PLoS ONE: Funções MicroRNA-219-2-3p como um supressor tumoral no câncer gástrico e é regulado pelo DNA metilação

Abstract

Fundo & Visa

O câncer gástrico é o tumor gastrointestinal mais comum em adultos e é a forma mais letal de câncer humano. Apesar das melhorias em tratamentos, o mecanismo subjacente da carcinogénese gástrica não é bem conhecido. Para definir novos moduladores que regulam a susceptibilidade à tumorigênese, nós nos concentramos em miR-219-2-3p.

Métodos

RT-PCR quantitativo foi empregada para investigar o nível de miR-219-2 -3p no câncer gástrico (GC) tecidos (n = 113) e seus combinados tecidos normais adjacentes (n = 113). Na proliferação celular in vitro, ensaios de apoptose, a migração celular, invasão e ensaios foram realizados para esclarecer os efeitos biológicos de miR-219-2-3p. Uma vez que o silenciamento de miARN pelo promotor ilha CpG metilação pode ser um mecanismo importante na tumorigênese, GC células foram tratadas com 5-aza-2'-desoxicitidina e tricostatina A, e mudanças de miR-219-2-3p expressão foram subsequentemente examinados por quantitativa RT-PCR. Finalmente, o estado de metilação da ilha CpG a montante do miR-219-2-3p foi analisada por PCR específicos de metilação em tecidos GC (n = 22).

Resultados

miR-219- 2-3p foi regulada para baixo em GC e linhas celulares. Além disso, as experiências documentada a expressão inferior do miR-219-2-3p em amostras de GC com maior grau e tumores em fases avançadas. Enquanto isso, o miR-219-2-3p exercida antiproliferativa, pró-apoptótica e papéis antimetastáticos e redução dos níveis de p-ERK1 /2 em células de GC. Além disso, 5-aza-2'-desoxicitidina e tricostatina A aumentou a expressão (~ 2 vezes) de miR-219-2-3p em células de GC. Por PCR específicos de metilação, a metilação do DNA na região a montante de miR-219-2-3p foi detectado em ambos os tecidos normais e tecidos de cancro adjacente. Como esperado, o nível de metilação foi consideravelmente maior no miR-219-2-3p grupo regulada para baixo em relação ao grupo-regulada.

Conclusões

miR-219-2-3p é potencialmente envolvidos na progressão do cancro gástrico e metástase regulando as vias de sinal relacionadas-2 ERK1 /, que podem fornecer uma nova estratégia terapêutica para o tratamento do cancro gástrico. mecanismo de metilação podem estar envolvidos na modulação do nível de miR-219-2-3p no cancro gástrico expressão

citação:. Lei H, Zou D, Li Z, Luo H, Dong G, Wang B, et ai . Funções (2013) MicroRNA-219-2-3p como um supressor tumoral no câncer gástrico e é regulado pelo DNA metilação. PLoS ONE 8 (4): e60369. doi: 10.1371 /journal.pone.0060369

editor: Arun Rishi, Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Dezembro, 2012; Aceito: 26 de fevereiro de 2013; Publicação: 23 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Lei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Natural Science Foundation da China [2012, 91.129.716, a JY] eo Beijing Municipal Science & Tecnologia da Comissão [2010B071, a JY]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (CG) é o 4 ^{th câncer mais comum ea segunda maior causa de morte por câncer no mundo. Hoje em dia, os pacientes com GC em estágio avançado está com uma sobrevida global em 5 anos de aproximadamente 20% [1]. Cancro desenvolve-se como um resultado de uma acumulação de várias causas endógenas e exógenas. Os hábitos alimentares e um aumento da Helicobacter pyloriinfection são importantes causas exógenas para GC [2], enquanto genéticos, bem como suplementos dietéticos, os níveis da hormona gastrina [3], e de outros factores que causam a inflamação gástricas crónicas são encontrados para ser associado com predisposição ao desenvolvimento de câncer. alterações do gene desempenham um papel importante em GC, e alterações em um grande número de oncogenes e genes supressores de tumores já foram relatados em GC.}

Alguns biomarcadores tumorais prognósticos em GC, tais como o receptor do factor de crescimento epidérmico humano 2 (HER2 ), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), factor de crescimento epidérmico (EGFR), têm sido associados com as características da doença e podem, portanto, ser utilizado para informar o doente. Por exemplo, os pacientes com tumores que testam positivo para HER2 pode ser tratada com trastuzumab mais quimioterapia [4], e os pacientes com tumores que testam positivo para o VEGF pode ser tratada com bevacizumab mais quimioterapia [5]. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento de GC continuam a ser um desafio, portanto, são urgentemente necessários biomarcadores adicionalmente informativos.

Os microRNAs (miRNA) são uma classe de pequenas moléculas de RNA envolvidos na regulação da tradução e da degradação de mRNAs [6 ]. MiRNAs ligam-se a sequências complementares em regiões não traduzidas a 3 '(UTR) dos seus mRNAs alvo e induzir a degradação do mRNA ou a repressão de translação [7]. funções mais conhecidas de miRNAs estão relacionados com a regulação do gene negativo: miRNAs silêncio expressão do gene, geralmente por interferir com a estabilidade do mRNA ou a tradução da proteína. Nos últimos anos, foram Acredita miARNs para actuar como oncogene ou gene supressor de tumor, e contribuem para a iniciação e progressão do cancro pela regulação da expressão do gene [8]. A descoberta de hipermetilação região a montante específico do cancro de inúmeros miRNAs tem demonstrado um mecanismo epigenético para a expressão miRNA aberrante [9], [10]

Em humanos e ratos, há dois loci genômica (miR-219-. 1 e miR-219-2) que codificam transcritos de precursores de miR-219. miR-219-1 está localizada no cromossoma 6 (MI0000296) e miR-219-2 está localizado no cromossoma 9 (MI0000740) [11] (Fig. 1A). Processamento dos transcritos precursoras por Dicer gera três miARNs maduros: miR-219-5p de terminais 5 'de ambos os precursores, e miR-219-1-3p e miR-219-2-3p a partir da extremidade 3' da pré miR-219-1 e pré-miR-219-2, respectivamente. Uma vez que a região de sementes destas três produtos maduros é única, cada miARN está previsto para regular alvos exclusivos. Embora o miR-219-5p é conhecido por ser sub-regulada no cancro múltiplos, tais como astrocitoma maligno [12] e o carcinoma hepatocelular [13], a expressão de miR-219-1-3p e miR-219-2-3p não possui foi estudado. Curiosamente, os genes de miR-199b e miR-219-2-3p estão localizados na proximidade de um segmento de cromossoma 9q34.11 (Fig. 1A). Um estudo anterior demonstrou que o miR-199b-5p foi regulada para baixo em meduloblastoma por metilação de uma ilha CpG 3 kb a montante do local de 5'-promotor de miR-199b-5p [14]. Uma vez que a metilação de ADN pode afectar grandes regiões de cromatina e regulam a transcrição de genes distantes, é necessário investigar se o miR-219-2-3p é regulada negativamente e regulada por metilação como miR-199b-5p no cancro. Neste estudo, descobrimos que miR-219-2-3p foi regulada para baixo em tecidos GC e associados com fenótipos progressivos de GC. Além disso, a re-introdução de miR-219-2-3p reduziu a viabilidade das células de GC e a apoptose celular induzida, sugerindo que o miR-219-2-3p era um supressor de tumor candidato em GC. Uma análise mais aprofundada de metilação do promotor de miR-219-2-3p indicou que a sua expressão foi regulada por metilação de ilhas CpG correlacionada com alguma extensão. Finalmente, descobrimos que miR-219-2-3p agiu como um supressor de tumor através da inibição da atividade de ERK1 via de sinal /2 em células GC

Resultados

miR-219-2-. 3p foi expresso diferencialmente em GC e GC linhas celulares

Para avaliar a expressão de miR-219-2-3p em GC, análise de RT-PCR TaqMan foi conduzido em 113 pares de tecidos GC e combinados amostras de tecidos normais adjacentes . Em comparação com amostras de tecido normal, mais do que metade dos tumores primários exibiram baixos níveis de miR-219-2-3p (58%, 65 113; A Fig. 1B). Além disso, quatro pacientes cuja expressão de miR-219-2-3p foram significativas sub-regulada foram escolhidos (Fig. 1D). A expressão de miR-219-2-3p nesses doentes e quatro linhas de células de GC (MGC-803, HGC-27, MKN-45, SGC-7901) foi analisada para revelar que o miR-219-2-3p também foi down- regulada em células de GC (Fig. 1E). Estes resultados sugerem que regulava-down miR-219-2-3p foi um acontecimento frequente em GC humana e pode estar envolvido na carcinogênese gástrica. Devido ao universal a infra-regulação de miR-219-2-3p em linhas celulares GC testados, MGC-803 e HGC-27 foram escolhidos aleatoriamente para um estudo mais aprofundado.

Relação entre fatores clínico-patológicos e miR-219- expressão 2-3p em GC

Este estudo incluiu 113 pacientes do GC. Para avaliar a correlação entre a expressão de miR-219-2-3p e características clínico-patológicas, os pacientes foram divididos em grupos com baixo-regulação e aumento da regulação. Como mostrado na tabela 1 e Figura 1C, foi observada uma associação estatisticamente significativa entre a expressão de miR-219-2-3p e GC estágio clínico. Os pacientes com níveis mais baixos de expressão de miR-219-2-3p parecia estar associado com tumores de alto grau e em estágio final (p = 0,047, independente de amostras de teste t). Estes dados sugerem que as alterações de miR-219-2-3p poderiam estar envolvidos na progressão da GC.

A sobre-expressão de miR-219-2-3p GC em células inibe a proliferação celular e sobrevivência celular

a redução notável da expressão de miR-219-2-3p em amostras de GC nos promovido para explorar o possível significado biológico de miR-219-2-3p na tumorigênese. Dado que o miR-219-2-3p desempenhado um papel na regulação da proliferação de células [15], células MGC-803 e HGC-27 foram transfectadas com imita o miR-219-2-3p e mexidos e analisadas para o crescimento celular, célula apoptose e na progressão do ciclo celular, respectivamente. Primeiro de tudo, a RT-PCR foi utilizado para medir o nível de miR-219-2-3p após experiências superexpressão. Descobrimos que miR-219-2-3p aumentou em mais de 100 dobras em miRNA transfectadas MGC-803 e HGC-27 células (Fig.2a). Além disso, o ensaio de proliferação de CCK-8 mostrou que a taxa de crescimento de células foi reduzido em miR-219-2-3p imita-transfectadas MGC-803 e células HGC-27, quando comparado com células transfectadas com codificar ou células não tratadas (Fig. 2B). Após a transfecção, a razão entre a inibição foi de 26% (48 h) e 28% (96 h) nas células MGC-803 e 13% (72 h) e 14% (96 h) em células HGC-27. Estes resultados sugerem que o miR-219-2-3p foi efectivamente envolvidos na regulação negativa do crescimento celular. No entanto, não houve nenhum efeito significativo sobre a paragem do ciclo celular em células de miR-219-2-3p GC tratados (Fig. S1). Para abordar se a sobre-regulação de miR-219-2-3p iria induzir a apoptose de células de GC e a morte celular, o número de pré-apoptótica MGC-803 e células HGC-27 a seguir ao tratamento com imita o miR-219-2-3p foi examinada. Como esperado, poucas células apoptóticas precoce (10% em MGC-803 ou 2,9% em HGC-27) foram detectados nas células tratadas com precipitação, enquanto que o tratamento imita o miR-219-2-3p aumentou a percentagem de células apoptóticas precoces (17,5 % em MGC-803 ou 8.3 no HGC-27) como julgado por anexina V coloração (Fig. 2C). Portanto, concluímos que miR-219-2-3p poderia afetar a sobrevivência das células em células de GC.

A superexpressão de miR-219-2-3p em células GC inibe a migração celular e invasão

Para detectar se mais de miR-219-2-3p está associada com a progressão de GC, a cicatrização de feridas e de ensaio Transwell foram realizadas para analisar o efeito da expressão de miR-219-2-3p sobre o comportamento migratório e invasivo da MGC-803 e HGC- 27 células. Descobrimos que a introdução de miR-219-2-3p em MGC-803 e HGC-27 células resultou numa redução significativa da migração das células durante o fecho de uma ferida artificial criado sobre uma monocamada confluente (Fig. 3A). Estas células foram mantidas em meio isento de soro, durante o curso de cicatrização de feridas para assegurar que qualquer comportamento migratório aumentada não pode ser afectada pela proliferação celular alterada. Além disso, a restauração de miR-219-2-3p inibiu drasticamente o normalmente forte capacidade invasiva do MGC-803 e as células HGC-27, que transportava baixo nível endógena de miR-219-2-3p (Fig. 3B). Estes resultados indicaram que a sobre-expressão de miR-219-2-3p contribui para a regulação da motilidade celular e GC progressão in vitro.

miR-219-2-3p expressão é regulada epigeneticamente

Com base na conclusões acima, podemos concluir que miR-219-2-3p foi um importante regulador no GC. No entanto, os mecanismos de regulação da expressão de miR-219-2-3p ainda eram desconhecidos. Uma vez que muitos miARNs foram identificadas como alvos de regulação da metilação, tais como o miR-9, miR-34b /C e miR-148a em carcinomas metastáticos [16], e miR-137 e miR-193a no cancro oral [17], miR- 193b e miR-145 no cancro da próstata [18], [19], decidimos analisar o mecanismo de regulação da expressão de miR-219-2-3p de sua metilação do genoma. Após a análise da região genômica que mede o gene miR-219-2-3p, identificamos uma grande ilha CpG (Fig. 4A). Para investigar se o miR-219-2-3p foi regulada epigeneticamente em GC, MGC-803, HGC-27 as células foram tratadas com inibidor de demethyltransferase, 5-aza-2'-desoxicitidina (5-Aza-CdR) e a histona-desacetilase inibidor tricostatina A (TSA). Em seguida, a expressão de miR-219-2-3p por RT-PCR foi analisada (Fig. 4B). Os resultados mostraram que a expressão de miR-219-2-3p foi regulada em duas situações: para o tratamento com 5-Aza-CdR, a expressão de miR-219-2-3p foi regulado para cima em MGC-803 ( 5-Aza-CdR 1,5? mol /L; 2,14 vezes) e HGC-27 (5-Aza-CdR 0,5? mol /L; 3,07 vezes) em comparação com o grupo de controlo tratado com DMSO; para o tratamento de combinação de 5-Aza-CdR e TSA, a expressão de miR-219-2-3p foi muito maior em MGC-803 (5-Aza-CdR 1,5? mol /L; 1,98 vezes) e HGC-27 (5 -Aza-CdR 1,5? mol /L; 1,28 vezes) em comparação com o grupo de controlo de TSA. Estes resultados indicaram que fatores epigenéticos poderia afetar a expressão de miR-219-2-3p no GC. A sinergia de inibição de desmetilação e da histona desacetilase conduzido para a re-expressão de miR-219-2-3p em GC. Para detectar se mais de miR-219-2-3p foi associada com metilação de CG, examinou-se o estado de metilação da região a montante de miR-219-2-3p utilizando PCR específicos de metilação (MSP; A Fig. 4C). 22 pares de tecidos (tumores primários e seus combinados tecidos normais adjacentes) nos 113 pares foram escolhidos, incluindo 11 pacientes que possuíam baixos níveis de miR-219-2-3p (down-regulation grupo) e 11 pacientes que possuíam maior miR-219 níveis -2-3p (up-regulation grupo). Descobrimos que a metilação do DNA nas regiões a montante de miR-219-2-3p existia tanto em tecidos normais e tecidos de cancro adjacente. No entanto, a relação de hipermetilação da região a montante do gene de miR-219-2-3p no grupo regulação negativa foi de 63,6% (7 em 11), que foi mais elevada do que o grupo a regulação positiva (36,3%, 4 dos 11 ). Estes resultados sugeriram que o nível de metilação de CpG da região a montante do miR-219-2-3p foi maior no grupo de miR-219-2-3p regulada para baixo do que na sobre-regulada uma.

A sobreexpressão de miR-219-2-3p amortece via de ERK1 /2 de sinalização

a activação de ERK1 /2 via foi bem documentada em diversos tipos de tumores, tais como a CG [20], o cancro pancreático [21] e do cancro da mama [ ,,,0],22]. Estudos anteriores demonstraram a importância da via de sinalização ERK1 /2 na regulação da migração, invasão e metástase de linhas celulares de cancro [23]. Para investigar se a miR-219-2-3p afeta as atividades celulares através de ERK1 2 caminho /, o nível de fosforilação de ERK1 /2 em MGC-803 e as células HGC-27 foi examinada após a sobre-expressão de miR-219-2-3p. os níveis celulares de P-ERK1 /2 significativamente diminuída em miR-219-2-3p células mimetiza-transfectadas como comparado com as células transfectadas com codificar ou não tratados. No entanto, não foi observada nenhuma diferença óbvia no total ERK1 /2 nível (Fig. 5A). Estes achados sugerem que o crescimento celular GC acelerado pode ser parcialmente explicado pelo ativados ERK1 /2 vias.

abordagem bioinformática para procurar potenciais alvos de
miR-219-2-3p

MiRNAs modular gene expressão através da interacção com os seus mRNAs alvo, resultando em degradação do mRNA ou a repressão de translação. Para investigar ainda mais o mecanismo de miR-219-2-3p no GC, nós bioinformatically (TargetScan Versão 5.2 e miRDB) e funcionalmente implicado miR-219-2-3p no GC, e encontrou os genes alvo de miR-219-2- 3p (Tabela S2). Entre os alvos 371 previstos de miR-219-2-3p, 31 deles mostrado elevado potencial, uma vez que foram previstas pelos dois programas, enquanto que outros só foram previstos por um dos programas. Desses 31 genes, ErbB3, MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1, SOX4 foram encontrados para ser genes oncogenes ou relacionados com a apoptose por artigos publicados anteriores. (Fig. 5B e 5C).

Discussão

Nos últimos anos, a evidência acumulada levou oncologistas a especular que os fatores moleculares não reveladas, particularmente não-codificante RNAs anteriormente classificados como "lixo", jogo papéis importantes na tumorigénese e progressão do tumor. Dependendo dos seus objectivos de ARNm, miARNs podem funcionar como supressores de tumor ou promotores de oncogénese. No entanto, os mecanismos que desregulados miARNs não têm sido amplamente estudados, incluindo biogénese aberrante miARN e transcrição [24], [25], alteração epigenética [26], [27], e a amplificação ou a perda de regiões genómicas que codificam miARNs [28] .

Como mostrado neste relatório, analisamos a expressão de miR-219-2-3p em 113 pacientes GC e descobriram que os níveis parecem ser menores em GC. Embora o miR-219-2-3p foi relatado para ser estreitamente relacionadas com retinopatia diabética [29], oligodendrócitos [15], doença de Alzheimer [30] e glioblastoma [12], a sua função em GC permanece a ser determinada. Além disso, mostraram que a re-expressão de miR-219-2-3p GC em células resultou na indução de apoptose de células e a viabilidade celular reduzida. Estes resultados permitiram-nos a especular que a regulação negativa de miR-219-2-3p pode proporcionar uma vantagem de sobrevivência às células GC. No entanto, o mecanismo responsável por miR-219-2-3p sub-regulação GC ainda é desconhecida. Uma vez que a perda em 9q34.11, em que o miR-219-2-3p está localizado, é raramente detectada em GC [31], é pouco provável que a perda alélica é responsável pela sua infra-regulação. Por outro lado, verificou-se que o miR-219-2-3p foi acentuadamente regulada para cima quando as células MGC, GC-803 e HGC-27, foram tratados tanto com 5-Aza-CdR e TSA. Além disso, a análise computacional revela que o miR-219-2-3p está localizado numa ilha CpG no cromossoma 9q34.11. Portanto, parece possível que a metilação do DNA e desacetilação da histona pode estar associada com a regulação miR-219-2-3p. Por MSP, frequências amostras de metilação detectados na região a montante de miR-219-2-3p foi maior no grupo de sub-regulada miR-219-2-3p do que no grupo supra-regulados. Esta especificidade mobilado a hipótese de uma relação entre a expressão de miR-219-2-3p e metilação do DNA. No geral, os resultados sugerem que a metilação foi um importante mecanismo de miR-219-2-3p down-regulação no GC.

Realizamos previsão por programas TargetScan e miRDB e descobriram que 6 genes seriam potenciais alvos de miR -219-2-3p. Entre os alvos candidatos de miR-219-2-3p, o receptor tirosina quinases ErbB3 (epidérmica família do receptor do factor de crescimento) chamou a nossa atenção. Altos níveis de ErbB3 está fortemente associada com a progressão do tumor e mau prognóstico de doentes com GC [32] - [34] e os inibidores de cinase de EGFR gefitinib poderia impedir de EGFR e ERBB2 activação de ErbB3. Enquanto isso, expressão ErbB3 também serve como um indicador eficaz de sensibilidade a gefitinib [35]. Sabe-se que a transcrição reprimida ErbB3 inibe a cascata de sinalização a partir de ERK1 /2 vias [36]. No entanto, os genes alvo para precisa ainda ser validada experimentalmente. Além disso, miARN pode funcionar de acordo com um modelo de circuitos combinatória, em que um único miARN pode ter como alvo vários mRNAs, e vários co-expressas miARN pode ter como alvo um único ARNm. Estudos recentes têm sugerido que o conceito biológico de um 'hit-alvos múltiplos' pode ser utilizado em terapêutica clínica [37]. É provável que um miARN específico pode funcionar através cooperativa a sub-regulação de vários alvos e miARNs função também por supressão da tradução dos seus genes-alvo. Para explorar o impacto total de um miRNA, estudos de proteômica do genoma devem ser feitas.

Em conclusão, a nossa expressão e estudos funcionais sugerem que miR-219-2-3p foi diferencialmente expressos pelo mecanismo de metilação e teve um função de supressão tumoral regulando as vias de sinalização relacionadas-2 ERK1 /em GC. Enquanto isso, a menor expressão de miR-219-2-3p em amostras de GC foi correlacionado com maior grau e fase posterior. Retoma expressão de miR-219-2-3p em células GC suprimiu a proliferação celular, migração, invasão e apoptose induzida indicou que baseado no padrão de miARN theraputic pode servir como uma base para o desenvolvimento de novas terapias potenciais em cancro gástrico.

Materiais e Métodos

Tissue espécimes

tumores gástricos e seus tecidos morfologicamente normais (localizado > 3 cm de distância do tumor) foram obtidos entre novembro de 2009 e novembro de 2011 a partir de 113 pacientes submetidos a GC cirurgia no Hospital do Câncer da Academia chinesa de Ciências Médicas (CICAMS, n = 21), Hospital Chinese PLA Geral (301 hospital, n = 31), eo primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Shanxi (n = 61). O uso de amostras de tecido para todos os experimentos foi aprovado pelo conselho de ética do Instituto de Ciências Médicas Básicas, da Academia Chinesa de Ciências Médicas. Todos os participantes desde que o seu consentimento informado verbal para participar neste estudo, e os seus consentimentos informados verbal foram escritos para baixo. Este processo de consentimento também foi aprovado pelo conselho de ética. As amostras de tecido foram cortadas em duas partes, uma delas foi fixada com formalina a 10% para diagnóstico histopatológico, e o outro foi imediatamente congelados instantaneamente em azoto líquido, e armazenado a -196 ° C em azoto líquido até à extracção do ARN. Este grupo era composto por 95 machos, 17 fêmeas e um sem informação de sexo com uma idade mediana de 58 anos (variação, 31-82 anos) .Formalin-fixo blocos de tecido embebidos em parafina de GC foram coletados a partir do Hospital do Câncer da Academia Chinesa de Ciências médicas (CICAMS, n = 4) entre 2009 e 2011. Devido às diferenças individuais entre os pacientes, que não tinham informação de alguns dados clínico-patológicas. O uso de amostras de tecido para todos os experimentos foi aprovado por todos os pacientes e pelo Comitê de Ética da instituição. As características dos pacientes estão descritas na Tabela 1.

culturas de células e transfecção

Um total de 4 linhas de células GC humanos MGC-803 (cancro gástrico mucinoso, pouco diferenciado), HGC-27 ( linfonodo metastático, carcinoma indiferenciado), MKN-45 (carcinoma anel de sinete pouco diferenciado), SGC-7901 (adenocarcinoma, moderadamente diferenciado) foram examinados neste estudo. O MGC-803 HGC-27, MKN-45, linha celular SGC-7901 foi adquirida a partir do celular Centro de Recursos do Instituto de Ciências Médicas Básicas, da Academia Chinesa de Ciências Médicas e Peking Union Medical College (Pequim, China). MGC-803 foi propagada em meio de Dulbecco modificado de Eagle (Gibco; Invitrogen; Life Technologies, Alemanha), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; PAA, Pasching, Austria) e estreptomicina (100 ug /ml), penicilina (100 U /ml). O HGC-27, MKN-45, SGC-7901 foram mantidas em meio RPMI 1640 (PAA) suplementado com FBS a 10% (PAA). As linhas de células humanas MGC CG-803, HGC-27 foram transfectadas com imita o miR-219-2-3p e imita miARN controlo negativos (GenePharma; Xangai, China, Tabela S1) a uma concentração final de 10 nmol /L utilizando um Dharmafect (Thermo Fisher; IL, EUA) de acordo com as instruções do fabricante

TaqMan RT-PCR para miARN Expressão

o ARN total foi extraído a partir das células e tecidos com o reagente de Trizol (Invitrogen, Calsbad. , CA, EUA). MiRNAs foram quantificados por PCR em tempo real utilizando TaqMan MicroRNA ensaio (Invitrogen, EUA). ADN complementar a síntese da primeira cadeia (ADNc) foi realizada a partir de 1 ug de ARN total em 12 uL de volume final contendo 2 M de iniciador de haste-laçada, 10 mM de mistura de dNTP (Invitrogen, EUA). A mistura foi em placas a 65 ° C durante 5 min, e, em seguida, misturado com 5 × tampão RT, DTT 0,1 M, 200 U /ul MultiScribe transcriptase inversa e de 40 U /ul de inibidor de RNase (Invitrogen, EUA). A mistura foi em placas a 37 ° C durante 55 min, 70 ° C durante 15 min e, em seguida, mantida a -20 ° C. PCR em tempo real foi realizado utilizando um protocolo de PCR TaqMan padrão. As 20 reacções PCRs ul incluiu 1 ml de produto RT, 1 × Universal Master Mix TaqMan e 1 × sonda TaqMan /mistura de iniciadores (Invitrogen, EUA, Tabela S1). Todas as reações RT incluindo controles não-modelo foram realizadas em triplicado. Todos os dados mRNA quantificação foi normalizado para U6. A quantidade relativa de transcrição foi calculado usando o método Ct comparativa.

5-Aza-CdR e Trichostatin Um tratamento de linhas celulares

linhas celulares GC MGC-803 foram tratados com 5-aza 2'-desoxicitidina (5-Aza-CdR, Sigma-Aldrich, EUA) a 0,7 umol /L, 1,5 nmol /L, 3 mmol /L e HGC-27 foram tratadas com 5-Aza-CdR em 0,5 pmol /L, 1 umol /L, 1,5 nmol /L durante 3 dias ou 300 nmol /L de tricostatina a (TSA; Sigma-Aldrich, EUA) durante 24 horas. Para o tratamento combinado, as células foram tratadas com 5-Aza-CdR em primeiro lugar durante 48 horas. Em seguida, TSA (300 nmol /L) foi adicionado, e as células foram tratadas durante mais 24 horas. O meio de cultura contendo o fármaco foi substituído a cada 24 horas. ARN de linhas de células foi purificado com o reagente TRIzol seguindo as instruções do fabricante. a síntese de cDNA foi realizada como descrito anteriormente, e 1 ml de cDNA diluído para cada amostra foi amplificado por RT-PCR utilizando o protocolo previamente descrito.

e isolamento de ADN modificação com bissulfito

O ADN genómico foi obtido a partir de -196 ° C em tumores primários nitrogênio líquido, e sua correspondência tecidos normais adjacentes (n = 22, incluem 11 pacientes que expressão de miR-219-2-3p foram regulados negativamente e os outros foram-se regulamentados) e usados ​​Biomed DNA Kit (Biomed, Beijing, China) de acordo com as instruções do fabricante. tratamento e recuperação de amostras de bissulfito foram realizadas com o kit Epitect bissulfito (Qiagen; Hilden, Alemanha). O ADN genómico (2 ug) em 20 ul de água foi utilizada para cada reacção e misturado com 85 ul mistura de bissulfito e 35 ul de ADN proteger tampão. conversão de bissulfito foi realizada num termociclador como se segue: 99 ° C durante 5 min, 60 ° C durante 25 min, 99 ° C durante 5 min, 60 ° C durante 85 min, 99 ° C durante 5 min, 60 ° C durante 175 min e 20 ° C indefinidamente. A-tratado com bisulfito o ADN foi recuperado por centrifugação Epitect coluna e, subsequentemente, sequenciado para confirmar a eficiência de conversão de bissulfito.

análise de metilação

MSP foi usada para analisar a metilação de miR-219-2-3p região a montante em linhas celulares e tecidos. Methprimer foi utilizada para conceber iniciadores de MSP (Tabela S1). reacções MSP sobre novos iniciadores foram optimizadas usando o controlo positivo metilado (M-ADN) que usando o DNA do linfócito periférico humano normal tratados in vitro com Sss I metiltransferase (New England Biolabs, Beverly, MA). O DNA de dois linfócitos periféricos humanos normais foi utilizado como controlo normal. Touchdown PCR consistiu em duas fases: fase 1 incluiu uma desnaturação inicial de 95 ° C durante 5 min, seguido por 45 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 30 s, hibridação a temperaturas variáveis ​​durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 40 s. No primeiro ciclo, a temperatura de hibridação foi ajustado para 58 ° C e, em cada um dos 10 ciclos subsequentes, a temperatura de hibridação foi reduzida de 0,6 ° C. Fase 2 consistiu em 35 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 52 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 40 s. MSP produtos foram analisados ​​em géis de poliacrilamida a 3%

A proliferação celular, apoptose, e ensaio do ciclo celular

As células foram incubadas em 10% de CCK-8. (Dojindo; Kumamoto, Japão) diluída em condições normais meio de cultura a 37 ° C até que a conversão de cor visual ocorreu. as taxas de proliferação foram determinados às 0, 24, 48, 72, 96 horas após a transfecção. A absorvância de cada poço foi medida com um leitor de microplacas fixado em 450 nM e 630 nM. Todas as experiências foram realizadas em quadruplicado. O ensaio de apoptose foi realizada em linhas celulares de HGC-27 MGC-803 e 72 horas após a transfecção usando o Kit de PE Anexina Detecção V apoptose I (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA) e analisadas por células activadas por fluorescência (FACS) . análise do ciclo celular foi realizada em linhas celulares de HGC-27 MGC-803 e 48 horas após a transfecção com imita o miR-219-2-3p e precipitação respectivamente. As células foram colhidas, lavadas duas vezes com PBS frio, fixadas em gelada etanol a 70%, e incubou-se com iodeto de propídio (PI) e RNase A, em seguida, analisadas por FACS. Cada amostra foi executado em triplicado.
Ensaios

migração e invasão celular

MGC-803 e HGC-27 células foram cultivadas até à confluência em 12 poços pratos de plástico e tratada com precipitação ou miR-219 imita -2-3p. 24 horas após a transfecção, as feridas de raspar linear (em triplicado) foram criadas em monocamadas de células confluentes os utilizando uma ponta de pipeta de 200 uL. Para remover as células do ciclo celular antes da formação da ferida, as células foram mantidas em meio isento de soro. Para visualizar as células migraram e a cicatrização de feridas, as imagens foram tiradas às 0, 12, 24, 36, 48, 60 e 72 h horas. Um total de dez áreas foram seleccionados aleatoriamente a partir de cada cavidade e as células em três poços de cada grupo foram quantificados. Para os ensaios de invasão, após 24 horas de transfecção, 1 × 10 ^{5 células em meios isentos de soro foram semeadas em câmaras de migração Transwell (tamanho de poro de 8 um; Millipore, Suíça) que foram revestidas com Matrigel (Sigma-Aldrich; St Louis, MO, EUA) na câmara superior. Meios contendo FBS a 20% foi adicionada à câmara inferior. Após 24 horas, as células não invasoras foram removidas com algodão em rama, as células invasivas localizados na superfície inferior da câmara foram coradas com corante May-Grunwald-Giemsa (Sigma Diagnostics, St Louis, Missouri, EUA) e contadas utilizando um microscópio (Olympus; Tóquio, Japão). Experimentos foram repetidos de forma independente por três vezes.}

isolamento de proteínas e western blot

Nos tempos indicados, as células MGC-803 e as células HGC-27 foram colhidas em PBS gelado e lisadas em gelo em preparação de tampão frio radioimunoprecipitação modificado, suplementado com inibidores de protease. A concentração de proteína foi determinada pelo BCA Protein Assay Kit (Bio-Rad, Milão, Itália) e quantidades iguais de proteínas foram analisadas por SDS-PAGE (acrilamida 10%). Os géis foram electrotransferidas para membranas de nitrocelulose (Millipore, Bedford, MA, EUA). Para as experiências de imunotransferência, as membranas foram bloqueadas durante 2 h com leite seco não gordo a 5% em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20, e incubadas a 4 ° C durante a noite com anticorpo primário. A detecção foi realizada por anticorpos secundários conjugados com peroxidase utilizando o sistema de quimioluminescência aumentada. Os anticorpos primários utilizados foram: GAPDH de Zhong Shan JinQiao (Pequim, China); ERK1 /2 (coelho anti-ERK1 /2, New England Biolab, NEB) e fosfo-ERK1 /2 (coelho anti-fosfo-ERK1 /2, New England Biolab, NEB)

Histologia

Os tecidos foram fixados durante a noite em formalina tamponada, embebidos em parafina, cortados em espessura de 3 mm, e corados com hematoxilina-eosina (H & e). coloração

Bioinformatics e análise estatística dos dados
<

• PLOS ONE: alta expressão de choque térmico Protein 90 está associado a tumor agressividade e mau prognóstico em pacientes com câncer gástrico avançado
• PLOS ONE: Visualização não invasiva de MicroRNA-16 na chemoresistance de câncer gástrico Usando um Dual Reporter Gene imagem System