a diabéteszes retinopátia [29], az oligodendrociták [15], az Alzheimer-kór [30] és glioblasztóma [12], a funkcióját GC még nem határozták meg. Továbbá, mi kimutatták, hogy a re-expresszálásához miR-219-2-3p GC sejtek indukálását eredményezte a sejt apoptózis és csökkent sejt életképességét. Ezek az eredmények lehetővé tették, hogy úgy gondolják, hogy down-regulációja miR-219-2-3p nyújthatnak túlélési előnyt GC sejteket. Azonban a mechanizmus felelős miR-219-2-3p leszabályozza a GC még nem ismert. Mivel a veszteség 9q34.11, ahol a miR-219-2-3p található, ritkán detektálható GC [31], nem valószínű, hogy az allél elvesztése felelős a leszabályozza. Másrészt, azt találtuk, hogy a miR-219-2-3p volt jelentősen felülszabályozott amikor GC-sejtek, MGC-803 és HGC-27, kezeltük mind az 5-Aza CDR és a TSA. Ezen kívül, a számítógépes elemzés azt mutatja, hogy a miR-219-2-3p található CpG sziget kromoszómán 9q34.11. Ezért úgy tűnik, lehetséges, hogy a DNS metiláció és hiszton deacetiláció társulhat miR-219-2-3p szabályozás. MSP által, minták metilációs frekvenciák kimutatni az upstream régiójában miR-219-2-3p magasabb volt a miR-219-2-3p alulszabályozott csoportban, mint a fel-szabályozott csoportot. Ez specificitás berendezett a feltételezést, miszerint a kapcsolatát miR-219-2-3p véleménynyilvánítás és a DNS metiláció. Összességében az eredmények arra utalnak, hogy a metiláció egy fontos mechanizmus a miR-219-2-3p leszabályozza a GC. Katalógusa

végeztünk előrejelzést az TargetScan és miRDB programokat és megállapította, hogy a 6-gének potenciális célpontjai miR -219-2-3p. A tagjelölt célpontjai miR-219-2-3p, a receptor tirozin kinázok ErbB3 (epidermális növekedési faktor receptor család) hívta fel a figyelmet. Magas szintű ErbB3 szorosan összefügg a tumor progresszióját és rossz prognózissal betegek GC [32] - [34], és az EGFR-kináz-inhibitorok, gefitinib megakadályozhatja az EGFR és az ErbB2 aktivációját ErbB3. Eközben ErbB3 kifejezés is szolgál hatékony előrejelzője érzékenység a gefitinibre [35]. Ismeretes, hogy az elnyomott ErbB3 transzkripciós gátolja jelzőkaszkádok származó ERK1 /2 útvonalakat [36]. Azonban az adott cél géneket tovább kell kísérletileg validált. Sőt, miRNS működhet szerint kombinatorikus áramkörök modell, amelyben egy egyetlen miRNS célozhatnak több mRNS-ek, és néhány koexpresszált miRNS célozhatnak egyetlen mRNS. A legújabb vizsgálatok arra utaltak, hogy a biológiai fogalma "egy hit-több cél" lehetne használni a klinikai gyógyászatban [37]. Valószínű, hogy egy adott miRNS működhet keresztül kooperatív leszabályozza több cél és miRNS funkciót is elnyomja a fordítását a target gének. Hogy vizsgálja meg a teljes hatását a miRNS, genom proteomikai vizsgálatokat kell végezni. Katalógusa

Összefoglalva, a véleménynyilvánítás és a funkcionális vizsgálatok arra utaltak, hogy a miR-219-2-3p volt differenciáltan expresszálódó metilációval mechanizmus, és volt egy tumoros elnyomása funkció szabályozása által ERK1 /2-összefüggő szignálútvonalak GC. Eközben az alsó kifejezése miR-219-2-3p GC példányok korrelált magasabb minőségű és későbbi szakaszban. Visszaállításának kifejezése miR-219-2-3p GC sejtek elfojtott sejt proliferáció, migráció, invázió és indukált apoptózis jelezte, hogy a miRNS-alapú theraputic minta szolgálhat alapul a fejlődését az új potenciális terápiák gyomorrákban. Katalógusa

anyagok és módszerek katalógusa

szövetminták katalógusa

a gyomor tumorok és morfológiailag normál szövetekben (található > 3 cm-re a tumor) kaptak között 2009 novembere és november 2011-re 113 GC átesett betegek műtét Cancer Kórház kínai Orvostudományi Akadémia (CICAMS, n = 21), kínai PLA General Hospital (301 kórház, n = 31), és az első Kapcsolt Kórház Shanxi Orvostudományi Egyetem (n = 61). A használata a szövetminták minden kísérlet hagyta jóvá az etikai testület az Institute of Basic Medical Sciences, kínai Orvostudományi Akadémia. Minden résztvevő biztosított a verbális tájékozott beleegyezés, hogy vegyenek részt ebben a vizsgálatban, és a szóbeli tájékoztatást hozzájárul lejegyezték. Ez a hozzájárulás folyamat is jóváhagyta az etikai bizottság. A szövetmintákat két részre vágtuk, az egyik rögzítettük 10% formaiinban a kórszövettani diagnózis, a másik azonnal lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és felhasználásig -196 ° C-on folyékony nitrogénben, amíg RNS kivonása. Ez a csoport állt a 95 férfi, 17 nő, a másik anélkül nemét medián életkora 58 év volt (tartomány: 31-82 év) .Formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövettani blokkok GC gyűjtöttünk a Cancer Kórház Kínai Tudományos Akadémia orvosi Kar (CICAMS, n = 4) 2009 és 2011 között az egyéni eltérések közötti betegek, mi hiányzott információkhoz is klinikopatológiai adatok. A használata a szövetminták minden kísérlet hagyta jóvá az összes beteg és etikai bizottság az intézmény. A jellemzői a betegek 1. táblázatban ismertetett

Cell Cultures és transzfekció A

összesen 4 humán GC sejtvonalak MGC-803 (mucinosus gyomorrák, gyengén differenciált), HGC-27 ( metasztatikus nyirokcsomó, differenciálatlan carcinoma), MKN-45 (pecsétgyűrű carcinoma rosszul differenciált), SGC-7901 (adenocarcinoma, közepesen differenciált) vizsgáltunk ebben a vizsgálatban. Az MGC-803 HGC-27, MKN-45, SGC-7901 sejtvonal vásárolt a Cell Resource Center Intézet Basic Medical Sciences, kínai Orvostudományi Akadémia és Peking Unió Medical College (Peking, Kína). MGC-803-ben szaporítjuk Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközegben (Gibco; Invitrogen; Life Technologies, Németország), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS; PAA, Pasching, Ausztria) és sztreptomicin (100 ng /ml), penicillinnel (100 egység /ml). A HGC-27, MKN-45, SGC-7901 RPMi 1640 közegben (PAA), kiegészítve 10% FBS-sel (PAA). Az emberi GC sejtvonalak MGC-803, HGC-27 transzfektáltunk miR-219-2-3p utánozza és negatív kontroll miRNS utánzók (GenePharma; Shanghai, Kína, táblázat S1) végső koncentráció 10 nmol /l használva Dharmafect 1 (Thermo Fisher; IL, USA) szerint a gyártó utasításai szerint.

TaqMan RT-PCR miRNS Expression

Teljes RNS-t kivontuk a sejtek és a szövetek Trizol reagens (Invitrogen, Calsbad , CA, USA). MiRNS mennyiségi meghatározását valós idejű PCR-TaqMan mikro-RNS assay (Invitrogen, USA). Első szál komplementer DNS (cDNS) szintézissel végeztük 1 ug össz-RNS-t 12 ul végső térfogatban, amely 2 M szár-hurok láncindító, 10 mM dNTP keveréket (Invitrogen, USA). Az elegyet lemez 65 ° C-on 5 percig, majd összekeverjük 5 × RT-puffert, 0,1 M DTT-t, 200 E /ml MultiScribe reverz transzkriptáz és 40 U /ul RNáz inhibitor (Invitrogen, USA). Az elegyet lemezt 37 ° C-on 55 percig, 70 ° C-on 15 percig, majd tartottuk -20 ° C-on. Real-time PCR-t standard TaqMan PCR-protokoll. A 20 ul PCR reakciók közé 1 nl RT termék, 1 × Univerzális TaqMan Master Mix és 1 × TaqMan próbát /primer keverék (Invitrogen, USA, táblázat S1). Minden RT reakciók, beleértve a nem-template kontrollokat futtatni három példányban. Minden mRNS mennyiségi meghatározása adatokat normalizáltuk U6. A relatív mennyisége transzkriptum számítottuk ki az összehasonlító Ct módszer.

5-aza-CDR Trichostatin A kezelés sejtvonalak

GC sejtvonalak MGC-803 kezeltük 5-aza- 2'-dezoxi-citidin (5-aza-CdR; Sigma-Aldrich, USA) 0,7 nmol /l, 1,5 nmol /l, 3 jimol /l és HGC-27 kezeltük 5-aza-CdR 0,5 nmol /l, 1 nmol /l, 1,5 nmol /liter 3 napon vagy 300 nmol /l Trichostatin a (TSA; Sigma-Aldrich, USA) 24 órán át. A kombinációs kezelés, sejteket kezeltünk 5-aza-CdR 48 órán át először. Ezután TSA (300 nmol /l) adtunk hozzá, és a sejteket kezeltük további 24 órán át. Tartalmazó tenyésztő tápközeget gyógyszert adtunk 24 óránként cserélni. RNS sejtvonalak tisztítjuk Trizol reagens utasításait követve a gyártó. cDNS-szintézis végeztük a korábban leírt módon, és az 1 ml hígított cDNS-t minden egyes mintából amplifikáltuk RT-PCR-rel a korábban leírt protokoll.

DNS izolálás és biszulfit módosítás

A genomiális DNS- kaptuk -196 ° C folyékony nitrogénben primer tumor, és kiegyenlített szomszédos normál szövetben (n = 22, 11 beteg közé, amely kifejezés a miR-219-2-3p arra leszabályozott, és a többiek akár szabályozott) és használt Biomed DNA Kit (Biomed, Peking, Kína), a gyártó utasításait. Bisulfite kezelésére és hasznosítására mintákat elvégezni Epitect Bisulfite kit (Qiagen, Hilden, Germany). A genomiális DNS-t (2 ug) 20 ul vizet használtunk az egyes reakció és összekeverjük 85 ul-hidrogén-szulfit keverékét és 35 pl DNS-t védeni pufferben. Bisulfite konverzió végeztük a thermocycler a következők szerint: 99 ° C-on 5 percig, 60 ° C-on 25 percig, 99 ° C-on 5 percig, 60 ° C-on 85 percig, 99 ° C-on 5 percig, 60 ° C-on 175 min és 20 ° C végtelenségig. A biszulfittal kezeit DNS-t nyerünk a Epitect spin oszlop, majd szekvenáltuk megerősíteni hatékonyságát biszulfit konverzió. Katalógusa

metilációs analízise katalógusa

MSP-t használják, hogy elemezzék metilációs miR-219-2-3p upstream régió sejtvonalakban és szövetekben. Methprimer használták tervezésére MSP primer (táblázat S1). MSP reakciók új primereket optimalizálható Denaturált pozitív kontroll (M-DNS-t), amely normál humán perifériás limfocita DNS-t kezeltük in vitro Sss I metiltranszferáz (New England Biolabs, Beverly, MA). A DNS-t két normál humán perifériás limfociták használtunk normál kontroll. Touchdown PCR két fázisból állt: 1. fázis tartalmazza egy kezdeti denaturáció 95 ° C-on 5 perc, amelyet 45 ciklus követett denaturálással 95 ° C-on 30 s, lánckapcsolódás változó hőmérsékleteken 30 s, és kiterjesztés 72 ° C-on 40 s. Az első ciklusban a lágyítási hőmérséklet volt beállítva 58 ° C, és a mind a 10 következő ciklusokban, a lágyítási hőmérséklet -kal csökkent 0,6 ° C-on. 2. fázis állt: 35 ciklus 95 ° C-on 30 s, 52 ° C-on 30 másodpercig és 72 ° C-on 40 másodpercig. MSP termékeket elemeztük 3% -os poliakrilamid gélen.

A sejtproliferációt, az apoptózis, és a sejtciklus esszé

A sejteket 10% -os CCK-8 (Dojindo; Kumamoto, Japán) hígított normál táptalaj 37 ° C hőmérsékleten, amíg a vizuális szín konverzió történt. Proliferációs sebességet meghatároztuk a 0, 24, 48, 72, 96 órával a transzfekció után. A minden lyuk abszorbanciáját mértük mikrotiterlemez-leolvasó beállított 450 nm és 630 nm-nél. Minden kísérletet négyszeres ismétlésben. Az apoptózis assay-t végeztünk MGC-803 és HGC-27 sejtvonalak 72 órával a transzfekció után a PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA), és elemeztük fluoreszcenciával aktivált sejtosztályozással (FACS) . Sejtciklus analízist végeztünk MGC-803 és HGC-27 sejtvonalak 48 órával a transzfekció után a miR-219-2-3p utánozza kódoltakat volt. A sejteket összegyűjtöttük, kétszer mostuk hideg PBS-ben, rögzített jéghideg 70% -os etanollal, és inkubáltuk propidium-jodid (Pl) és az RN-áz A, majd FACS-szal elemeztük. Minden mintát három párhuzamosban.

-migráció és inváziós vizsgálati eljárást

MGC-803 és HGC-27 sejteket tenyésztettünk összefolyásig 12 lyukú műanyag edények, és kezeltük scramble vagy miR-219 -2-3p utánozza. 24 órával a transzfekció után, a lineáris karcolás sebek (három példányban) hoztak létre az összefolyó egysejtrétegek használatával 200 ul pipetta hegyét. Sejtek eltávolítására a sejtciklus megelőzően sebzés, sejteket tartottunk fenn szérummentes tápközegben. Hogy láthatóvá migrált sejtek és sebgyógyulás, felvételeket készítettünk a 0, 12, 24, 36, 48, 60 és 72 óra órán keresztül. Összesen tíz területeket véletlenszerűen kiválasztott minden egyes lyukba, majd a sejteket három lyukban az egyes csoportok mennyiségileg. Az inváziós vizsgálati eljárást, 24 óra után transzfekció, 1 × 10 ^{5 sejt szérummentes média oltunk a Transwell migrációs kamrák (8 jim pórusméretű; Millipore, Svájc), amelyek vonunk be Matrigel (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA) a felső kamrába. Media, amely 20% FBS-t adtunk az alsó kamrába. 24 óra elteltével a nem-behatoló sejteket eltávolítottuk vattával, az invazív sejtek található az alsó felülete a kamra megfestettük May-Grünwald-Giemsa festék (Sigma Diagnostics, St. Louis, Missouri, USA) és megszámoltuk mikroszkóp (Olympus, Tokió, Japán). A kísérleteket függetlenül háromszor megismételjük.}

fehérje izolálás és Western-blot

a jelzett időpontokban, MGC-803 sejtek és HGC-27 sejteket begyűjtöttük jéghideg PBS-sel és lizáltuk jégen hideg előkészítése módosított radio puffert kiegészítve proteáz inhibitorok. A fehérje koncentrációját úgy határoztuk meg, a BCA Protein Assay Kit (Bio-Rad, Milánó, Olaszország), és egyenlő mennyiségű fehérjét SDS-PAGE (10% akrilamid). Géleket elektroblottoltuk nitrocellulóz membránra (Millipore, Bedford, MA, USA). Az immunoblot kísérletekhez membránokat blokkoltuk 2 órán 5% zsírmentes száraz tej Tris-pufferolt sóoldatban, amely 0,1% Tween-20, és inkubáltuk 4 ° C-on egy éjszakán át az elsődleges antitesttel. Detektálás peroxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel használja a fokozott kemilumineszcenciás rendszert. Elsődleges felhasznált antitestek: GAPDH származó Zhong Shan Jinqiao (Peking, Kína); ERK1 /2 (nyúl anti-ERK1 /2, New England Biolab, NEB) és foszfo-ERK1 /2 (nyúl anti-foszfo-ERK1 /2, New England Biolab, NEB)

Szövettan
<

• PLoS One: Nagy kifejezése hősokk fehérje 90 társul Tumor agresszivitás és rossz prognózissal előrehaladott gyomorrákban szenvedő betegek Cancer
• PLoS One: Nem invazív Látványterv mikroRNS-16 a kemorezisztenciájának gyomorrák használata Dual riporter gén képalkotó System