PLoS ONE: MicroRNA-219-2-3p Funktionen als Tumorsuppressor bei Magenkrebs und wird reguliert durch DNA-Methylation

Abstrakt

Hintergründe & Ziele

Magenkrebs ist die häufigste gastrointestinale Tumor bei Erwachsenen und ist die tödlichste Form von Krebs beim Menschen. Trotz der Verbesserungen in Behandlungen wird die zugrunde liegende Mechanismus der Karzinogenese Magen nicht bekannt. Um neue Modulatoren definieren, die Anfälligkeit für die Tumorgenese regulieren, konzentrierten wir uns auf miR-219-2-3p.

Methoden

Quantitative RT-PCR wurde verwendet, um das Niveau von miR-219-2 zu untersuchen -3p bei Magenkrebs (GC) Gewebe (n = 113) und ihre ausgeglichenen benachbarten normalen Geweben (n = 113). In-vitro-Zellproliferation, Apoptose-Assays, Zellmigration und Invasion Assays wurden durchgeführt, um die biologische Wirkung von miR-219-2-3p aufzuklären. Da zum Schweigen zu bringen von miRNA durch Promoter CpG-Insel-Methylierung ist ein wichtiger Mechanismus in der Tumorgenese sein können, wurden GC-Zellen behandelt mit 5-Aza-2'-Desoxycytidin und Trichostatin A und Ausdruck Änderungen von miR-219-2-3p wurden durch quantitative anschließend geprüft RT-PCR. Schließlich wurde der Methylierungsstatus von CpG-Insel vor miR-219-2-3p durch Methylierung-spezifische PCR in GC Gewebe analysiert (n = 22).

Ergebnisse |

miR-219- 2-3p wurde herunterreguliert in GC und Zelllinien. Darüber hinaus dokumentiert die Versuche, die geringere Expression von miR-219-2-3p in GC-Proben mit einem höheren Grad und späteren Stadium Tumoren. Inzwischen übte miR-219-2-3p antiproliferative, proapoptotic und antimetastatic Rollen und reduzierte Mengen von p-ERK1 /2 in GC-Zellen. Weiterhin 5-Aza-2'-desoxycytidin und Trichostatin A erhöhte die Expression (~ 2-fach) von miR-219-2-3p in GC-Zellen. Durch methylierungsspezifische PCR, DNA-Methylierung in der stromaufwärtigen Region von miR-219-2-3p wurde in beiden angrenzenden normalen Geweben und Krebsgeweben nachgewiesen. Wie erwartet, war der Methylierungsgrad deutlich höher in der miR-219-2-3p Gruppe herunterreguliert als hochreguliert Gruppe.

Schlussfolgerungen

miR-219-2-3p ist potentiell in Magenkrebsprogression und Metastasierung durch regulieren ERK1 /2-bezogene Signalwegen beteiligt, die eine neue therapeutische Strategie zur Behandlung von Magenkrebs liefern. Methylierungs-Mechanismus kann bei der Modulation der Expression von miR-219-2-3p bei Magenkrebs beteiligt sein

Citation:. Lei H, Zou D, Li Z, Luo M, Dong L, Wang B, et al . (2013) MicroRNA-219-2-3p Funktionen als Tumorsuppressor in Magenkrebs und wird von DNA-Methylierungs-Regulated. PLoS ONE 8 (4): e60369. doi: 10.1371 /journal.pone.0060369

Editor: Arun Rishi, Wayne State University, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 14. Dezember 2012; Akzeptiert: 26. Februar 2013 beginnen; Veröffentlicht: 23. April 2013

Copyright: © 2013 Lei et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China [2012, 91129716, zu JY] und der Beijing Municipal Wissenschaft &unterstützt; Technologie Kommission [2010B071, zu JY]. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die 4 ^{th am häufigsten auftretende Krebsart und die zweithäufigste Ursache für Krebstod weltweit. Heutzutage werden Patienten mit GC late-Stadium werden mit einer insgesamt 5-Jahres-Überlebenszeit von ca. 20% [1]. Krebs entwickelt sich als Folge einer Ansammlung von verschiedenen endogenen und exogenen Ursachen. Ernährungsgewohnheiten und eine Zunahme der Helicobacter pyloriinfection sind wichtige exogene Ursachen für GC [2], während genetische, sowie Nahrungs, Spiegel des Hormons Gastrin [3], und anderen chronischen Magen-Entzündung verursachenden Faktoren gefunden mit Veranlagung in Verbindung gebracht werden zur Entwicklung von Krebs. Genveränderungen spielen eine wichtige Rolle in GC und Veränderungen in einer Vielzahl von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen bereits in GC berichtet.}

Einige prognostischer Tumor Biomarkern in GC wie humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2 ) haben vascular endothelial growth factor (VEGF), epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), mit Krankheitsmerkmalen assoziiert und kann daher verwendet werden Patientenverwaltung zu informieren. Zum Beispiel Patienten mit Tumoren, die positiv für HER2 Test kann mit Trastuzumab plus Chemotherapie [4], und Patienten mit Tumoren behandelt werden, die für VEGF positive Test kann mit Bevacizumab plus Chemotherapie [5] behandelt werden. Jedoch bleiben die molekularen Mechanismen, die Entwicklung von GC zugrunde liegen eine Herausforderung, also zusätzlich informative Biomarker dringend benötigt werden.

MicroRNAs (miRNAs) in Regulation der Translation eine Klasse von kleinen RNA-Moleküle beteiligt sind und den Abbau von mRNAs [6 ]. MiRNAs binden an komplementäre Sequenzen in der nicht-translatierten Regionen (UTR) ihrer Ziel-mRNAs '3 und mRNA Degradation oder translationale Repression [7] zu induzieren. Die meisten bekannten Funktionen von miRNAs sind zu negativen Genregulation im Zusammenhang mit: miRNAs Stille Genexpression, in der Regel, indem sie mit der mRNA-Stabilität oder Proteintranslation zu stören. In den letzten Jahren wurden miRNAs angenommen als Onkogen oder Tumorsuppressor-Gen zu wirken und zu Krebs Initiierung und Progression bei, indem sie die Genexpression regulieren [8]. Die Entdeckung von Krebs-spezifische upstream-Region Hyper zahlreicher miRNAs hat einen epigenetischen Mechanismus für anomale miRNA-Expression nachgewiesen [9], [10].

In der menschlichen und Mäuse gibt es zwei genomischen Loci (miR-219- 1 und miR-219-2), die miR-219-Vorläufer-Transkripte kodieren. miR-219-1 liegt auf Chromosom 6 (MI0000296) und mir-219-2 liegt auf Chromosom 9 (MI0000740) [11] (Abb. 1A). Die Verarbeitung der Vorläufer-Transkripte von Dicer erzeugt drei reifen miRNAs: miR-219-5p vom 5'-Enden der beiden Vorläufer und miR-219-1-3p und miR-219-2-3p vom 3'-Ende der prä- miR-219-1 und pre-miR-219-2 sind. Da der Seed-Region dieser drei reifen Produkte einzigartig ist, ist jede miRNA eindeutige Ziele regulieren vorhergesagt. Obwohl miR-219-5p zu herunterreguliert werden ist bekannt, in mehreren Krebs wie maligne Astrozytom [12] und des hepatozellulären Karzinoms [13], hat die Expression von miR-219-1-3p und miR-219-2-3p nicht untersucht. Interessanterweise miR-199b und miR-219-2-3p Gene sind in die Nähe zu einem Segment des Chromosoms 9q34.11 (Fig. 1A) befindet. In einer früheren Studie gezeigt, dass miR-199b-5P wurde herunterreguliert in Medulloblastom durch Methylierung einer CpG-Insel 3 kb stromaufwärts der 5'-Seite von miR-199b-5P-Promotor [14]. Da die DNA-Methylierung große Regionen des Chromatins und regulieren die Transkription von entfernten Gene beeinflussen können, ist es notwendig, zu untersuchen, ob miR-219-2-3p herunterreguliert und durch Methylierung als miR-199b-5P in Krebs geregelt. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass miR-219-2-3p wurde herunterreguliert in GC-Geweben und mit progressiver Phänotypen von GC verbunden. Außerdem Wiedereinführung von miR-219-2-3p reduziert die Lebensfähigkeit der GC-Zellen und induziert Zell-Apoptose, was darauf hindeutet, dass miR-219-2-3p ein Kandidat Tumorsuppressor in GC war. Weitere Methylierungsanalyse von miR-219-2-3p Promotor zeigte an, dass seine Expression durch Methylierung von korrelierten CpG-Inseln zu einem gewissen Grad geregelt wurde. Schließlich fanden wir, dass miR-219-2-3p als Tumorsuppressor fungiert, um die Aktivität von ERK1 /2-Signalweges in GC-Zellen durch Hemmung.

Ergebnisse |

miR-219-2- 3p wurde in GC und GC-Zelllinien

Zur Beurteilung der Expression von miR-219-2-3p in GC, TaqMan RT-PCR-Analyse wurde in 113 Paaren von GC Gewebe durchgeführt und abgestimmt angrenzenden normalen Gewebeproben unterschiedlich exprimiert . Verglichen mit normalen Gewebeproben, mehr als die Hälfte der Primär niedrigen miR-219-2-3p (58%, 65 113.; 1B) zeigte Tumoren. Des Weiteren vier Patienten, deren Expression von miR-219-2-3p waren signifikant herunterreguliert wurden ausgewählt (Abb. 1D). Die miR-219-2-3p Ausdruck bei den Patienten und vier GC-Zelllinien (MGC-803, HGC-27, MKN-45, SGC-7901) wurde zu offenbaren analysiert, dass miR-219-2-3p wurde auch Down- reguliert in GC-Zellen (Fig. 1E). Diese Ergebnisse legen nahe, dass nach unten reguliert miR-219-2-3p ein häufiges Ereignis in der menschlichen GC war und vielleicht in Magen-Krebsentstehung beteiligt sein. Aufgrund des universellen Herunterregulation von miR-219-2-3p in getestet GC-Zelllinien, MGC-803 und HGC-27 wurden für eine weitere Studie zufällig ausgewählt.

Beziehung zwischen klinisch-pathologischen Faktoren und miR-219- 2-3p Ausdruck in GC

Diese Studie umfasste 113 Patienten GC. Um die Korrelation zwischen miR-219-2-3p Expression und klinisch-pathologischen Eigenschaften zu bewerten, Patienten wurden in Gruppen mit Down-Regulation aufgeteilt und Hochregulation. Wie in Tabelle 1 und 1C gezeigt, eine statistisch signifikante Assoziation zwischen der Expression von miR-219-2-3p und GC klinischen Stadium beobachtet. Die Patienten mit einem niedrigeren Niveau von miR-219-2-3p Ausdruck schien mit hochwertigen und Spätstadium Tumoren (p = 0,047, unabhängigen Stichproben t-Test) in Verbindung gebracht werden. Diese Daten legen nahe, dass Veränderungen von miR-219-2-3p konnte in GC Progression beteiligt werden.

Die Überexpression von miR-219-2-3p in GC-Zellen hemmt die Zellproliferation und das Überleben der Zellen

die bemerkenswerte Reduktion von miR-219-2-3p Expression in GC-Proben gefördert uns die mögliche biologische Bedeutung von miR-219-2-3p in Tumorigenese zu erkunden. Da miR-219-2-3p eine Rolle in der Regulation der Zellproliferation spielt [15], MGC-803 und HGC-27-Zellen wurden transfiziert mit miR-219-2-3p und scramble nachahmt und analysiert für das Zellwachstum, Zell Apoptose und Zellzyklus-Progression sind. Zuallererst wurde RT-PCR verwendet, um das Niveau von miR-219-2-3p nach Überexpression Experimenten zu messen. Wir fanden, dass miR-219-2-3p erhöhte sich um mehr als 100 Falten in miRNA transfizierten MGC-803 und HGC-27-Zellen (2A). Darüber hinaus wurde die CCK-8-Proliferationstest, dass die Zellwachstumsrate in miR-219-2-3p nachahmt transfizierten MGC-803 und HGC-27-Zellen, wenn sie mit Scramble-transfizierten Zellen oder unbehandelten Zellen (Fig. 2B) im Vergleich reduziert dargestellt. Nach der Transfektion wurde das Hemmverhältnis 26% (48 h) und 28% (96 h) in den MGC-803 Zellen und 13% (72 h) und 14% (96 h) in HGC-27-Zellen. Diese Ergebnisse legten nahe, dass miR-219-2-3p zwar in der negativen Regulation des Zellwachstums beteiligt war. Allerdings gab es keinen signifikanten Effekt auf die Zellzyklusarrest in miR-219-2-3p behandelt GC-Zellen (Abb. S1). Anzusprechen, ob die Hochregulierung von miR-219-2-3p induzieren würde GC-Zell-Apoptose und Zelltod, die Anzahl der frühen apoptotischen MGC-803 und HGC-27-Zellen nach der Behandlung mit miR-219-2-3p imitiert wurde untersucht. Wie zu erwarten, einige frühe apoptotische Zellen (10% in MGC-803 oder 2,9% in HGC-27) wurden in den Scramble-behandelten Zellen nachgewiesen, während miR-219-2-3p nachahmt Behandlung erhöht den Prozentsatz der frühen apoptotischen Zellen (17.5 % in MGC-803 oder 8.3 in HGC-27), wie durch Annexin V-Färbung (Abb. 2C) beurteilt. Daher beschlossen wir, dass miR-219-2-3p in GC-Zellen das Überleben von Zellen beeinflussen könnten.

Die Überexpression von miR-219-2-3p in GC-Zellen die Zellmigration und Invasion

hemmt weiter erkennen, ob miR-219-2-3p mit Fortschreiten der GC, die Wundheilung und die Transwell-Test verbunden ist wurden ausgeführt, um die Wirkung von miR-219-2-3p Ausdruck auf der Migrations- und Invasionsverhalten von MGC-803 und HGC- zu analysieren 27 Zellen. Wir fanden, dass die Einführung von miR-219-2-3p in MGC-803 und HGC-27-Zellen während des Schließens einer künstlichen Wunde in einer signifikanten Reduktion der Zellmigration resultiert eine konfluente Monoschicht erzeugt über (Fig. 3A). Diese Zellen wurden in serumfreiem Medium im Verlauf der Wundheilung gehalten, um sicherzustellen, dass jede Augmented Zugverhalten nicht durch veränderte Zellproliferation beeinflusst werden. Darüber hinaus Restaurierung von miR-219-2-3p gehemmt dramatisch die normalerweise stark invasive Kapazität von MGC-803 und HGC-27-Zellen, die eine niedrige endogene Menge von miR-219-2-3p (Abb. 3B) getragen wird. Diese Ergebnisse zeigten, dass miR-219-2-3p Überexpression trägt zur Regulation der GC Zellbeweglichkeit und Progression in vitro.

MiR-219-2-3p Ausdruck ist epigenetisch regulierten

auf der Basierend vorstehenden Feststellungen schließen wir, dass miR-219-2-3p ein wichtiger Regulator in GC war. Allerdings waren die Regulationsmechanismen von miR-219-2-3p Ausdruck noch unbekannt. Da viele miRNAs wurden als Ziele der Methylierung Regulierung, wie miR-9 identifiziert, miR-34b /c und miR-148a in metastatischen Karzinomen [16], und miR-137 und miR-193a in Mundkrebs [17], Mir- 193b und miR-145 in Prostatakrebs [18], [19], haben wir beschlossen, den Regulationsmechanismus von miR-219-2-3p Ausdruck aus seiner genomischen Methylierung zu analysieren. Nach der genomischen Region Analyse des miR-219-2-3p Gen Spanning identifizierten wir eine große CpG-Insel (Abb. 4A). Um zu untersuchen, ob miR-219-2-3p epigenetically in GC geregelt wurde, MGC-803 HGC-27-Zellen wurden mit demethyltransferase Inhibitor behandelt, 5-Aza-2'-desoxycytidin (5-Aza-GGV) und dem Histon-Deacetylase Inhibitor Trichostatin A (TSA). Dann wird die Expression von miR-219-2-3p durch RT-PCR analysiert wurde (Fig. 4B). Die Ergebnisse zeigen, dass die Expression von miR-219-2-3p in zwei Situationen hochreguliert war: für die 5-Aza-CdR Behandlung, die Expression von miR-219-2-3p hochreguliert war in MGC-803 ( 5-Aza-CdR 1,5 &mgr; mol /l; 2,14-fach) und HGC-27 (5-Aza-CdR 0,5 &mgr; mol /l; 3,07-fach) im Vergleich mit DMSO behandelten Kontrollgruppe; für die 5-Aza-CDR- und TSA-Behandlung war die Expression von miR-219-2-3p viel höher in MGC-803 (5-Aza-CdR 1,5 &mgr; mol /l; 1,98-fach) und HGC-27 (5 -Aza-CdR 1,5 mmol /L; 1,28-fach) im Vergleich mit TSA Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse zeigten, dass epigenetische Faktoren miR-219-2-3p Ausdruck in GC beeinträchtigen könnten. Synergie von Demethylierung und Histon-Deacetylase-Hemmung führte zur Wiederexpression von miR-219-2-3p in GC. Um festzustellen, ob miR-219-2-3p mit Methylierung von GC verbunden war, untersuchten wir den Methylierungsstatus des miR-219-2-3p Upstream-Bereich unter Verwendung von methylierungsspezifische PCR (MSP, Fig. 4C). 22 Paare von Geweben (primäre Tumoren und deren abgestimmt angrenzenden normalen Gewebe) in den 113 Paaren ausgewählt wurden, darunter 11 Patienten, die niedrigere miR-219-2-3p Ebenen besaß (Down-Regulation-Gruppe) und 11 Patienten, die besaß höhere miR-219 -2-3p Ebenen (hoch~~POS=TRUNC Gruppe). Wir fanden heraus, dass die DNA-Methylierung in vorgelagerten Bereichen von miR-219-2-3p sowohl in normalen Geweben und Krebsgewebe benachbart existierte. Jedoch war die hypermethylation Verhältnis von upstream-Region von miR-219-2-3p Gens in der Herunterregulierung Gruppe 63,6% (7 von 11), die höher ist als die Hochregulierung Gruppe war (36,3%, 4 der 11 ). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Methylierungsgrad des Upstream-CpG-Bereich von miR-219-2-3p höher war in der miR-219-2-3p herunterreguliert Gruppe als in der hochreguliert ein.

Die Überexpression von miR-219-2-3p dämpft ERK1 /2-Signalwegs

Die Aktivierung von ERK1 /2-Weg und in verschiedenen Tumorarten, wie GC [20], Bauchspeicheldrüsenkrebs [21] und Brustkrebs behandelt wurde [ ,,,0],22]. Frühere Studien haben die Wichtigkeit von ERK1 /2-Signalwegs bei der Regulation der Migration, Invasion und Metastasierung von Krebszelllinien [23] dargestellt. Um zu untersuchen, ob miR-219-2-3p Zellaktivitäten durch ERK1 /2-Weg beeinflusst wurde die Phosphorylierung von ERK1 /2 in MGC-803 und HGC-27-Zellen nach der miR-219-2-3p Überexpression untersucht. Cellular Ebenen der p-ERK1 /2 deutlich zurückgegangen in miR-219-2-3p ahmt transfizierten Zellen wie mit Scramble-transfiziert oder unbehandelten Zellen verglichen. Es wurde jedoch kein offensichtlicher Unterschied in insgesamt ERK1 /2-Ebene beobachtet werden (Abb. 5A). Diese Befunde legen nahe, dass die beschleunigte GC Zellwachstum könnte zum Teil darauf zurückzuführen sein, aktivierte ERK1 /2 Wege.

Bioinformatics Ansatz für potentielle Ziele von miR-219-2-3p
suchen

MiRNAs Gen modulieren Ausdruck, indem sie mit ihren Ziel-mRNAs, was zu mRNA-Abbau oder translationale Repression zu interagieren. Um den Mechanismus von miR-219-2-3p in GC untersuchen wir bioinformatisch (TargetScan Release 5.2 und miRDB) und funktionell miR-219-2-3p in GC verwickelt, und fand die Gene gezielt von miR-219-2- 3p (Tabelle S2). Unter den 371 vorhergesagte Ziel von miR-219-2-3p, 31 von ihnen hohe Potential gezeigt, da sie von beiden Programme vorhergesagt wurden, während andere nur durch eines der Programme vorhergesagt wurden. Von diesen 31 Genen, ERBB3, MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1 wurden SOX4 gefunden von früher veröffentlichten Papiere Onkogen oder Apoptose-verwandte Gene zu sein. (Fig. 5B und 5C).

Diskussion

In den letzten Jahren hat sich eine Evidenz Onkologen geführt, dass nicht offenbarten molekularen Faktoren zu spekulieren, vor allem nicht-kodierenden RNAs bisher als klassifiziert "Junk" spielen eine wichtige Rolle in der Tumorentstehung und Tumorprogression. Je nach ihrer mRNA-Ziele können miRNAs dienen als Tumorsuppressoren oder Promotoren von Onkogenese. Jedoch sind die Mechanismen, die miRNAs dysreguliert nicht umfassend untersucht worden, einschließlich aberrant miRNA Biogenese und Transkription [24], [25], epigenetische Veränderung [26], [27], und die Verstärkung oder Verlust der genomischen Regionen, die miRNAs [28] kodieren .

Wie in diesem Bericht gezeigt, wir die Expression von miR-219-2-3p in 113 GC-Patienten und fanden analysiert, dass die Konzentrationen in GC niedriger zu sein scheinen. Obwohl miR-219-2-3p eng verwandt wurde berichtet, zu einer diabetischen Retinopathie zu sein [29], Oligodendrozyten [15], Alzheimer-Krankheit [30] und Glioblastom [12], bleibt seine Funktion im GC bestimmt werden. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die re-expression von miR-219-2-3p in GC-Zellen bei der Induktion von Zellapoptose geführt und verringerte die Lebensfähigkeit der Zellen. Diese Ergebnisse konnten wir, dass die Herunterregulierung von miR-219-2-3p zu spekulieren, könnte einen Überlebensvorteil zu GC-Zellen bereitzustellen. Allerdings ist der Mechanismus für miR-219-2-3p Down-Regulation in GC noch unbekannt. Da der Verlust an 9q34.11, wobei miR-219-2-3p befindet, selten in GC [31] festgestellt wird, ist es unwahrscheinlich, dass allelische Verlust für die Herabregulierung verantwortlich ist. Auf der anderen Seite fanden wir, dass miR-219-2-3p war deutlich hochreguliert, wenn GC-Zellen, MGC-803 und HGC-27 mit beiden behandelt wurden 5-Aza-CDR- und TSA. Darüber hinaus zeigt Computeranalyse, dass miR-219-2-3p in einer CpG-Insel auf dem Chromosom 9q34.11 befindet. Daher scheint es möglich, dass die DNA-Methylierung und Histondeacetylierung kann mit miR-219-2-3p Regelung in Verbindung gebracht werden. Durch MSP Proben Methylierung Frequenzen im Upstream-Bereich von miR-219-2-3p nachgewiesen war in der miR-219-2-3p herunterreguliert Gruppe als in der hochregulierten Gruppe. Diese Besonderheit lieferte die Hypothese einer Beziehung zwischen miR-219-2-3p Expression und DNA-Methylierung. Insgesamt legten die Ergebnisse nahe, dass die Methylierung ein wichtiger Mechanismus für miR-219-2-3p Down-Regulation in GC war.

Wir führten Vorhersage von TargetScan und miRDB Programme und fanden heraus, dass sechs Gene potentielle Ziele von miR sein könnte -219-2-3p. Unter den Kandidaten Ziele von miR-219-2-3p, die Rezeptor-Tyrosin-Kinasen ERBB3 (epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor-Familie) zog unsere Aufmerksamkeit. Hohe ERBB3 ist stark mit Tumorprogression und schlechte Prognose von Patienten mit GC assoziiert [32] - [34] und die EGFR-Kinase-Hemmer Gefitinib könnte EGFR und ErbB2-Aktivierung von ERBB3 verhindern. Inzwischen ERBB3 Ausdruck dient auch als ein wirksamer Prädiktor der Empfindlichkeit gegenüber Gefitinib [35]. Es ist bekannt, dass verdrängte ERBB3 Transkription hemmt Kaskaden von ERK1 /2-Wege [36] signalisiert. Allerdings müssen die vorhergesagte Zielgene weiter experimentell validiert werden. Außerdem kann miRNAs nach Funktion einer kombinatorischen Schaltungen Modell, in dem eine einzelne miRNA mehrere mRNAs Ziel kann und mehrere coexprimiert miRNAs kann eine einzelne mRNA abzielen. Jüngste Studien haben vorgeschlagen, dass das biologische Konzept des "One-Hit-mehrere Ziele" könnte in der klinischen Therapie verwendet werden [37]. Es ist wahrscheinlich, dass eine bestimmte miRNA durch kooperative Funktion kann die Herunterregulierung von mehreren Zielen und miRNAs Funktion auch durch die Übersetzung ihrer Zielgene unterdrücken. Um zu untersuchen, sollte die volle Wirkung eines miRNA, genomweite Proteom-Studien durchgeführt werden.

Abschließend unser Ausdruck und funktionelle Studien legten nahe, dass miR-219-2-3p differentiell durch Methylierung Mechanismus zum Ausdruck gebracht wurde und eine tumorale Unterdrückungsfunktion von ERK1 /2-bezogene Signalwege in GC zu regulieren. Inzwischen hat die geringere Expression von miR-219-2-3p in GC Proben wurde mit einem höheren Grad und späteren Stadium korreliert. Die Wiedereinführung Expression von miR-219-2-3p auf GC-Zellen unterdrückt die Zellproliferation, Migration, Invasion und induzierte Apoptose zeigten, dass die miRNA-basierte theraputic Muster als Grundlage für die Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten bei Magenkrebs dienen könnten.

Materialien und Methoden

Gewebeproben

Magentumoren und deren morphologisch normalen Geweben (befindet > 3 cm entfernt von dem Tumor) wurden zwischen November 2009 und November 2011 von 113 GC Patienten erhalten laufen Operation bei Krebskrankenhaus der chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften (CICAMS, n = 21), Chinesisch PLA General Hospital (301 Krankenhaus, n = 31), und der erste Affiliated Hospital der Medizinischen Universität Shanxi (n = 61). Die Verwendung der Gewebeproben für alle Experimente wurde von der Ethikausschuss des Instituts für Medizinische Grundlagenwissenschaften, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften genehmigt. Alle Teilnehmer zur Verfügung gestellt ihrer verbalen informierte Zustimmung in dieser Studie und ihrer verbalen informiert Zustimmungen abgewertet wurden teilzunehmen. Diese Einwilligung Prozess wurde auch von der Ethikkommission genehmigt. Gewebeproben in zwei Teile geschnitten, einer wurde für histopathologische Diagnose mit 10% Formalin fixiert, und die andere wurde sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -196 ° C in flüssigem Stickstoff bis zur RNA-Extraktion gelagert. Diese Gruppe bestand aus 95 Männern, 17 Frauen und ein ohne Geschlechtsinformation mit einem mittleren Alter von 58 Jahren (Bereich 31-82 Jahre) .Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeblöcke von GC aus dem Krebskrankenhaus der chinesischen Akademie gesammelt wurden von Medizinischen Wissenschaften (CICAMS, n = 4) zwischen 2009 und 2011. Aufgrund der individuellen Unterschiede zwischen Patienten fehlten uns Informationen einiger klinisch-pathologische Daten. Die Verwendung der Gewebeproben für alle Experimente wurde von allen Patienten und durch Ethikkommission der Institution genehmigt. Die Charakteristika der Patienten sind in Tabelle 1

Zellkulturen und Transfektion

Insgesamt 4 menschlichen GC-Zelllinien MGC-803 (muzinöse Magenkrebs, schlecht differenziert), HGC-27 beschrieben ( metastatischen Lymphknoten, undifferenziertes Karzinom), MKN-45 (Siegelring-Karzinom schlecht differenziert), SGC-7901 (Adenokarzinom, mäßig differenziert) wurden in dieser Studie untersucht. Die MGC-803 HGC-27, MKN-45, SGC-7901-Zelllinie wurde aus der Zelle Resource Center des Instituts für Medizinische Grundlagenwissenschaften, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften und Peking Union Medical College (Beijing, China) erworben. , Ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS; PAA, Pasching, Österreich) und Streptomycin (100 ug /ml), Penicillin (100 U MGC-803 wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (;; Invitrogen Life Technologies, Deutschland Gibco) vermehrt /ml). Der HGC-27, MKN-45, SGC-7901 wurden in RPMI 1640-Medium (PAA) mit 10% FBS (PAA), supplementiert gehalten. Die humanen Zellinien GC MGC-803 HGC-27 mit miR-219-2-3p nachahmt transfiziert wurden und negative Kontrolle nachahmt miRNA (Genepharma, Shanghai, China, Tabelle S1) bei einer Endkonzentration von 10 nmol /L unter Verwendung von 1 Dharmafect (Thermo Fisher, IL, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers

TaqMan RT-PCR für miRNA Expression

Gesamt-RNA wurde aus den Zellen und Geweben mit Trizolreagenz (Invitrogen, extrahiert Calsbad. , CA, USA). MiRNAs wurden durch Echtzeit-PCR unter Verwendung von TaqMan MicroRNA-Assays (Invitrogen, USA) quantitativ bestimmt. Erststrang-komplementärer DNA (cDNA) -Synthese wurde 1 ug Gesamt-RNA in 12 &mgr; l Endvolumen, das 2 M Stem-Loop-Primers durchgeführt, der 10 mM dNTP Mix (Invitrogen, USA). Die Mischung wurde Platte bei 65 ° C für 5 min, und dann mit 5 × RT-Puffer, 0,1 M DTT, 200 U /ul MultiScribe Transkriptase und 40 U /ul RNase Inhibitor reverse (Invitrogen, USA). Die Mischung wurde Platte bei 37 ° C für 55 min, 70 ° C für 15 min und dann bei -20 ° C gehalten. Real-time PCR wurde unter Verwendung eines Standard-TaqMan-PCR-Protokoll durchgeführt. Die 20 &mgr; l PCR-Reaktionen enthalten 1 ul RT Produkt, 1 × Universal-TaqMan Master Mix und 1 × TaqMan-Sonde /Primer-Mix (Invitrogen, USA, Tabelle S1). Alle RT Reaktionen einschließlich No-Template-Kontrollen wurden dreifach durchgeführt. Alle mRNA Quantifizierung Daten an U6 normalisiert. Die relative Menge an Transkript wurde mit der Vergleichs Ct-Methode berechnet.

5-Aza-CdR und Trichostatin A Behandlung von Zelllinien

GC-Zelllinien MGC-803 mit 5-Aza behandelt wurden 2'-desoxycytidin (5-Aza-GGV; Sigma-Aldrich, USA) bei 0,7 &mgr; mol /l, 1,5 &mgr; mol /l, 3 &mgr; mol /L und HGC-27 wurden mit 5-Aza-CdR bei 0,5 &mgr; mol /L, 1 &mgr; mol /l, 1,5 &mgr; mol /l für 3 Tage oder 300 nmol /L Trichostatin A (TSA; Sigma-Aldrich, USA) für 24 Stunden. Für die Kombinationsbehandlung wurden die Zellen 48 Stunden lang zunächst mit 5-Aza-CdR behandelt. Dann TSA (300 nmol /L) wurde zugegeben, und die Zellen wurden für weitere 24 Stunden behandelt. Kulturmedium, das Medikament wurde alle 24 Stunden ersetzt. RNA von Zelllinien wurde vom Hersteller mit Trizolreagenz nach den Anweisungen gereinigt. cDNA-Synthese wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt und 1 ml der verdünnten cDNA für jede Probe wurde amplifiziert durch RT-PCR unter Verwendung des Protokolls zuvor beschrieben.

DNA Isolierung und Bisulfit-Modifikation

Genomic DNA wurde von -196 ° C in flüssigem Stickstoff primären Tumoren erhalten werden, und ihren benachbarten normalen Geweben (n = 22, 11, umfassen Patienten, die die Expression von miR-219-2-3p wurden herunterreguliert und die anderen wurden hochreguliert) abgestimmt und gebrauchte Biomed DNA Kit (Biomed, Beijing, China) nach den Anweisungen des Herstellers. (; Hilden, Deutschland Qiagen) Bisulfit-Behandlung und Verwertung von Proben wurden mit dem EpiTect Bisulfite Kit durchgeführt. Genomische DNA (2 ug) in 20 &mgr; l Wasser wurde für jede Reaktion und gemischt mit 85 ul Bisulfit-Mix und 35 &mgr; l DNA schützen Puffer verwendet. Bisulfit-Umwandlung wurde auf einem Thermocycler wie folgt durchgeführt: 99 ° C für 5 min, 60 ° C für 25 min, 99 ° C für 5 min, 60 ° C für 85 min, 99 ° C für 5 min, 60 ° C für 175 min und 20 ° C unbegrenzt. Die Bisulfit-behandelte DNA wurde durch EpiTect Spin-Säule gewonnen und anschließend sequenziert, um die Effizienz der Bisulfitumwandlung zu bestätigen.

Methylierungsanalyse

MSP wurde verwendet, um zu analysieren Methylierung von miR-219-2-3p stromaufwärtigen Bereich in Zelllinien und Geweben. Methprimer wurde verwendet MSP Primer zu entwerfen (Tabelle S1). MSP Reaktionen auf neue Primer wurden unter Verwendung Methylated positive Kontrolle (M-DNA) optimiert, was mit SSS in vitro behandelten normalen humanen peripheren Lymphozyten-DNA unter Verwendung von I-Methyltransferase (New England Biolabs, Beverly, MA). Die DNA von zwei normalen humanen peripheren Lymphozyten wurde als normale Kontrolle verwendet. Touchdown-PCR bestand aus zwei Phasen: Phase 1 eine anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 5 min aufgenommen, gefolgt von 45 Zyklen Denaturierung bei 95 ° C für 30 s, Annealing bei variablen Temperaturen für 30 s und Verlängerung bei 72 ° C für 40 s. Im ersten Zyklus wurde die Annealing-Temperatur auf 58 ° C, und bei jeder der 10 nachfolgenden Zyklen wurde die Annealing-Temperatur um 0,6 ° C verringert. Phase 2 bestand aus 35 Zyklen von 95 ° C für 30 s, 52 ° C für 30 s und 72 ° C für 40 s. MSP-Produkte wurden auf 3% Polyacrylamidgelen analysiert

Die Zellproliferation, Apoptose und Zellzyklus-Test

Die Zellen wurden in 10% CCK-8 inkubiert. (Dojindo; Kumamoto, Japan) in normalen verdünnt Kulturmedium bei 37 ° C bis zur visuellen Farbumwandlungs auftrat. Proliferationsraten wurden bei 0 bestimmt, 24, 48, 72, 96 Stunden nach der Transfektion. Die Absorption jeder Vertiefung wurde mit einem Mikroplattenleser bei 450 nm und 630 nm eingestellt gemessen. Alle Experimente wurden vierfach durchgeführt. Die Apoptose-Assay auf MGC-803 und HGC-27-Zelllinien 72 Stunden nach der Transfektion mit dem PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) durchgeführt wurde, und analysiert durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) . Zellzyklus-Analyse wurde jeweils auf MGC-803 und HGC-27 Zelllinien von 48 Stunden nach der Transfektion mit miR-219-2-3p nachahmt und Gerangel durchgeführt. Die Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS geerntet, gewaschen, in eiskaltem 70% igem Ethanol fixiert und mit Propidiumiodid (PI) und RNase A inkubiert, dann durch FACS analysiert. Jede Probe wurde dreifach durchgeführt.

Die Zellmigration und Invasion Assays

MGC-803 und HGC-27-Zellen wurden gezüchtet auf 12-Well-Plastikschalen bis zur Konfluenz und mit Gerangel oder miR-219 -2-3p imitiert. 24 Stunden nach Transfektion, linear Kratzwunden (in dreifacher Ausführung) wurden auf die konfluenten Zell-Monoschichten erzeugt eine 200 &mgr; l-Pipettenspitze verwendet wird. In den Zellen aus dem Zellzyklus vor der Verletzung zu entfernen, wurden die Zellen in serumfreiem Medium gehalten. Um gewanderten Zellen und die Wundheilung zu visualisieren, wurden Bilder nach 0, 12, 24, 36, 48, 60 und 72 h Stunden. Insgesamt zehn Bereiche wurden zufällig aus jeder Vertiefung gegeben und die Zellen in drei Vertiefungen jeder Gruppe ausgewählt wurden quantifiziert. Für die Invasionsassays, nach 24 Stunden nach der Transfektion wurden 1 x 10 ^{5 Zellen in serumfreien Medien wurden auf die Transwell-Migrationskammern ausgesät (8 &mgr; m Porengrße, Millipore, Schweiz), die mit Matrigel (Sigma-Aldrich beschichtet wurden; St. Louis, MO, USA) auf der oberen Kammer. Medium 20% FBS enthielt, wurde in die untere Kammer gegeben. (Sigma Diagnostics, St. Louis, Missouri, USA) Nach 24 Stunden wurden die nicht-eindringenden Zellen mit Watte, invasive Zellen auf der unteren Fläche der Kammer mit May-Grunwald-Giemsa gefärbt wurden entfernt entfernt und einem Mikroskop gezählt unter Verwendung von (Olympus, Tokio, Japan). Die Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander wiederholt.}

Proteinisolierung und Western-Blot

Zu den angegebenen Zeiten, MGC-803-Zellen und HGC-27-Zellen wurden in eiskaltem PBS geerntet und auf Eis lysiert Kalt Herstellung von modifizierten Radioimmunopräzipitation Puffer mit Protease-Inhibitoren ergänzt. Die Proteinkonzentration wurde durch das BCA Protein Assay Kit (Bio-Rad, Mailand, Italien) und die gleichen Mengen an Proteinen wurden analysiert durch SDS-PAGE (10% Acrylamid) bestimmt. Die Gele wurden auf Nitrocellulose-Membranen (Millipore, Bedford, MA, USA) elektrogeblottet. Für Immunoblot-Experimente wurden die Membranen für 2 h mit 5% fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung blockiert, der 0,1% Tween-20, und bei 4 ° C über Nacht mit dem primären Antikörper inkubiert. Die Detektion wurde durch Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper unter Verwendung des verstärkten Chemilumineszenz-System durchgeführt. Primäre Antikörper wurden verwendet: GAPDH von Zhong-Shan JinQiao (Beijing, China); ERK1 /2 (Kaninchen-Anti-ERK1 /2, New England Biolab, NEB) und phospho-ERK1 /2 (Kaninchen anti-Phospho-ERK1 /2, New England Biolab, NEB)

Histologie

Die Gewebe wurden über Nacht in gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten bis 3 &mgr; m Dicke und gefärbt mit Hämatoxylin-Eosin (H & E). Färbung

Bioinformatik und statistische Analysen von Daten
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• PLoS ONE: hohe Expression von Heat Shock Protein 90 ist im Zusammenhang mit Tumoraggressivität und einer schlechten Prognose bei Patienten mit fortgeschrittenem Magen Cancer
• PLoS ONE: Nicht-invasive Visualisierung von MicroRNA-16 in der Chemoresistenz von Magenkrebs Unter Verwendung eines Dual-Reporter Gene Imaging System