PLoS ONE: MicroRNA-219-2-3p toiminnot tuumorisuppressorina mahasyövän ja säätelee DNA Metylointi

tiivistelmä

Taustaa & Tavoitteet

Mahasyöpä on yleisin ruoansulatuskanavan kasvain aikuisilla ja on kaikkein vaarallisin muoto ihmisen syövän. Huolimatta parannuksista hoitojen taustalla olevan mekanismin mahasyövän ei ole tunnettu. Jos haluat määrittää uudet modulaattorit, jotka säätelevät alttius tumorgenesis keskityimme miR-219-2-3p.

Methods

kvantitatiivinen RT-PCR käytettiin tutkimaan tasolle miR-219-2 -3p mahasyövän (GC) kudokset (n = 113) ja niiden yhteensovitettujen viereisten normaaleissa kudoksissa (n = 113). In vitro solujen proliferaatiota, apoptoosin määrityksiä, solumigraatio, ja invaasio määritykset suoritettiin selvittämään biologisten vaikutusten miR-219-2-3p. Koska hiljentäminen of miRNA promoottoriaktivoinnilla CpG-saarekkeen metylaation voi olla tärkeä mekanismi tumorgenesis, GC soluja käsiteltiin 5-atsa-2'-deoksisytidiini ja trikostatiini A ja ilmaisun muutokset miR-219-2-3p sittemmin tutkinut kvantitatiivisia RT-PCR: llä. Lopuksi, metylaatiostatuksen CpG-saarekkeen ylävirtaan miR-219-2-3p analysoitiin metylaatiospesifinen PCR GC kudoksissa (n = 22).

Tulokset

miR-219- 2-3p oli säädellä vähentävästi GC ja solulinjoissa. Lisäksi kokeissa dokumentoitu alemman ilmaus miR-219-2-3p GC yksilöitä, joilla on korkeampi laatu ja myöhemmin kasvaimet. Samaan aikaan miR-219-2-3p aiheutti antiproliferatiivisia proapoptoottiset ja etäpesäkkeiden roolit ja kevyemmästä p-ERK1 /2 GC-soluissa. Lisäksi 5-atsa-2'-deoksisytidiini ja trikostatiini lisäsi lauseke (~ 2-kertainen) miR-219-2-3p GC soluissa. Metylointi-PCR, DNA: n metylaation ylävirran alueella miR-219-2-3p havaittiin vierekkäisten normaaleissa kudoksissa ja syöpäkudoksissa. Kuten odotettua, metylaatio taso oli huomattavasti suurempi miR-219-2-3p alassäädetty ryhmä kuin säädelty ryhmä.

Johtopäätökset

miR-219-2-3p on potentiaalisesti mukana mahalaukun syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden säätelemällä ERK1 /2 liittyvän signaalin polkuja, jotka voivat tarjota uusi terapeuttinen strategia hoitoon mahasyövän. Metylointi mekanismi voi olla osallisena moduloimaan ilmentymistaso miR-219-2-3p mahasyövän.

Citation: Lei H, Zou D, Li Z, Luo M, Dong L, Wang B, et ai . (2013) MicroRNA-219-2-3p toiminnot tuumorisuppressorina mahasyövän ja säätelee DNA Metylointi. PLoS ONE 8 (4): e60369. doi: 10,1371 /journal.pone.0060369

Editor: Arun Rishi, Wayne State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 joulukuu 2012; Hyväksytty: 26 helmikuu 2013; Julkaistu 23. huhtikuuta 2013

Copyright: © 2013 Lei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China [2012 91129716, että JY] ja Pekingin Kunnan Science & Teknologia-komissio [2010B071, että JY]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on 4 ^{th yleisin syöpä ja toiseksi korkein syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti. Nykyään potilaalla on myöhäisvaiheen GC ovat kokonaispituudeltaan 5 vuoden pysyvyys on noin 20% [1]. Syöpä kehittyy seurauksena kertymä erilaisia ​​endogeenisen ja eksogeenisen syitä. Ruokailutottumukset ja kasvu Helicobacter pyloriinfection ovat tärkeitä eksogeenisia syitä GC [2], kun taas geneettinen, sekä ruokavalion, hormoni gastriinin [3], ja muut krooniset mahalaukun tulehdus aiheuttavia tekijöitä on todettu liittyvän alttius syövän kehitystä. Gene muutokset tärkeä rooli GC, ja muutoksia useita onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille on jo raportoitu GC.}

Jotkut ennustetekijöiden kasvain biologisten merkkiaineiden GC kuten ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori 2 (HER2 ), verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), on liitetty taudin ominaisuudet ja joita siten voidaan käyttää ilmoittamaan potilaan hoidossa. Esimerkiksi potilailla, joilla on kasvaimia, jotka positiivisen HER2 voidaan hoitaa trastutsumabilla plus kemoterapia [4], ja potilailla, joilla on kasvaimia, jotka testaavat positiivisia VEGF voidaan hoitaa bevasitsumabia plus kemoterapia [5]. Kuitenkin molekyylitason mekanismit kehittämistä GC edelleen haaste, mikä lisäksi informatiivinen biomarkkereiden kiireellisesti.

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pienten RNA-molekyylien mukana säätelyyn kääntämisen ja hajoaminen mRNA: iden [6 ]. MiRNA sitoutuvat täydentäviä sekvenssien 3'alueet (UTR) niiden kohde mRNA: iden ja aiheuttaa mRNA: n hajoamisen tai translaation tukahduttaminen [7]. Useimmat tunnetut toiminnot miRNA liittyy negatiivisia geenisäätelyn: miRNA hiljaisuus geenin ilmentymisen, tavallisesti häiritsemällä mRNA vakautta tai proteiinin translaation. Viime vuosina miRNA uskottiin toimivan onkogeenin tai kasvainsuppressorigeenin, ja edistää syövän taudin alkamisen ja etenemisen säätelemällä geenin ilmentymistä [8]. Löytö syöpäspesifisessä ylävirran alueelle hypermetylaatiota lukuisia miRNA on osoittanut epigeneettisestä mekanismi poikkeavalle miRNA ilmaisun [9], [10].

Ihmisen ja hiirillä kaksi genomista loci (miR-219- 1 ja miR-219-2), jotka koodaavat miR-219 esiaste selostukset. miR-219-1 sijaitsee kromosomissa 6 (MI0000296) ja mir-219-2 sijaitsee kromosomissa 9 (MI0000740) [11] (Fig. 1A). Käsittely prekursorin transkriptien dicer luo kolme kypsä miRNA: miR-219-5p 5 'päät sekä esiasteiden ja miR-219-1-3p ja miR-219-2-3p 3'-päähän ennen miR-219-1 ja pre-miR-219-2, vastaavasti. Koska siemen alueella näiden kolmen kehittyneitä tuotteita on ainutlaatuinen, jokainen miRNA ennustetaan säännellä ainutlaatuinen tavoitteita. Vaikka miR-219-5p tiedetään alassäädetty useita syövän kuten pahanlaatuinen astrosytooma [12] ja maksasyövän [13], ilmentyminen miR-219-1-3p ja miR-219-2-3p ei ole tutkittu. Mielenkiintoista, miR-199B ja miR-219-2-3p geenit sijaitsevat läheisyys segmentin kromosomin 9q34.11 (Fig. 1A). Aiemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että miR-199B-5p oli säädellä vähentävästi medulloblastoma metyloimalla CpG saari 3 kb ylävirtaan 5'-sivusto miR-199B-5p promoottori [14]. Koska DNA: n metylaatio voi vaikuttaa suuria alueita chromatin ja säätelevät transkription kaukaisten geenien, on tarpeen tutkia, miR-219-2-3p säätyy alas ja säätelee Metylointia miR-199B-5p syövässä. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-219-2-3p oli säädellä vähentävästi GC kudoksissa ja liittyy etenevä fenotyypit GC. Lisäksi uudelleen aloittamisen miR-219-2-3p vähensi elinkelpoisuuden GC solujen ja indusoi apoptoosia, mikä viittaa siihen, että miR-219-2-3p oli ehdokkaana tuumorisuppressori GC. Lisäksi metyloituvuutta miR-219-2-3p promoottorin osoitti, että sen ilmentyminen säädeltiin metylaatio korreloi CpG-saarekkeiden jossain määrin. Lopuksi todettiin, että miR-219-2-3p toimi tuumorisuppressorina läpi inhiboimalla ERK1 /2-signaalin väylän GC-soluissa.

Tulokset

miR-219-2- 3p oli differentiaalisesti ilmaistu GC ja GC solulinjoissa

arvioimiseksi ilmentymisen miR-219-2-3p GC, TaqMan RT-PCR-analyysi suoritettiin 113 paria GC kudosten ja sovitettu viereisen normaali kudosnäytteiden . Verrattuna normaaliin kudosnäytteitä, yli puolet primäärikasvaimissa osoitti vähäistä miR-219-2-3p (58%, 65 113, Fig. 1 B). Lisäksi neljä potilasta, joiden ilmentymistä miR-219-2-3p olivat merkittäviä alassäädetty valittiin (Fig. 1 D). MIR-219-2-3p ilmentyminen näillä potilailla ja neljä GC solulinjoissa (MGC-803, HGC-27, MKN-45, SGC-7901) analysoitiin paljastaa miR-219-2-3p myös alas- säädellään GC soluissa (Kuva. 1 E). Nämä tulokset viittaavat siihen, alassäädetty miR-219-2-3p oli yleinen tapahtuma ihmisen GC ja saattaa olla mukana mahasyövän. Koska yleinen alas-säätely miR-219-2-3p in testattu GC solulinjoissa, MGC-803 ja HGC-27 valittiin satunnaisesti lisätutkimuksia varten.

suhde kliinis tekijöiden ja miR-219- 2-3p ilmentyminen GC

Tähän tutkimukseen osallistui 113 GC potilasta. Arvioida korrelaatio miR-219-2-3p ilmaisun ja kliinis ominaisuudet, potilaat jaettiin ryhmiin alassäätö ja säätelyä ylöspäin. Kuten taulukosta 1 ja 1C, tilastollisesti merkitsevä assosiaatio välillä havaittiin ekspression miR-219-2-3p ja GC kliinisessä vaiheessa. Potilaat on vähäisempää miR-219-2-3p ilmaisua näytti liittyy korkea-asteen ja myöhäisvaiheen kasvaimet (p = 0,047, itsenäinen-otosten t-testi). Nämä tiedot osoittivat, että korjauksilla miR-219-2-3p voisi osallistua GC etenemiseen.

yli-ilmentyminen miR-219-2-3p GC soluissa estää soluproliferaatiota ja solun selviytymisen

merkittävä väheneminen miR-219-2-3p ilmentymisen GC näytteiden edistänyt meidät tutkimaan mahdollisia biologista merkitystä miR-219-2-3p in tumorgenesis. Koska miR-219-2-3p ollut rooli sääntelyn soluproliferaation [15], MGC-803 ja HGC-27-solut transfektoitiin miR-219-2-3p ja scramble matkii ja analysoitiin solujen kasvua, solujen apoptoosin ja solusyklin etenemisen vastaavasti. Ensinnäkin, RT-PCR: ää käytettiin mittaamaan tason miR-219-2-3p jälkeen yli-ilmentymisen kokeissa. Huomasimme, että miR-219-2-3p kasvoi yli 100 taittuu miRNA transfektoiduissa MGC-803 ja HGC-27-solut (2A). Lisäksi CCK-8 lisääntymisen määrityksessä osoittaneet, että solujen kasvu väheni miR-219-2-3p jäljittelee transfektoiduissa MGC-803 ja HGC-27-soluissa verrattuna scramble-transfektoituja soluja tai käsittelemättömiä soluja (Fig. 2B). Transfektion jälkeen inhibitio suhde oli 26% (48 h) ja 28% (96 h) MGC-803-soluja ja 13% (72 h) ja 14% (96 h) HGC-27-soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-219-2-3p todellakin mukana negatiiviseen säätelyyn solujen kasvua. Kuitenkin, ei ollut merkittävää vaikutusta solusyklin pysähtymisen miR-219-2-3p käsiteltyjen GC soluja (Kuva. S1). Puuttumaan onko säätely ylöspäin miR-219-2-3p aiheuttaisivat GC-solujen apoptoosin ja solukuoleman määrä varhaisen apoptoottisten MGC-803 ja HGC-27-solujen käsittelyn jälkeen miR-219-2-3p matkii tutkittiin. Kuten odotettua, muutaman alussa apoptoottiset solut (10% MGC-803 tai 2,9% HGC-27) havaittiin sekoituskoodin-käsiteltyjä soluja, kun taas miR-219-2-3p jäljittelee käsittelyä prosenttiosuus kasvoi varhaisten apoptoottisten solujen (17,5 % in MGC-803 tai 8,3 HGC-27) arvioituna anneksiini V värjäytymistä (Fig. 2C). Siksi, päättelimme, että miR-219-2-3p voi vaikuttaa solujen selviytymistä GC soluissa.

yli-ilmentyminen miR-219-2-3p GC soluissa estää solujen vaeltamiseen ja invaasiota

lisäksi havaitsemaan, miR-219-2-3p liittyy etenemiseen GC, haavan paranemista ja siirtokuoppaan määritys suoritettiin vaikutuksen analysoimiseksi miR-219-2-3p lausekkeen vaeltavia ja invasiivisen käyttäytymisen MGC-803 ja HGC- 27-soluja. Huomasimme, että käyttöönotto miR-219-2-3p osaksi MGC-803 ja HGC-27-soluissa johti merkittävään vähentämiseen solumigraation sulkemisen aikana keinotekoinen haavan luoneet yli yksisolukerroksena (Fig. 3A). Nämä solut ylläpidettiin seerumittomassa elatusaineessa aikana haavan paranemista sen varmistamiseksi, että lisätyn muuttavat käyttäytymistä ei vaikuta muuttunut solujen proliferaatiota. Lisäksi palauttaminen miR-219-2-3p dramaattisesti esti yleensä vahva invasiivisen kapasiteetti MGC-803 ja HGC-27-solut, jotka suoritetaan alhaisen endogeenisen tason miR-219-2-3p (Fig. 3B). Nämä tulokset osoittivat, että miR-219-2-3p yliekspressio vaikuttaa säätelyyn GC soluliikkuvuus ja etenemiseen in vitro.

MiR-219-2-3p ilme on epigeneettiseltä säännelty

Perustuu edellä esitettyjen havaintojen voimme päätellä, että miR-219-2-3p oli tärkeä säätelijä GC. Kuitenkin sääntelyn mekanismeja miR-219-2-3p ilmentyminen olivat vielä tuntemattomia. Koska monet miRNA tunnistettiin kohteina metylaation sääntelyn, kuten miR-9, miR-34b /c ja miR-148a metastasoitunutta karsinoomia [16], ja miR-137 ja miR-193a suun syöpä [17], asennuspalveli- 193B ja miR-145 eturauhassyövässä [18], [19], päätimme analysoida sääntelyn mekanismi miR-219-2-3p ilmentyminen sen genomisesta metylaatio. Analysoinnin jälkeen genomin alueella ulottuu miR-219-2-3p geenin, olemme tunnistaneet suuren CpG-saarekkeen (Fig. 4A). Sen tutkimiseksi, onko miR-219-2-3p on epigeneettiseltä säännelty GC, MGC-803, HGC-27-soluja käsiteltiin demethyltransferase inhibiittorin, 5-atsa-2'-deoksisytidiini (5-atsa-CDR), ja histoni-deasetylaasin estäjä trikostatiini A (TSA). Sitten ekspressio miR-219-2-3p RT-PCR: llä analysoitiin (Fig. 4B). Tulokset osoittavat, että ilmentyminen miR-219-2-3p oli säädelty kahdessa tapauksessa: 5-atsa-CdR hoito, ilmaus miR-219-2-3p oli säädellään ylöspäin MGC-803 ( 5-atsa-CdR 1,5 umol /l; 2,14-kertainen) ja HGC-27 (5-atsa-CdR 0,5 umol /l; 3,07-kertainen) verrattuna DMSO hoidettuun kontrolliryhmään; 5-atsa-CdR ja TSA yhdistelmähoito, ilmaus miR-219-2-3p oli paljon suurempi MGC-803 (5-atsa-CdR 1,5 umol /l; 1,98-kertainen) ja HGC-27 (5 -Aza-CdR 1,5 umol /l; 1,28-kertainen) verrattuna TSA kontrolliryhmään. Nämä tulokset osoittivat, että epigeneettisellä tekijät voivat vaikuttaa miR-219-2-3p ilmaisun GC. Synergia demetylaatio ja histonideasetylaasi esto johti uudelleen ilmentymisen miR-219-2-3p GC. Edelleen havaita, onko miR-219-2-3p liittyi metyloinnin GC, tutkimme metylaatiostatuksen MIR-219-2-3p ylävirran alueen avulla metylaatiospesifinen PCR (MSP, Fig. 4C). 22 paria kudosten (primaarikasvainten ja niiden yhteensovitettujen viereisten normaali kudoksissa) 113 paria valittiin, mukaan lukien 11 potilasta, joilla oli alempi miR-219-2-3p tasot (alassäätöä ryhmä) ja 11 potilasta, joilla oli korkeampi miR-219 -2-3p tasot (ylössäätöä ryhmä). Huomasimme, että DNA: n metylaation ylä- alueilla miR-219-2-3p olemassa vierekkäisten normaaleissa kudoksissa ja syövän kudoksissa. Kuitenkin hypermetylaation suhde ylävirran alueelle miR-219-2-3p geenin alassäätöä ryhmässä oli 63,6% (7 11), joka oli suurempi kuin ylössäätöä ryhmä (36,3%, 4 11 ). Nämä tulokset viittaavat siihen, että metylaatio taso ylävirran CpG alueen miR-219-2-3p oli suurempi miR-219-2-3p alassäädetty ryhmässä kuin säädelty yksi.

yli-ilmentymän Mir-219-2-3p vaimentaa ERK1 /2 signalointireitille

aktivointi ERK1 /2 koulutusjakso on hyvin dokumentoitu eri kasvaintyypeissä, kuten GC [20], haimasyöpä [21] ja rintasyövän [ ,,,0],22]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että on tärkeää ERK1 /2 signalointireitille sääntelyssä maahanmuuton, invaasion ja etäpesäke syövän solulinjoista [23]. Sen tutkimiseksi, miR-219-2-3p vaikuttaa solujen toimintaa siten ERK1 /2-reitin, fosforylaatiota taso ERK1 /2 in MGC-803 ja HGC-27-soluissa tutkittiin jälkeen miR-219-2-3p yli-ilmentymisen. Cellular tasot p-ERK1 /2 merkittävästi vähentynyt miR-219-2-3p jäljittelee-transfektoidut solut verrattuna scramble transfektoidut tai käsittelemättömät solut. Kuitenkin mitään ilmeistä eroa ei havaittu yhteensä ERK1 /2 tasoa (Kuva. 5A). Nämä havainnot ehdottivat, että nopeutettu GC solujen kasvua saattaa olla osittain johtuu aktivoitu ERK1 /2 polkuja.

Bioinformatics lähestymistapa etsimään mahdollisia kohteita miR-219-2-3p

miRNA moduloida geeni ilmaisun vuorovaikutuksessa niiden tavoite mRNA: iden johtaa mRNA: n hajoamisen tai translaation tukahduttaminen. Jotta voitaisiin edelleen tutkia mekanismi miR-219-2-3p GC, me bioinformatically (TargetScan Release 5.2 ja miRDB) ja toiminnallisesti liitetty miR-219-2-3p GC, ja löysi geenit kohteena miR-219-2- 3p (taulukko S2). Niistä 371 ennustettu tavoitteita miR-219-2-3p, 31 heistä esitetään suuria mahdollisuuksia, koska ne ennustivat molemmat ohjelmat, kun taas toiset olivat vain ennusti yksi ohjelmista. Näiden 31-geenit, ErbB3, MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1, SOX4 todettiin olevan onkogeeni tai apoptoosiin liittyvien geenien edellisen julkaisua. (Fig. 5B ja 5C).

Keskustelu

Viime vuosina kertynyt näyttö on johtanut onkologit spekuloida, että unrevealed molekyyli tekijät, erityisesti ei-koodaavat RNA: t on aiemmin luokiteltu "roskaruokaa", toisto tärkeitä rooleja kasvainten synnyssä ja syövän etenemiseen. Riippuen niiden mRNA tavoitteista, miRNA voivat toimia tuumorisuppressoreilla tai promoottorit syövän synnyn. Kuitenkin mekanismit, jotka väärin säädellystä miRNA ei tutkittu laajasti, kuten poikkeava miRNA biogeneesiä ja transkriptio [24], [25], epigeneettiset muutos [26], [27], ja vahvistus tai tappio genomisten alueiden, jotka koodaavat miRNA [28] .

Kuten tässä raportissa, olemme analysoineet ilmentymisen miR-219-2-3p 113 GC potilailla ja totesi, että taso näyttää olevan pienempi GC. Vaikka miR-219-2-3p on raportoitu olevan läheistä sukua diabeettisen retinopatian [29] oligodendrosyytit [15], Alzheimerin tauti [30] ja glioblastooma [12], sen tehtävä GC on vielä määrittämättä. Lisäksi olemme osoittaneet, että uudelleen ilmentyminen miR-219-2-3p GC-soluissa johti induktion apoptoosin ja vähentää solujen elinkykyä. Nämä tulokset antoi meille mahdollisuuden spekuloida, että alas-säätely miR-219-2-3p voisi tarjota selviytymisen etu GC soluihin. Kuitenkin mekanismi vastuussa miR-219-2-3p alassäätöä GC on vielä tuntematon. Koska tappio 9q34.11, jossa miR-219-2-3p sijaitsee, on harvoin havaitaan GC [31], on epätodennäköistä, että alleelinen menetys on vastuussa sen alassäätöä. Toisaalta, huomasimme, että miR-219-2-3p oli selvästi sääteli kun GC soluja, MGC-803 ja HGC-27, hoidettiin sekä 5-atsa-CdR ja TSA. Lisäksi laskennallinen analyysi paljastaa, että miR-219-2-3p sijaitsee CpG-saarekkeen kromosomissa 9q34.11. Siten näyttää mahdolliselta, että DNA: n metylaation ja histonien deasetylaatiolla voi liittyä miR-219-2-3p sääntelyä. MSP, näytteet metylaatio taajuudet havaittu ylävirran alueelta miR-219-2-3p oli suurempi miR-219-2-3p alassäädetty ryhmässä kuin sääteli ryhmä. Tämä spesifisyys kalustettu hypoteesi suhde miR-219-2-3p ilmaisun ja DNA: n metylaatio. Kaiken kaikkiaan tulokset viittaavat siihen, että metylaatio oli tärkeä mekanismi miR-219-2-3p alassäätöä GC.

suorittaa ennustuksen TargetScan ja miRDB ohjelmia ja todennut, että 6 geenit voivat olla mahdollisia kohteita miR -219-2-3p. Niistä ehdokas tavoitteiden miR-219-2-3p, reseptori tyrosiinikinaasit ErbB3 (epidermaalisen kasvutekijän reseptori perhe) kiinnitti huomiomme. Korkea ErbB3 liittyy voimakkaasti syövän etenemiseen ja huonon ennusteen potilailla, joilla on GC [32] - [34] ja EGFR-estäjät gefitinibi voisi estää EGFR ja erbB2-aktivointi ErbB3. Samaan aikaan, ErbB3 ilmaisu toimii myös tehokkaana ennustaja herkkyys gefitinibille [35]. Tiedetään, että tukahdutettua ErbB3 transkriptio inhiboi signalointia kaskadeja alkaen ERK1 /2 reittejä [36]. Kuitenkin ennustettu kohdegeenien tulee vielä kokeellisesti vahvistaa. Lisäksi miRNA voi toimia mukaisesti kombinatorisista piirejä mallia, joissa yhden miRNA voi kohdistaa useisiin mRNA ja useat ekspressoidaan miRNA voi kohdistaa yksittäisen mRNA. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että biologinen käsite "yksi osuma-monipistemittaus" voitaisiin käyttää kliinisten terapeuttiset [37]. On todennäköistä, että tietty miRNA voi toimia kautta osuuskunnan säätely alaspäin monipistemittaus ja miRNA toiminto myös tukahduttamalla käännös niiden kohdegeenien. Tutkia täysi vaikutus on miRNA, genominlaajuisten proteomic tutkimuksia pitäisi tehdä.

Yhteenvetona meidän ilme ja toiminnallisia tutkimuksia ehdotti, että miR-219-2-3p oli ilmennetty eri metyloitumisella mekanismi ja oli kasvainten vaimennus toiminto säätelemällä ERK1 /2 liittyvien signaalien kulkureiteillä GC. Samaan aikaan alemman ilmaus miR-219-2-3p GC näytteiden korreloi korkeamman asteen ja myöhemmin. Palauttamalla ilmentyminen miR-219-2-3p GC soluissa tukahdutetaan solujen proliferaatiota, migraatiota, invaasio ja indusoi apoptoosin osoittivat, että miRNA-pohjainen theraputic kuvio voisi toimia perustana kehittää uusia mahdollisia hoitomuotoja mahasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteiden

mahalaukun kasvaimet ja niiden morfologisesti normaalien kudosten (sijaitsee > 3 cm: n päässä kasvain) saatiin marraskuun 2009 marraskuuta 2011 113 GC potilaalla, joille kirurgian syövän sairaalan kiina Academy of Medical Sciences (CICAMS, n = 21), kiinalainen PLA General Hospital (301 sairaala, n = 31), ja ensimmäinen Affiliated sairaala Shanxi Medical University (n = 61). Käyttö kudosnäytteiden kaikissa kokeissa oli hyväksynyt eettinen hallituksen instituutin Basic Medical Sciences, Kiinan Academy of Medical Sciences. Kaikki osallistujat, jos niiden sanallinen suostumus osallistumaan tähän tutkimukseen, ja niiden sanallinen ilmoittanut suostumuksensa kirjattiin. Tämä suostumus prosessi hyväksyi myös eettisen aluksella. Kudosnäytteet leikattiin kahteen osaan, yksi kiinnitettiin 10% formaliinilla histopatologista diagnoosia varten, ja toinen välittömästi snap-jäädytettiin nestetypessä ja säilytettiin -196 ° C: ssa nestemäisessä typessä, kunnes RNA. Tämä ryhmä koostui 95 urosta, 17 naarasta ja yksi ilman sukupuolitietoja iän mediaani 58 vuotta (vaihteluväli, 31-82 vuotta) .Formalin parafiiniin upotettuja kudosblokeista GC kerättiin Cancer sairaalan Kiinan Academy of Medical Sciences (CICAMS, n = 4) vuodesta 2009 vuoteen 2011. Koska yksilölliset erot potilaiden välillä, meillä ei ollut tietoa noin ennusteeseen viittaavia tietoja. Käyttö kudosnäytteiden kaikissa kokeissa oli hyväksynyt kaikki potilaat ja eettisen komitean toimielimen. Ominaisuudet potilaiden on kuvattu taulukossa 1.

Soluviljelmät ja transfektio

Yhteensä 4 ihmisen GC solulinjoissa MGC-803 (mucinous mahasyöpä, huonosti eriytetty), HGC-27 ( metastaattinen imusolmuke, erilaistumaton karsinooma), MKN-45 (sinettisormus karsinooma huonosti eriytetty), SGC-7901 (adenokarsinooma, kohtalaisen eriytetty) tutkittiin tässä tutkimuksessa. MGC-803 HGC-27, MKN-45, SGC-7901 solulinja hankittiin Cell Resource Center of Institute of Basic Medical Sciences, Kiinan Academy of Medical Sciences ja Pekingin unionin Medical College (Peking, Kiina). MGC-803 kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (Gibco, Invitrogen, Life Technologies, Saksa), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, PAA, Pasching, Itävalta) ja streptomysiiniä (100 ug /ml), penisilliiniä (100 U /ml). HGC-27, MKN-45, SGC-7901 pidettiin RPMI 1640-alustassa (PAA), johon oli lisätty 10% FBS: ää (PAA). Ihmisen GC solulinjat MGC-803, HGC-27 transfektoitiin miR-219-2-3p matkii ja negatiivinen kontrolli miRNA matkii (GenePharma, Shanghai, Kiina, taulukko S1) lopullisena pitoisuutena 10 nmol /l käyttäen Dharmafect 1 (Thermo Fisher, IL, USA) mukaisesti valmistajan ohjeiden.

TaqMan RT-PCR miRNA Expression

Yhteensä RNA eristettiin soluista ja kudoksista, joissa Trizol reagenssilla (Invitrogen, Calsbad , CA, USA). MiRNA kvantitoitiin reaaliaikaisella PCR: llä käyttäen TaqMan MicroRNA määritystä (Invitrogen, USA). Ensimmäisen juosteen komplementaarinen DNA (cDNA) synteesi suoritetaan 1 ug kokonais-RNA: ta 12 ul: n lopullisessa tilavuudessa, joka sisälsi 2 M varsi-silmukka-aluketta, 10 mM dNTP Mix (Invitrogen, USA). Sekoitus oli levy 65 ° C: ssa 5 minuutin ajan, ja sekoitettiin sitten 5 x RT-puskuria, 0,1 M DTT: tä, 200 U /ul MultiScribe käänteistranskriptaasia ja 40 U /ul RNaasi-inhibiittoria (Invitrogen, USA). Sekoitus oli levy 37 ° C: ssa 55 minuutin ajan, 70 ° C: ssa 15 minuutin ajan ja pidettiin sitten -20 ° C: ssa. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen standardia TaqMan PCR. 20 ui PCR reaktioita olivat 1 ui RT tuotteen, 1 x Universal TaqMan Master Mix ja 1 x TaqMan koetin /nalliseoksesta (Invitrogen, USA, taulukko S1). Kaikki RT reaktiot mukaan lukien ei-templaattikontrollien ajettiin kolmena kappaleena. Kaikki mRNA kvantifiointi data normalisoitiin U6. Suhteellinen määrä transkriptin laskettiin käyttäen vertailevaa Ct menetelmällä.

5-atsa-CDR: n ja Trichostatin Hoito solulinjoja

GC solulinjoja MGC-803 käsiteltiin 5-atsa 2'-deoksisytidiini (5-atsa-CdR; Sigma-Aldrich, USA) 0,7 mikromol /l, 1,5 umol /l, 3 umol /l ja HGC-27 käsiteltiin 5-atsa-CdR 0,5 mikromol /l, 1 umol /l, 1,5 umol /l 3 päivä tai 300 nmol /l trikostatiini A (TSA; Sigma-Aldrich, USA) 24 tunnin ajan. Sillä yhdistelmähoito, soluja käsiteltiin 5-atsa-CdR 48 tuntia ensin. Sitten TSA (300 nmol /l) lisättiin, ja soluja käsiteltiin vielä 24 tuntia. Sisältävä viljelyväliaine lääke vaihdettiin 24 tunnin välein. RNA solulinjoissa puhdistettiin TRIzol reagenssilla ohjeiden valmistajalta. cDNA-synteesi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu, ja 1 ml laimennettua cDNA: kukin näyte monistettiin RT-PCR: llä käyttäen protokollaa edellä kuvatulla tavalla.

DNA eristäminen ja bisulfiittimodifikaatio

Genominen DNA saatiin -196 ° C nestetypessä ensisijainen kasvaimia, ja niiden yhteensovitettujen viereisten normaaleissa kudoksissa (n = 22, ovat 11 potilaalla, jotka ilmentymistä miR-219-2-3p oli alassäädetty ja muut olivat sääteli) ja käytetyt Biomed DNA Kit (Biomed, Peking, Kiina) valmistajan mukaan ohjeita. Bisulfiittikäsittelyn ja talteenotto näytteitä suoritetaan Epitect bisulfiitin (Qiagen, Hilden, Saksa). Genomi-DNA: ta (2 ug) 20 ui: aan vettä käytettiin kussakin reaktiossa ja sekoitettiin 85 ul: bisulfiitti sekoitetaan ja 35 ui DNA: ta suojaavat puskuria. Bisulfiittikonversion suoritettiin termosyklerissä seuraavasti: 99 ° C 5 min, 60 ° C: ssa 25 min, 99 ° C: ssa 5 min, 60 ° C: ssa 85 minuutin ajan, 99 ° C: ssa 5 min, 60 ° C: ssa 175 min ja 20 ° C: ssa loputtomiin. Vetysulfiitilla käsiteltyä DNA otettiin talteen Epitect -fuugipylväässä ja myöhemmin sekvensoitiin vahvistamaan tehokkuuden bisulfiittikonversion.

metylointianalyysi

MSP käytettiin analysoimaan metylaation miR-219-2-3p ylävirran alue solulinjoissa ja kudoksissa. Methprimer käytettiin suunnittelemaan MSP pohjamaali (taulukko S1). MSP reaktiot uusista alukkeet optimoitu Metyloidut positiivinen kontrolli (M-DNA), joka käyttää ihmisen normaaleista perifeerisistä lymfosyyttien DNA käsitellä in vitro Sss I metyylitransferaasin (New England Biolabs, Beverly, MA). DNA: n kaksi normaalia ihmisen perifeerisillä lymfosyyteillä käytettiin normaalia ohjausta. Touchdown-PCR käsitti kaksi vaihetta: vaihe 1 sisälsi alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 45 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 30 s, pariutuminen muuttuja lämpötiloissa 30 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 40 s. Ensimmäisessä jaksossa, hehkutus lämpötila oli asetettu 58 ° C: seen, ja kussakin 10 Myöhemmillä sykleillä hehkutus lämpötila laski 0,6 ° C. Vaihe 2 koostui 35 sykliä 95 ° C 30 s, 52 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 40 s. MSP-tuotteet analysoitiin 3% polyakryyliamidigeeleillä.

Solujen proliferaatio, apoptoosin, ja solusyklin määritys

Soluja inkuboitiin 10% CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japani) laimennettuna normaaliin viljelyalustaa 37 ° C: ssa, kunnes värinäön muuntaminen tapahtui. Proliferaationopeudet määritettiin 0, 24, 48, 72, 96 tuntia transfektion jälkeen. Absorbanssi kunkin kuopan mitattiin mikrolevylukijalla asetettu 450 nM ja 630 nM. Kaikki kokeet suoritettiin neljänä rinnakkaisena. Apoptoosi-määritys suoritettiin MGC-803 ja HGC-27-solulinjojen 72 tuntia transfektion jälkeen käyttäen PE anneksiini V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) ja analysoitiin fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) . Solusyklianalyysiä suoritettiin MGC-803 ja HGC-27 solulinjojen 48 tunnin kuluttua transfektion miR-219-2-3p matkii ja ryntäily vastaavasti. Solut kerättiin, pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS: llä, kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolilla, ja inkuboitiin propidiumjodidilla (PI) ja RNaasi A, analysoitiin sitten FACS: lla. Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena.

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritykset

MGC-803 ja HGC-27-soluja kasvatettiin yhtenäisiksi 12-kuoppaisilla muovisilla levyillä ja käsiteltiin scramble tai miR-219 -2-3p jäljittelee. 24 tuntia transfektion jälkeen, lineaarinen tyhjästä haavoja (kolmena kappaleena) luotiin Konfluenttien yksisolukerrokset käyttäen 200 ui pipetin kärki. Poistaa solut solusyklin ennen haavan, soluja pidettiin seerumittomassa elatusaineessa. Visualisoida siirtyneet solut ja haavan paranemista, kuvat otettiin 0, 12, 24, 36, 48, 60 ja 72 h tunnin ajan. Yhteensä kymmenen alueet valittiin satunnaisesti kustakin kuopasta ja solut kolmessa kuoppiin kunkin ryhmän kvantifioitiin. Sillä invaasio määrityksiä, 24 tunnin kuluttua transfektiosta 1 x 10 ^{5 soluja seerumittomassa alustassa ympättiin Transvvell- muuttoliike kammiot (8 um huokoskoko, Millipore, Sveitsi), jotka oli päällystetty matrigeelin (Sigma-Aldrich; St Louis, MO, USA) ylempään kammioon. Väliaineessa, joka sisälsi 20% FBS: ää, lisättiin alempaan kammioon. 24 tunnin kuluttua ei-hyökkääviä solut poistettiin vanulla, invasiivisia soluja sijaitsee alapinnalla kammion värjättiin May-Grunwald-Giemsa tahra (Sigma Diagnostics, St. Louis, Missouri, USA) ja laskettiin käyttäen mikroskooppia (Olympus, Tokio, Japani). Kokeet itsenäisesti toistettiin kolme kertaa.}

Protein eristäminen ja Western blotting

Tällä ilmoitettu ajat, MGC-803-solut ja HGC-27-solut kerättiin jääkylmään PBS: llä ja hajotettiin jäällä kylmä valmistelu muutettu radioimmunosaostuksella puskuria täydennettynä proteaasinestäjien kanssa. Proteiinipitoisuus määritettiin BCA Protein Assay Kit (Bio-Rad, Milano, Italia) ja yhtä suuret määrät proteiineja analysoitiin SDS-PAGE: lla (10% akryyliamidi). Geelit elektroblotattiin nitroselluloosakalvoille (Millipore, Bedford, MA, USA). Blot-immuunimäärityksissä, membraanit blokattiin 2 tuntia 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1% Tween-20, ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yli yön primaarisen vasta-aineen. Havaitseminen suoritettiin peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita käyttäen tehostettua kemiluminesenssia järjestelmään. Ensisijainen vasta käytettiin: GAPDH alkaen Zhong-Shan Golden Bridge (Beijing, Kiina); ERK1 /2 (kanin anti-ERK1 /2, New England Biolab, NEB) ja fosfo-ERK1 /2 (kanin anti-fosfo-ERK1 /2, New England Biolab, NEB) B

Histologia
<

• PLoS ONE: korkea ilmentyminen Heat Shock Protein 90 liittyy kasvaimen aggressiivisuus ja huonon ennusteen potilailla, joilla Advanced Mahalaukun Cancer
• PLoS ONE: Noninvasiivinen visualisointi MicroRNA-16 Chemoresistance mahasyövän käyttäminen Dual Reporter Gene Imaging System