PLoS ONE: β, β-Dimethylacrylshikonin Induziert Mitochondria abhängige Apoptose durch ERK Pathway in menschlichen Magenkrebs SGC-7901 Cells

Abstrakte

β, β-Dimethylacrylshikonin, einer der aktiven Komponenten in den Wurzelextrakten von Lithospermum erythrorhizon, besitzen Anti-Tumor-Aktivität. In dieser Studie haben wir über die molekularen Mechanismen der β, β-dimethylacrylshikonin in der Apoptose von SGC-7901-Zellen. β, β-Dimethylacrylshikonin verringerte die Lebensfähigkeit der Zellen von SGC-7901-Zellen in einer dosis- und zeitabhängigen Weise und induzierte Zell-Apoptose. β, β-Dimethylacrylshikonin Behandlung in SGC-7901-Zellen nach unten reguliert die Expression von XIAP, cIAP-2 und Bcl-2 und hochreguliert die Expression von Bak und Bax und verursacht den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials und der Freisetzung von Cytochrom c . Zusätzlich β, β-dimethylacrylshikonin Behandlung führte zur Aktivierung von Caspasen-9, 8 und 3, und die Spaltung von Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), die durch eine Vorbehandlung mit dem Pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMK abgeschafft . β, β-Dimethylacrylshikonin Phosphorylierung der extrazellulären Signal-regulierten Kinase (ERK) in SGC-7901-Zellen induziert. U0126 einen spezifischen MEK-Inhibitor, blockierte die ERK-Aktivierung durch β, β-dimethylacrylshikonin und außer Kraft gesetzt β, β-dimethylacrylshikonin -induzierte Apoptose. Unsere Ergebnisse zeigen, dass β, β-dimethylacrylshikonin gehemmt Wachstum von Magenkrebs SGC-7901-Zellen durch ERK-Signalweg induziert, und lieferte einen Hinweis für die präklinische und klinische Bewertung von β, β-dimethylacrylshikonin für Magenkrebs-Therapie.

Zitat: Shen XJ, Wang HB, Ma XQ, Chen JH (2012) β, β-Dimethylacrylshikonin induziert Mitochondria abhängige Apoptose durch ERK Pathway in menschlichen Magenkrebs SGC-7901-Zellen. PLoS ONE 7 (7): e41773. doi: 10.1371 /journal.pone.0041773

Editor: Salvatore V. Pizzo, der Duke University Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 1. März 2012; Akzeptiert: 25. Juni 2012 um; Veröffentlicht am: 27. Juli 2012

Copyright: © Shen et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus der Provinz Zhejiang Natural science Foundation of China X-QM (LY12H28005) und die Wissenschaft Gründung der Zhejiang Chinese Medical University H-BW (2011ZY05) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist eine der aggressive maligne Tumoren, wenn auch mit der Entwicklung von Strahlentherapie, Chemotherapie und biotherapy, die schweren Nebenwirkungen unumgänglich sind [1], daher wirksamer Antitumormittel mit weniger Nebenwirkungen für die Behandlung sind von Magenkrebs benötigt.

Lithospermum erythrorhizon ist eine wichtige chinesische Kräuter. Es hat einige aktive Komponenten: Deoxyshikonin, Isobutyrylshikonin, Acetylshikonin, Isovalerylshikonin, β, β-Dimethylaerylshikonin (Abb. 1A) und Shikonin [2]. In der traditionellen chinesischen Medizin, weist es mehrere biologische Funktionen, einschließlich antimikrobielle, entzündungshemmende, anti-Tumor-, Immunregulation und Anti-HIV-Eigenschaften [3] - [6]. Die Antitumorwirkung von Shikonin und seine Derivate wurden zuerst durch ihre Aktivitäten gegen Tumorwachstum in murinen Sarcoma-180 [7] erwiesen. Shikonin weist Wirkung nicht nur durch Tumorzellen direkt töten, aber auch durch Hemmung der Tumorangiogenese [8]. Studien zeigten, dass Shikonin induzierte Apoptose in menschlichen malignen Melanom, Blasenkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Lungenkrebs und Leberkrebs, und so weiter [9] - [13]. Sie hat jedoch weniger Nebenwirkungen und schützende Wirkung auf die menschliche normale Zellen [14], [15]. Hsu PC et al zeigten, daß Shikonin führte Apoptose durch Hochregulierung von p27, p53, Bax und Herabregulierung von Bcl-2 und Bcl-xL in humanen kolorektalen Karzinom COLO 205-Zellen [16] zu Zelle. Die Tumorinvasion durch Shikonin in einigen Krebszellen gehemmt kann durch die Herunterregulierung von NF-kappaB vermittelten MMP-9-Expression [17]. Shikonin induziert auch Apoptose über ROS-Produktion in hepatozellulären Karzinoms [12]. Singh et al F auch gefunden, dass phosphorylierte Shikonin Ebenen EGFR, ERK und Protein-Tyrosin-Kinasen und erhöhte intrazelluläre Niveaus der Apoptose-verwandten Proteinen verringert, was Epidermoid-Karzinomzellen verursachte Apoptose zu unterziehen, [18].

Neuere Erkenntnisse zeigten daß β, β-dimethylacrylshikonin hatten signifikante Antitumorwirkung auf hepatozellulären Karzinoms durch Caspase-3-Aktivierung [19]. Allerdings ist eine solche Wirkung von β, β-dimethylacrylshikonin auf menschliche Zellen Magenkrebs wurde nicht berichtet, und die molekularen Mechanismen, sind noch nicht gut verstanden. So wird in der vorliegenden Studie werden wir Wirkung von β, β-dimethylacrylshikonin auf die menschliche Magenkrebszelle SGC-7901 und die damit verbundenen Signal diskutieren, um besser den Mechanismus der β verstehen, β-dimethylacrylshikonin auf Magenkrebs.

Materialien und Methoden

Materialien und Reagenzien

SGC-7901-Zellen wurden von der chinesischen Akademie der Wissenschaften Cell Bank of Type Culture Collection (Shanghai, China) erworben. β, β-Dimethylacrylshikonin wurde von Tokyo Chemical Industry (Tokio, Japan) erworben. MTT und DAPI wurden von Calbiochem (San Diego, CA, USA) erworben. U0126 wurde von Cell Signaling (Boston, MA, USA) erworben. Pan-Caspase-Inhibitor (Z-VAD-FMK) wurde von Beyotime Institut für Biotechnologie (Shanghai, China) erworben. Antikörper für die Cytochrom-c wurde von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) erworben. Antikörper gegen ERK, Phospho-ERK, Bcl-2, Bcl-XL, XIAP, cIAP-2, survivn, Bax, Bak, gespalten Caspase-9, gespalten Caspase-3, gespalten PARP und β-Actin wurden von Cell Signaling gekauft ( Boston, MA, USA). FITC-Annexin V Apoptosis Detection Kit wurde von Becton Dickinson (San Diego, CA, USA) erworben.

Zellkultur und Zellproliferationstest

SGC-7901-Zellen in RPMI 1640-Medium kultiviert wurden, mit 10% fötales Rinderserum (Hyclone, UT), und bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _{2 gehalten. Dann in einer Schale mit 96 Vertiefungen bis zu einer Endkonzentration von Zellen wurden 5 ausgesät × 10 ^{3 Zellen /Vertiefung beimpft und in RPMI 1640-Medium, 10% FCS für 24 h enthält, danach wurden die Zellen mit der angegebenen Konzentration behandelt von β, β-dimethylacrylshikonin für 24 h und 48 h. Medium wurde entfernt, und frisches Medium wurde zusammen mit 20 ul MTT-Lösung (5 mg /ml) in jede Vertiefung gegeben. Nach 4 h Inkubation wurden 150 &mgr; l DMSO zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten wurden bei einer Wellenlänge von 570 nm unter Verwendung von Flash-Varioskan Multimode- Reader (Thermo Scientific, USA) abgelesen. Vier reduplicate Vertiefungen wurden für jede Behandlung verwendet, und die Experimente wurden dreimal wiederholt.}}

Morphologische Veränderungen

SGC-7901-Zellen in der Vertiefung einer Sechs-Well-Platte gegeben wurden. Nach 24 h Zellkultur, wurden sie mit β, β-dimethylacrylshikonin für die angegebenen Zeiträume behandelt. Die Zellmorphologie wurde unter Verwendung eines inversen Mikroskopie beobachtet. (Modell IX70, Olympus, Tokyo, Japan)

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) Anfärben

SGC-7901-Zellen wurden in die Vertiefung einer sechs-Well-Platte gelegt. Nach 24 h Zellkultur, wurden sie mit β, β-dimethylacrylshikonin für die angegebenen Zeiträume behandelt wurden dann Zellen für 30 min in kaltem Aceton fixiert und mit DAPI (1 mg /ml) für 30 min inkubiert. Die apoptotischen Kerne charakterisiert, wie intensiv gefärbt wurden unter Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. (Modell IX71, Olympus, Tokyo, Japan)

Annexin V /PI-Assays für Apoptose

Für Annexin V /PI-Assays Zellen nach dem Protokoll des mannufacturer (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) wurden mit AnnexinV-FITC und PI gefärbt, und die für die Apoptose durch Durchflusscytometrie untersucht. Kurz gesagt, 1 × 10 ^{5 Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit 5 ul AnnexinV-FITC und 5 ul PI in 500 &mgr; l Bindungspuffer für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln gefärbt. Die apoptotischen Zellen wurden unter Verwendung von BD FACS Diva Software (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) bestimmt. Annexin V-Färbung dient als Maß für Phosphatidylserin-Externalisierung und Zellen, die Annexin V + /PI -. Repräsentieren frühen apoptotischen Zellen}

Die Messung der mitochondrialen Membranpotentials

Die Zellen ( 5 x 10 ^{5 Zellen /ml) mit oder ohne β, β-dimethylacrylshikonin (10 &mgr; mol /l) für 24 h und gefärbt mit JC-1 (BD MitoScreen JC-1 Kit, Becton Dickinson, USA) behandelt wurden 15 min bei 37 ° C. Mitochondriale Membranpotential wurde durch Durchflusszytometrie (FACSCanto II, Becton Dickinson, USA) nachgewiesen.}

Western Bloting Analyse

Die Zellen wurden mit der angegebenen Konzentration von β, β-dimethylacrylshikonin für die angegebene Zeit behandelt in RPMI 1640 Medium mit 10% FCS. Die Zellen wurden in eiskaltem PBS, und die Zellextrakte wurden hergestellt, in RIPA-Puffer mit Protease-Inhibitor-Cocktail von Calbiochem (San Diego, CA) gesammelt. Die Proteinkonzentrationen der Zelllysate wurden mit Gel-Beladungspuffer für 10 min bei 100 ° C bestimmt und zum Sieden erhitzt. Proben von 30 &mgr; g Gesamtprotein enthielten, wurden auf 10% SDS-Polyacrylamid-Gelen und auf PVDF-Membran übertragen (Millipore, Temecula, CA) elektrophoretisch behandelt. Nach dem Transfer wurde die Membran in TBST blockiert (TBS 0,1% Tween 20 enthält), enthaltend 5% Magermilch für 2 h, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 4 ° C mit geeigneten primären Antikörper. Nach dreimaligem Waschen in TBST wurden die Membranen für 2 h bei 37 ° C mit 1:5000 Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem geeigneten sekundären Antikörpern inkubiert. Schließlich wurden die Membranen unter Verwendung des verstärkten Chemilumineszenz-Detektionssystem (Immun-Sterne WesternC Kit, Bio-Rad, USA) sichtbar gemacht.

Immunofluoreszenz-Färbung

Immunofluorescene Färbung wurde verwendet, um die subzelluläre Verteilung zu analysieren Cytochrom c in SGC-7901 von β, β-dimethylacrylshikonin induzierten Zellen. Zellen, die auf sterilen Glas coverlips wurden in kaltem Aceton für 10 Minuten fixiert. Nach permeabilisiert mit 0,3% Triton X-100 für 20 min bei Raumtemperatur wurden die Zellen für 30 min in 3% Rinderserumalbumin blockiert und über Nacht bei 4 ° C mit Anti-Cytochrom-c-Antikörper (1:30) inkubiert. Nach dem Waschen wurden dreimal in PBS, SGC-7901-Zellen mit Alexa Fluor 488-konjugiertem sekundärem Antikörper markiert. DAPI wurde anschließend für die Kernfärbung zugesetzt. Die mikroskopische Analyse wurde unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskopie (Modell IX71, Olympus, Tokyo, Japan) durchgeführt.

Die statistische Analyse

Die angezeigten Werte sind der Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von drei unabhängigen Experimenten. Sie wurden durch Einwegvarianzanalyse (ANOVA) bestimmt. Signifikante Unterschiede wurden bei p <etabliert;. 0,05

Ergebnisse |

β, β-Dimethylacrylshikonin hemmt Lebensfähigkeit von SGC-7901-Zellen

Um die zytotoxische Wirkung von β zu bestimmen, β-dimethylacrylshikonin auf die Magenkrebszellen. SGC-7901-Zellen wurden mit 2,5, behandelt, 5, 7,5, 10 &mgr; mol /L von β, β-dimethylacrylshikonin für 24 h und 48 h, die verringerte Lebensfähigkeit der behandelten Zellen mit β, β-dimethylacrylshikonin war 92,41 ± 6,06%, 76,49 ± 3,18%, 67,19 ± 1,82% und 61,76 ± 0,18% bzw. bei 24 h, verglichen mit den Vehikel-behandelten Zellen (Fig. 1B). Für die 48 h Behandlung wurde die Lebensfähigkeit der Zellen 52,03 ± 9,45%, 38,99 ± 1,43%, 30,70 ± 1,58% und 27,4 ± 0,31% (Abb. 1B). Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC _{50) aus β, β-dimethylacrylshikonin für SGC-7901-Zellen betrug 11,04 &mgr; M und 2,89 &mgr; M bei 24 h und 48 h jeweils.}

β, β-Dimethylacrylshikonin induziert SGC -7901 Zellen Apoptose

SGC-7901-Zellen zunächst mit β, β-dimethylacrylshikonin behandelt wurden, zeigten die Ergebnisse, die Zellen morphologische Veränderungen bei Behandlung mit 10 &mgr; mol /L β, β-dimethylacrylshikonin im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle gekennzeichnet unterzog für 24 h. In Gegenwart von β, β-dimethylacrylshikonin, SGC-7901-Zellzahl reduziert und die Zellen wurden rund und klein in der Form und von der Platte löst im Vergleich mit der negativen Kontrollgruppe (Abb. 2A). β, β-dimethylacrylshikonin auch Kernkondensation mit intensiver DAPI-Färbung im Vergleich zum Kern der Kontrolle SGC-7901-Zellen für 24 h (Abb. 2B).

Um zu bestimmen, ob Zytotoxizität von β, β-dimethylacrylshikonin beteiligt Apoptose induziert wir die apoptotische Wirkung von β, β-dimethylacrylshikonin in SGC-7901-Zellen durch Durchflusszytometrie für Annexin V und Propidiumiodid (PI) Färbung ausgewertet. Der Prozentsatz der frühen apoptotischen Zellen (Annexin V ^{+ /PI -) betrug 1,6%, 7,2%, 18,1%, 24,3% und 24,4% in Reaktion auf das Fahrzeug, 2,5, 5, 7,5 und 10 umol /L β, β-dimethylacrylshikonin jeweils für 24 h (Fig. 2C). Interessanterweise sind die späten apoptotischen Zellen (Annexin V + /PI +) wurden in SGC-7901-Zellen (29,7% mit 7,5 &mgr; mol /l und 33,6% mit 10 &mgr; mol /L β, β-dimethylacrylshikonin Behandlung signifikant erhöht () Abb. 2C).}

β, β-dimethylacrylshikonin mitochondriale Ereignisse induziert mit Apoptose assoziiert in SGC-7901-Zellen

Bcl-2-Familie Proteine ​​umfassen pro-apoptotische Proteine ​​(Bax, Bak und bid) und anti-apoptotische Proteine ​​(Bcl-2, Bcl-xL, cIAP-2, XIAP und Survivin). Sie können die Freisetzung von Downstream Faktoren aktivieren oder zu hemmen, die auf die Aktivierung von Caspase-3 führt und PARP bei der Ausführung von Apoptose [20]. Um die Apoptose-verwandten Proteinen, pro-apoptotische Proteine ​​(Bax, Bak) und anti-apoptotische Proteine ​​(XIAP, cIAP-2, Bcl-2, Bcl-xL, Survivin) wurden durch Western-Blotting nach dem SGC-7901 zu erfassen, erfasst Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von β, β-dimethylacrylshikonin behandelt (0, 2,5, 5, 7,5 und 10 &mgr; mol /l) für 24 h. Die Ergebnisse zeigen, dass β, β-dimethylacrylshikonin die Expression von XIAP, cIAP-2, Bcl-2 (Fig. 3A) zu verringern. Jedoch waren die Herabregulierung von XIAP und Bcl-2 weniger stark ausgeprägt, während die Herunterregulierung der cIAP-2 war ziemlich dramatisch und dosisabhängig. Es gab keine signifikanten Veränderungen von Bcl-xL und survivn in SGC-7901-Zellen. Ob β kann β-dimethylacrylshikonin modulieren die Expression von pro-apoptotischen Proteinen (Bax, Bak) wurde ebenfalls untersucht. Wir fanden, dass β, β-dimethylacrylshikonin die Expression von Bak in einer dosisabhängigen Weise erhöht hatte aber eine geringe Wirkung auf Bax (Fig. 3B).

Caspase-Familie-Proteine ​​sind wichtige Enzyme apoptosis auszuführen. Unter Caspase Familienmitglieder, Caspase-3 ist ein Schlüssel Henker für die Apoptose in Säugetierzellen [21]. Es kann durch den Tod Rezeptor-vermittelten extrinsische Caspase-8-Weg und die Mitochondrien abhängige-Caspase-9 intrinsischen Weg [22], [23] aktiviert werden. Um wurden die molekularen Mechanismen der Apoptose, SGC-7901-Zellen mit β, β-dimethylacrylshikonin und nachgewiesen durch Western-Blot-Analyse zur Expression Änderung von Caspase-3, Caspase-8 und Caspase-9 zeigten die Ergebnisse eine behandelte besser zu verstehen dosisabhängige Erhöhung von gespaltenem Caspase-3 gespalten Caspase-8 und Caspase-9 in β gespalten, β-dimethylacrylshikonin Zellen behandelt. PARP-Spaltung, eine weitere bekannte Charakteristik der Apoptose wurde auch in β, β-dimethylacrylshikonin behandelten Zellen (Fig. 3C) gefunden. Mitochondriale Dysfunktion induzierter Apoptose, die häufig die Folge einer Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials ist. Es wurde an den apoptotischen Weg zu sein zentralen gezeigt. Die SGC-7901-Zellen mit oder ohne β, β-dimethylacrylshikonin (10 &mgr; mol /l) für 24 h behandelt wurden, zeigten die Ergebnisse, Mitochondrien Membranpotential von 98,6% auf 56,9% verringert wurde nach dem β, β-dimethylacrylshikonin zum SGC- behandelt wurde 7901 Zellen (Fig. 3D). Als nächstes untersuchten wir die Verteilung und die subzelluläre Lokalisation von Cytochrom c zu finden, ob die Mitochondrien Stoffwechselweg in β, β-dimethylacrylshikonin induzierte Apoptose beteiligt ist. Nach SGC-7901-Zellen mit β, β-dimethylacrylshikonin (10 &mgr; mol /l) für 24 h behandelt wurden, wurde die Verteilung von Cytochrom c mit einem konfokalen Lasermikroskop sichtbar zeigten die β, β-dimethylacrylshikonin behandelten Zellen verschwommenes Morphologie (Fig. 3E) im Gegensatz zu dem offensichtlich klares Aussehen in den Kontrollzellen, welche die Translokation von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Zytoplasma in β, β-dimethylacrylshikonin Zellen behandelt.

weiter um die Rolle von Caspase-Aktivierung festzustellen, in β, β-dimethylacrylshikonin- induzierte Apoptose behandelten wir SGC-7901-Zellen mit pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMK (10 &mgr; mol /L) vor β, β-dimethylacrylshikonin Behandlung. Der Pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMK Vorbehandlung verringert die Expression von Caspase-3 gespalten, gespalten PARP und reduziert β, β-dimethylacrylshikonin-induzierte Apoptose (Abb 3F &. G). Diese Daten zeigten, dass die mitochondriale-vermittelte Caspase-Kaskade Weg eine sehr wichtige Rolle in β spielt, β-dimethylacrylshikonin-induzierte Apoptose.

β, β-Dimethylacrylshikonin induziert nachhaltige ERK-Aktivierung in SGC-7901-Zellen

Es wurde gezeigt, dass MAPK in mehreren Veranstaltungen von Zellspannungen und Stimuli-Zell-Apoptose [24] induziert beteiligt Signalisierung, [25]. Wir untersuchten daher die Aktivierung von ERK, JNK und p38 nach β, β-dimethylacrylshikonin Behandlung. Wie in gezeigt. 4A & B die Phosphorylierung von ERK und JNK wurden anscheinend für 2 h in Reaktion auf den β, β-dimethylacrylshikonin Behandlung erhöht und die Phosphorylierung zeigten eine dosisabhängige Weise. Außerdem sind die Phosphorylierung von ERK letzten vierundzwanzig Stunden. Jedoch wurden nach der β, β-dimethylacrylshikonin Behandlung (Fig. 4C) keine wesentlichen Änderungen der Phosphorylierung von p38 beobachtet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass nachhaltige Aktivierung des ERK beteiligt ist in β, β-dimethylacrylshikonin-induzierte Apoptose in SGC-7901-Zellen.

Die ERK-Signalweg ist in β, β-dimethylacrylshikonin induzierte Apoptose in SGC-7901 beteiligt Zellen

Wir untersuchten dann, ob der β, β-dimethylacrylshikonin-induzierte nachhaltige Aktivierung des ERK-Signalweg eine Rolle bei der Apoptose spielt. Wie in gezeigt. 5A & B, Western-Blot-Test ergab, dass U0126 (a spezifischen MEK-Inhibitor) gehemmt anhalt ERK-Aktivierung und Spaltung von Caspase-3, PARP in β, β-dimethylacrylshikonin Behandlung während der Pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMK keine Wirkung auf β hatte, β-dimethylacrylshikonin-induzierte Aktivierung von ERK (Fig. 5D). Darüber hinaus reduziert U0126 β, β-dimethylacrylshikonin-induzierte Apoptose in SGC-7901-Zellen (Fig. 5C). Diese Ergebnisse zeigten, dass β, β-dimethylacrylshikonin-induzierte Apoptose in SGC-7901-Zellen durch die anhaltende Aktivierung des ERK-Signalwegs vermittelt werden.

Diskussion

Shikonin-Derivate werden die aktiven Komponenten isoliert aus die chinesische Kräuter Lithospermum erythrorhizon [5]. Diese Verbindungen sind vielversprechende Arzneimittelkandidaten als sie mehrere Anti-Krebs-Wirkungen in vivo und in vitro [5], [26] haben berichtet. Unter den Komponenten von Lithospermum erythrorhizon, β, β-Dimethylaerylshikonin hat wichtige Antitumorwirkungen im Vergleich zu anderen Wirkstoffen [27]. In Bezug auf die Aktivität gegen Krebs, wurde Shikonin-rendered Zell-Apoptose durch Aktivierung von Caspase-abhängigen Weg in vielen malignen Tumoren gefunden. In dieser Studie untersuchten wir die Wirkung von β, β-dimethylacrylshikonin auf die menschliche Magenkrebs SGC-7901-Zellen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung von SGC-7901-Zellen mit β, β-dimethylacrylshikonin eine signifikante zytotoxische Wirkung gegen SGC-7901-Zellen in einer dosis- und zeitabhängigen Weise zeigte und β, β-dimethylacrylshikonin induzierte Apoptose in SGC-7901-Zellen wurde nachgewiesen durch eine erhöhte früh apoptotischen Zellen (Annexin V ^{+ /PI -). und späten apoptotischen Zellen (Annexin V + /PI +)}

Das Verhältnis von anti- und pro-apoptotische Protein-Expression, wie beispielsweise Bcl-2 /Bax, ist entscheidend für die Induktion der Apoptose, und er entscheidet, die Empfänglichkeit von Zellen Apoptose [28] zu unterziehen. Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion von Apoptose [29]. Die Translokalisation von apoptotischen Proteine ​​aus dem Cytosol in die Mitochondrien führt zur Freisetzung von Cytochrom c und der zweiten Mitochondrien stamm Aktivator von Caspasen durch eine Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials [30], [31]. Shikonin wurde Apoptose über Mitochondrien Stoffwechselweg in HepG2-Zellen zu induzieren berichtet [32]. In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass β, β-dimethylacrylshikonin nach unten reguliert die Expression von XIAP, cIAP-2 und Bcl-2 und hochreguliert die Expression von Bak und Bax, und verursacht den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials und der Freisetzung von Cytochrom c in SGC-7901-Zellen, die mit Mitochondrien abhängige Apoptose. Die Beobachtung von β, β-dimethylacrylshikonin vermittelte Aktivierung von Caspase-9, Caspase-3, und die anschließende Spaltung von PARP sowie das Ergebnis, dass der Pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMK reduziert β, β-dimethylacrylshikonin-induzierte Apoptose in SGC-7901-Zellen, was darauf hindeutet, dass die mitochondriale-vermittelte Caspase-Kaskade Signalweg spielt eine wichtige Rolle in β, β-dimethylacrylshikonin-induzierte Apoptose. Zusammengenommen zeigten unsere Ergebnisse, dass β, β-dimethylacrylshikonin reguliert Expression von Apoptose-verwandte Proteine ​​verursacht Freisetzung von Cytochrom c und trigs Caspase-abhängigen apoptotischen Zelltod.

Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPK) regulieren diverse zelluläre Programme einschließlich der Embryonalentwicklung, Proliferation, Differenzierung und Apoptose [33]. Die MAPK-Familie-Proteine ​​bestehen aus drei Proteinkinasen: ERK1 /2 (extrazelluläre Signal-regulierten Kinasen 1 und 2), JNK (c-Jun N-terminal kinase) und p38 [34], [35]. Im Allgemeinen führt transient ERK-Aktivierung zu Zellproliferation, aber anhaltende Aktivierung von ERK wird assoctiated mit Differenzierung [36]. Beweise Schwellen legt nahe, dass die Aktivierung von ERK zur Apoptose beiträgt. Jeong et al. zeigte, dass Apoptose durch eine ERK-abhängigen Weg [21], [37], [38] Kaempferol Krebszelle verursacht zu unterziehen. Vor kurzem wurde berichtet, dass icaritin Wachstumshemmung und Apoptose in menschlichen PSMCs über ERK-Signalweg induziert [39]. Li et al. gezeigt, dass Aktivierung von Raf /MEK /ERK-Signalweg eine kritische Rolle in Calcium-induzierte Apoptose von Linsenepithelzellen [40] spielt. Hier fanden wir auch, dass die anhaltende Aktivierung von ERK beteiligt ist in β, β-dimethylacrylshikonin-induzierte Wachstumshemmung und Apoptose in SGC-7901-Zellen. U0126, ein spezifischer Inhibitor von MEK (MAPK /ERK-Kinase), wirksam blockiert β, β-dimethylacrylshikonin induzierte ERK-Aktivierung und attenuierten β, β-dimethylacrylshikonin-induzierter Apoptose, was auf die pro-apoptotische Wirkung von β, β-dimethylacrylshikonin in SGC-7901-Zellen werden durch die verzögerte Aktivierung des ERK1 /2-Signalwegs vermittelt.

Zusammenfassend haben wir festgestellt, dass β, β-dimethylacrylshikonin Zellwachstum inhibiert, und Apoptose in SGC-7901-Zellen. Wir untersuchten auch die damit verbundenen zugrunde liegenden Mechanismen in β, β-dimethylacrylshikonin-induzierte Apoptose. Unsere Ergebnisse zeigen, dass β, β-dimethylacrylshikonin-induzierte Apoptose beinhaltet bei der Reduktion von XIAP, cIAP-2 und Bcl-2-Protein-Expression und Induktion von Bak und Bax-Protein-Expression, und verursacht den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials und der Freisetzung von Cytochrom c in SGC-7901-Zellen. Unsere Ergebnisse zeigten auch, daß β, β-dimethylacrylshikonin induzierte Apoptose die Aktivierung von Caspase-3 beinhaltet, Caspase-8 und Caspase-9 und die Spaltung von PARP. Außerdem nahmen ERK Signalweges auch in β, β-dimethylacrylshikonin-induzierte Apoptose. Unsere Ergebnisse zeigen, dass β, β-dimethylacrylshikonin als potenzielle Anti-Krebs-Mittel gegen menschliche Magenkrebs entwickelt werden könnte.

Acknowledgments

Wir würden für ihre technische Unterstützung H-BW danken und wir danken auch X -QM und J-HC für hilfreiche Kommentare zu diesem Artikel.

• PLoS ONE: Plasma microRNAs, miR-223, miR-21 und miR-218, als Novel potentielle Biomarker für Magenkrebs Erkennung
• PLoS ONE: Die Assoziation zwischen Einzel SNPs oder Haplotypen von Matrix Metalloproteinase 1 und Magenkrebs Suszeptibilität, Progression und Prognose