Финансирование:. Эта работа была поддержана грантами от провинции Чжэцзян фонд естественных наук Китая в X-QM (LY12H28005) и научного фонда Чжэцзян китайского медицинского университета в H-BW (2011ZY05). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка является одним из агрессивных злокачественных опухолей, хотя с развитием лучевой терапии, химиотерапии и биотерапии, тяжелые побочные эффекты неизбежны [1], поэтому, более эффективные противоопухолевые препараты с меньшим количеством побочных эффектов для лечения рака желудка необходимы.
<р> Lithospermum erythrorhizon является важным китайские травы. Он имеет некоторые активные компоненты: Deoxyshikonin, Isobutyrylshikonin, Acetylshikonin, Isovalerylshikonin, β, β-Dimethylaerylshikonin (рис. 1а) и шикониновых [2]. В традиционной китайской медицине, он обладает несколько биологических функций, в том числе антимикробного, противовоспалительного, противоопухолевого, иммунной регуляции и анти-ВИЧ свойства [3] - [6]. Эффект противоопухолевой шиконина и его производных впервые были доказаны их деятельности, направленной против роста опухоли в мышиной саркомы-180 [7]. Шиконин проявляет эффект не только путем уничтожения опухолевых клеток непосредственно, но также путем ингибирования ангиогенеза опухоли [8]. Исследования показали, что шикониновых апоптоз, индуцированный в человеческой злокачественной меланомы, рака мочевого пузыря, рак шейки матки, рак легкого и рак печени, и так далее [9] - [13]. Тем не менее, он имеет меньше побочных эффектов и более защитное действие на нормальные клетки человека [14], [15]. Хсу PC и др показали, что шиконин привело к апоптозом клеток через повышающей регуляции p27, p53, Bax и понижающей регуляции Bcl-2 и Bcl-XL при раке ободочной человека COLO 205 клеток [16]. Инвазия опухоли ингибируется шиконина в некоторых раковых клетках может через понижающую регуляцию NF-kB-опосредованной экспрессии ММР-9 [17]. Шиконин также индуцирует апоптоз через образование активных форм кислорода в гепатоцеллюлярной карциномы [12]. Singh F и др также обнаружили, что Шиконин снизился фосфорилированных уровни EGFR, ERK и Протеинтирозинкиназы и повышенные внутриклеточные уровни связанных с апоптозом белков, в результате чего плоскоклеточный клетки карциномы подвергаться апоптозу [18].
<Р> Последние данные показали, что β, β-dimethylacrylshikonin имели значительный противоопухолевый эффект на гепатоцеллюлярной карциномы путем активации каспазы-3 [19]. Однако такой эффект бета, бета-dimethylacrylshikonin на клеток рака желудка человека не сообщалось и молекулярные механизмы, которые до сих пор не до конца понятны. Таким образом, в настоящем исследовании мы рассмотрим влияние бета, бета-dimethylacrylshikonin на человеческие клетки рака желудка SGC-7901 и связанной с ним сигнализации, чтобы лучше понять механизм р, β-dimethylacrylshikonin на рак желудка.
материалы и реактивы
<р> SGC-7901 клетки были приобретены у Китайской академии наук сотовый банка коллекции типовых культур (Шанхай, Китай). β, β-Dimethylacrylshikonin был приобретен у Токио химической промышленности (Токио, Япония). МТТ и DAPI были приобретены у Calbiochem (Сан-Диего, штат Калифорния, США). U0126 был приобретен у Cell Signaling (Бостон, Массачусетс, США). ингибитор Pan-каспазы (Z-VAD-FMK) был приобретен у Beyotime института биотехнологии (Шанхай, Китай). Антитело для цитохрома с был приобретен у фирмы Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния, США). Антитела против ERK, фосфо-ERK, Bcl-2, Bcl-XL, XIAP, CIAP-2, survivn, Bax, Bak, расщепляется каспазы-9, расщепляется каспазы-3, расщепляется ППА и бета-актина были приобретены у Cell Signaling ( Бостон, штат Массачусетс, США). FITC-аннексина V Обнаружение Апоптоз Kit был приобретен у Becton Dickinson (San Diego, CA, США).
DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) окрашивания
SGC-7901 клетки были помещены в колодце шесть-луночного планшета с. После культивирования 24 ч клеток, их обрабатывали, Р-dimethylacrylshikonin в течение указанных периодов времени, затем клетки фиксировали в холодном ацетоне в течение 30 мин, и инкубировали с DAPI (1 мг /мл) в течение 30 мин. Апоптические ядра характеризоваться как интенсивно окрашивают были обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопии. (Модель IX71, Olympus, Токио, Япония)
аннексина V /PI анализы для апоптоза
Для аннексина V /PI анализы, клетки окрашивали AnnexinV-FITC и PI, и оценивали на апоптоз с помощью проточной цитометрии в соответствии с протоколом mannufacturer в (BD PharMingen, San Diego, CA, США). Вкратце, 1 × 10 5 клетки дважды промывали PBS и окрашивали 5 мкл AnnexinV-FITC и 5 мкл PI в 500 мкл буфера для связывания в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Апоптические клетки определяли с помощью BD FACS Diva программное обеспечение (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Аннексина V окрашивание служит мерой фосфатидилсерина экстернализации и клеток, которые являются аннексина V + /PI -. Представляют ранние апоптотических клеток Измерение митохондриального мембранного потенциала Данные, представленные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (SD) трех независимых экспериментов. Они были оценены с помощью однонаправленной дисперсионного анализа (ANOVA). Значительные различия были установлены при р &ЛТ;. 0,05 Результаты β, β-Dimethylacrylshikonin ингибирует жизнеспособность SGC-7901 клеток β, β-dimethylacrylshikonin индуцирует митохондриальной события, связанные с апоптозом в SGC-7901 клеток
<р> Клетки ( 5 × 10 5 клеток /мл) обрабатывали с использованием или без бета, β-dimethylacrylshikonin (10 мкмоль /л) в течение 24 ч и окрашивали JC-1 (BD MitoScreen JC-1 комплект, Becton Dickinson, USA) для 15 мин при 37 ° С. Митохондриальная мембранного потенциала была обнаружена методом проточной цитометрии (FACSCanto II, Becton Dickinson, США).
Western Bloting анализ
<р> Клетки обрабатывали с указанной концентрацией β, β dimethylacrylshikonin в течение указанного времени в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FCS. Клетки собирали в охлажденном льдом PBS, и экстракты клеток получали в RIPA буфере с ингибитором протеиназы коктейлем из Calbiochem (San Diego, CA). Концентрации белка клеточных лизатов были определены и кипятили с гель-загрузочного буфера в течение 10 мин при 100 ° С. Образцы, содержащие 30 мкг общего белка, подвергали электрофорезу на 10% SDS-полиакриламидном геле и переносили на PVDF мембрану (Millipore, Temecula, CA). После переноса мембрану блокировали в TBST (TBS, содержащем 0,1% Tween 20), содержащей 5% обезжиренным молоком в течение 2 ч, а затем инкубировали в течение ночи при 4 ° С с соответствующими первичными антителами. После трехкратной промывки в TBST, мембраны инкубировали в течение 2 ч при температуре 37 ° С с 1:5000 конъюгированного с пероксидазой хрена соответствующих вторичных антител. И, наконец, мембраны были визуализированы с помощью усовершенствованной системы обнаружения хемилюминесценции (Имун-Star WesternC Kit, Bio-Rad, США).
Иммунофлуоресценции окрашивание
<р> Immunofluorescene окрашивание использовали для анализа субклеточных распределения цитохром с в SGC-7901 клеток, индуцированных β, β dimethylacrylshikonin. Клетки культивировали на стерильные стеклянные coverlips фиксировали в холодном ацетоне в течение 10 мин. После того, как пермеабилизовали 0,3% Triton X-100 в течение 20 мин при комнатной температуре клетки были заблокированы в 3% бычьего сывороточного альбумина в течение 30 мин и инкубировали в течение ночи при 4 ° C с анти-цитохром с антителом (1:30). После промывки три раза в PBS, клетки SGC-7901 были помечены Alexa Fluor 488-конъюгированного вторичного антитела. DAPI впоследствии был добавлен для ядерного окрашивания. Микроскопический анализ проводили с использованием флуоресцентной микроскопии (модель IX71; Olympus, Токио, Япония).
Статистический анализ
<р> Для того, чтобы определить, цитотоксический эффект р, β-dimethylacrylshikonin на клеток рака желудка. СГК-7901 клетки обрабатывали 2,5, 5, 7,5, 10 мкмоль /л, Р-dimethylacrylshikonin в течение 24 ч и 48 ч, снижение жизнеспособности клеток, обработанных β, β dimethylacrylshikonin был 92,41 ± 6,06%, 76,49 ± 3,18%, 67,19 ± 1,82%, и 61,76 ± 0,18%, соответственно, на 24 ч по сравнению с обработанной наполнителем клеток (рис. 1, б). Для 48 ч лечения, жизнеспособность клеток была 52,03 ± 9,45%, 38,99 ± 1,43%, 30,70 ± 1,58%, и 27,4 ± 0,31% (фиг. 1В). Половина максимальной ингибирующей концентрации (IC <югу> 50) р, β-dimethylacrylshikonin для SGC-7901 клеток составляет 11,04 мкМ и 2,89 мкМ через 24 ч и 48 ч соответственно.
β, β-Dimethylacrylshikonin индуцирует SGC -7901 клетки апоптоз
<р> SGC-7901 клетки были сначала обработаны бета, бета-dimethylacrylshikonin, результаты показали, что клетки претерпели отмечены морфологические изменения при обработке 10 мкмоль /л, р-dimethylacrylshikonin по сравнению с необработанным контрольным образцом для 24 ч. При наличии р, β-dimethylacrylshikonin, СГК-7901 число клеток уменьшается, и клетки стали круглые и небольшие по форме, и отсоединение от плиты по сравнению с отрицательной контрольной группой (рис. 2А). β, β-dimethylacrylshikonin также индуцируется ядерной конденсации с интенсивным DAPI окрашивания по сравнению с ядерным контрольных SGC-7901 клеток в течение 24 ч (рис. 2В).
<р> Для того, чтобы определить, является ли цитотоксичность р, β-dimethylacrylshikonin участвует апоптоз мы оценивали апоптический эффект бета, бета-dimethylacrylshikonin в SGC-7901 клеток методом проточной цитометрии для аннексина V и пропидийиодидом (PI) окрашивание. Процент ранних апоптотических клеток (аннексина V + /PI -) составил 1,6%, 7,2%, 18,1%, 24,3% и 24,4% в ответ на транспортное средство, 2,5, 5, 7,5 и 10 мкмоль /л β, β-dimethylacrylshikonin соответственно в течение 24 ч (рис. 2в). Интересно отметить, что поздние апоптотических клеток (аннексина V + /PI +) были значительно увеличены в SGC-7901 клеток (29,7% с 7,5 мкмоль /л и 33,6% с 10 мкмоль /л р, β-dimethylacrylshikonin лечения ) (рис. 2С).
<р> Bcl-2 белки семейства включают проапоптотического белки (Bax, Bak и Организатор торгов) и анти-апоптотических белков (Bcl-2, Bcl-X L, CIAP-2, XIAP и сурвивина). Они могут активировать или ингибировать высвобождение вниз по течению факторов, приводящих к активации каспазы-3 и PARP в исполнении апоптоза [20]. В целях выявления связанных с апоптозом белки, проапоптотического белки (Bax, Bak) и анти-апоптотических белков (XIAP, CIAP-2, Bcl-2, Bcl-XL, сурвивин) были обнаружены с помощью Вестерн-блоттинга после SGC-7901 клетки обрабатывали различными концентрациями, р-dimethylacrylshikonin (0, 2,5, 5, 7,5 и 10 мкмоль /л) в течение 24 часов. Результаты показали, что β, β-dimethylacrylshikonin уменьшают экспрессию XIAP, CIAP-2, Bcl-2 (рис. 3А). Тем не менее, вниз регулирование XIAP и Bcl-2 были менее выражены, а вниз-регулирование CIAP-2 был весьма драматичными и зависит от дозы. Там не было никакого существенного изменения Bcl-XL и survivn в SGC-7901 клеток. Если р, β-dimethylacrylshikonin может модулировать экспрессию про-апоптотических белков (Bax, Bak) был также рассмотрен. Мы обнаружили, что β, β-dimethylacrylshikonin повышал экспрессию Bak в зависимости от дозы, но мало влияет на Вах (рис. 3б).
<Р> каспаз белки семейства являются критическими ферменты для выполнения апоптоза. Среди каспазы членов семьи, каспазы-3 является одним из ключевых палач для апоптоза в клетках млекопитающих [21]. Он может быть активирован через смерть рецептор-опосредованного внешнего каспазы-8 пути и митохондрии зависимой-каспазы-9 внутренний путь [22], [23]. Для того, чтобы в дальнейшем понять молекулярный механизм апоптоза, СГК-7901 клетки обрабатывали бета, бета-dimethylacrylshikonin и обнаруживается с помощью Вестерн-блоттинга для изменения экспрессии каспазы-3, каспазы-8 и каспазы-9, результаты показали дозозависимое повышение расщепленной каспазы-3, расщепляется каспазы-8 и расщепляется каспазы-9 в р, β-dimethylacrylshikonin обработанных клетках. ППА расщепление, другой хорошо известной характеристикой апоптоза, был также найден в р, β-dimethylacrylshikonin обработанных клеток (рис. 3в). Митохондриальной дисфункцией индуцированный апоптоз, который часто является следствием снижения митохондриального мембранного потенциала. Было показано, что играют ключевую роль в пути апоптоза. КЗВ-7901 клетки обрабатывали с использованием или без бета, β-dimethylacrylshikonin (10 мкмоль /л) в течение 24 ч, результаты показали, митохондрии мембранный потенциал был снижен с 98,6% до 56,9% после того, как β, β-dimethylacrylshikonin обрабатывали с SGC- 7901 клеток (рис. 3D). Далее мы исследовали распределение и внутриклеточную локализацию цитохрома с, чтобы найти, является ли митохондрии путь участвует в бета, β-dimethylacrylshikonin индуцированного апоптоза. После того, как СГК-7901 клетки обрабатывали р, β-dimethylacrylshikonin (10 мкмоль /л) в течение 24 ч, распределение цитохрома с визуализировали с помощью конфокальной лазерной микроскопии, то β, β-dimethylacrylshikonin обработанные клетки показали, затуманенное морфологии (рис. 3E) в отличие от явно видно появление в контрольных клетках, что свидетельствует о транслокацию цитохрома с из митохондрий в цитоплазму в р, β-dimethylacrylshikonin обработанных клеток.
<р> Для дальнейшего определения роли активации каспазы в β, β-dimethylacrylshikonin- индуцированного апоптоза, мы обрабатывали SGC-7901 клеток с ингибитором пан-каспазы Z-VAD-FMK (10 мкмоль /л) перед тем, Р-dimethylacrylshikonin лечения. Ингибитор пан-каспазы Z-VAD-FMK предварительной обработки уменьшил экспрессию расщепленной каспазы-3, расщепленной PARP и снижение бета, β-dimethylacrylshikonin-индуцированного апоптоза (рис 3F &Amp;. G). Эти данные показали, что митохондриальная-опосредованной каспазы каскад путь играет очень важную роль в р, β-dimethylacrylshikonin-индуцированного апоптоза.
β, β-Dimethylacrylshikonin индуцирует устойчивый активации ERK в SGC-7901 клеток
<р> было показано, что МАРК сигнализации участвует в ряде событий клеточных напряжений и стимулов, индуцированных апоптоз клеток [24], [25]. Поэтому мы исследовали активацию ERK, JNK и р38 после того, Р-dimethylacrylshikonin лечения. Как показано на рис. 4A &Amp; В, уровни фосфорилирования ERK и JNK, по-видимому увеличилось в ответ на β, β dimethylacrylshikonin обработки в течение 2 ч, а уровни фосфорилирования проявляли дозозависимо. Кроме того, уровни фосфорилирования ERK последние двадцать четыре часа. Тем не менее, не наблюдалось значимых изменений уровней фосфорилирования р38 после р, β-dimethylacrylshikonin лечения (рис. 4в). Эти результаты свидетельствуют о том, что устойчивое активация ERK участвует в бета, β-dimethylacrylshikonin-индуцированного апоптоза в SGC-7901 клеток.
Сигнализация ERK путь участвует в бета, β-dimethylacrylshikonin индуцированного апоптоза в SGC-7901 клетки
<р> затем мы исследовали, играет ли β, β-dimethylacrylshikonin-индуцированной устойчивой активации сигнального пути ERK роль апоптоза. Как показано на рис. 5A &Amp; B, Вестерн-блот-анализ показал, что U0126 (специфический ингибитор МЕК) ингибирует устойчивую активацию ERK и расщепление каспазы-3, ППА в, Р-dimethylacrylshikonin лечение в то время как ингибитор пан-каспазы Z-VAD-FMK не имел никакого эффекта на р, β-dimethylacrylshikonin-индуцированную активацию ERK (рис. 5D). Кроме того, U0126 уменьшается р, β-dimethylacrylshikonin-индуцированный апоптоз в SGC-7901 клеток (рис. 5в). Эти результаты показали, что β, β-dimethylacrylshikonin-индуцированный апоптоз в СГК-7901 клеток опосредованы устойчивой активации сигнального пути ERK.
Обсуждение
<р> производные Шиконин являются активные компоненты изолированы от китайский травяной Lithospermum erythrorhizon [5]. Эти соединения являются перспективными кандидатами наркотиков, как они, как сообщалось, есть несколько противоопухолевых эффектов в естественных условиях и в пробирке [5], [26]. Среди компонентов Lithospermum erythrorhizon, β, β-Dimethylaerylshikonin имеет важные эффекты противоопухолевых по сравнению с другими активными ингредиентами [27]. Что касается к противораковой активности, шиконин рендеренной апоптоз клеток посредством активации каспазы-зависимого пути был обнаружен во многих злокачественных опухолей. В данном исследовании мы исследовали влияние бета, бета-dimethylacrylshikonin на рак желудка SGC-7901-клеток человека. Наши результаты показали, что лечение СГК-7901 клеток с бета, β-dimethylacrylshikonin показали значительное цитотоксическое действие против SGC-7901 клеток в дозе и зависит от времени таким образом, и р, β-dimethylacrylshikonin индуцирует апоптоз в SGC-7901 клеток свидетельствует повышенный рано апоптотических клеток (аннексина V + /PI -). и в конце апоптотических клеток (аннексина V + /PI +)
<р> отношение анти- и проапоптотического экспрессии белка, такие как Bcl-2 /Bax, имеет решающее значение для индукции апоптоза, и он решает, восприимчивость клеток к апоптозу [28]. Митохондрии играют важную роль в передаче сигнала апоптоза [29]. Translocalization апоптотических белков из цитоплазмы в митохондрии приводит к высвобождению цитохрома с и второй митохондрии производных активатора каспаз уменьшением митохондриального мембранного потенциала [30], [31]. Шиконин сообщалось, индуцирует апоптоз через митохондрии пути в клетках HepG2 [32]. В настоящем исследовании мы показали, что β, β-dimethylacrylshikonin понижающей регуляции экспрессии XIAP, CIAP-2 и Bcl-2 и повышающей регуляции экспрессии Bak и Вах, и привело к потере митохондриального мембранного потенциала и выпуска цитохром с в SGC-7901 клеток, в соответствии с митохондриями зависимый апоптоз. Наблюдение р, β-dimethylacrylshikonin опосредованную активацию каспазы-9, каспазы-3, и последующее отщепление PARP, а также результат, что пан-каспазы ингибитор Z-VAD-ФМК уменьшается β, β-dimethylacrylshikonin-индуцированный апоптоз в SGC-7901 клеток, предполагая, что митохондриальный-опосредованной каспазы каскад путь играет ключевую роль в β, β-dimethylacrylshikonin-индуцированного апоптоза. Взятые вместе, наши результаты показали, что β, β-dimethylacrylshikonin регулирует уровни экспрессии связанных с апоптозом белков, вызывает цитохром с высвобождением и тригов каспазы-зависимую клеточную смерть апоптический.
<Р> митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК) регулируют разнообразно клеточные программы, включая эмбриогенеза, пролиферации, дифференцировки и апоптоза [33]. Белки семейства МАРК состоят из трех протеинкиназ: ERK1 /2 (внеклеточной регулируемой киназы 1 и 2), JNK (C-Jun N-концевой киназы) и р38 [34], [35]. В общем, транзиторная активация ERK приводит к пролиферации клеток, но устойчивая активация ERK является assoctiated с дифференциацией [36]. Возникающие данные свидетельствуют о том, что активация ERK способствует апоптозу. Jeong и др. показали, что кемпферол причиной раковых клеток к апоптозу через ERK-зависимого пути [21], [37], [38]. В последнее время, было сообщено, что icaritin вызывает торможение роста и апоптоз в человеческих PSMCs посредством сигнализации ЭРК пути [39]. Ли и др. показали, что активация RAF сигнализации /MEK /ERK путь играет важную роль в кальций-индуцированного апоптоза линзовых эпителиальных клеток [40]. Здесь мы также обнаружили, что устойчивая активация ERK участвует в р, β-dimethylacrylshikonin-индуцированного ингибирования роста и апоптоза в СГК-7901 клеток. U0126, специфический ингибитор МЕК (МАРК /ERK-киназы), эффективно блокировали β, β-dimethylacrylshikonin-индуцированной активации ERK и ослабленный β, β-dimethylacrylshikonin-индуцированный апоптоз, предлагая проапоптотического эффекты бета, бета-dimethylacrylshikonin в SGC-7901 клетки опосредовано устойчивой активации ERK1 сигнализации /2 пути.
<р> В заключение, мы обнаружили, что β, β-dimethylacrylshikonin ингибирует рост клеток и апоптоз, индуцированный в SGC-7901 клеток. Мы также изучали основные механизмы, участвующие в бета, β-dimethylacrylshikonin-индуцированного апоптоза. Наши результаты показали, что β, β-dimethylacrylshikonin-индуцированный апоптоз включает в уменьшении XIAP, CIAP-2 и экспрессии белка Bcl-2 и индукции экспрессии белков Bak и Bax, и привело к потере митохондриального мембранного потенциала и высвобождение цитохрома с в SGC-7901 клеток. Наши результаты также показали, что β, β-dimethylacrylshikonin индуцированный апоптоз включает в себя активацию каспазы-3, каспазы-8 и каспазы-9 и расщепление PARP. Кроме того, ЭРК сигнальный путь также участвовал в бета, β-dimethylacrylshikonin-индуцированного апоптоза. Наши результаты показали, что β, β-dimethylacrylshikonin могут быть разработаны в качестве потенциального противоракового средства против рака желудка человека.
Выражение признательности
<р> Мы хотели бы поблагодарить H-BW за их технической помощи, и мы также благодарим X -QM и J-HC за полезные замечания по этой статье.
Оральный секс может вызвать бактериальный вагиноз
Белковые мессенджеры из микробиома человека проливают свет на здоровье человека
Язвенный колит и отсутствие микробов в кишечнике
Женщины, рожденные с помощью кесарева сечения, имеют больший риск ожирения и диабета.
Бактериальные изменения кишечника влияют на результаты лечения волчанки во время беременности
Пробиотики могут помочь обуздать недоедание в течение следующих двух десятилетий.
Микробиом может помочь определить предраковый риск у женщин с ВПЧ
Новое исследование опубликовано в журнале открытого доступа PLOS Патогены в марте 2020 года сообщает о возможном использовании бактерий Гарднерелла обнаружен в шейке матки и влагалище женщин с инф
Добавление короткоцепочечных жирных кислот улучшает восстановление после инсульта,
исследование мышей показывает Добавление в организм короткоцепочечных жирных кислот может улучшить восстановление после инсульта, согласно исследованиям на мышах, недавно опубликованным в JNeurosci. Д
PENTAX Medical собирает 125 долларов,
000 для Всемирного фонда исследования рака в рамках кампании МИЛИ ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ ПЕНТАКС Медикал, ведущий поставщик решений для эндо-визуализации, празднует 100 th годовщина основания Asahi Optical Jo