PLoS ONE: Идентификация сыворотки микроРНК в качестве новых неинвазивных биомаркеров для раннего выявления рака желудка

Абстрактный

Фон
<р> Для того, чтобы исследовать потенциал сыворотки микроРНК в качестве биомаркеров для раннего выявления рака желудка (GC), исследование на основе населения было проведено в Linqu, высокого риска площадь GC в Китае.

Методология /Основные выводы
<р> Все предметы были выбраны из двух больших когортных исследований. Дифференциальная микроРНК были обнаружены в сыворотке крови бассейнах GC и управления с использованием TaqMan массив низкой плотности, и подтверждено в индивидуальном из 82 пар GC и управления, а также 46 пар дисплазии и контроля со стороны реального времени количественная обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции. Временные тенденции идентифицированного экспрессии микроРНК в сыворотке крови были дополнительно изучены в ретроспективном исследовании на 58 пациентах GC, которые имели по крайней мере один предварительно ГХ образец диагностики сыворотки на основе долгосрочной последующей населения. Результаты профилирования микроРНК показали, что 16 микроРНК были значительно повышающей регуляции у больных ГЦ по сравнению с контрольной группой. Дальнейшая проверка выявила панель из трех сыворотки микроРНК (MIR-221, MIR-744 и микроРНК-376C) в качестве потенциальных биомаркеров для обнаружения GC и приемника операционных характеристик (ROC) анализ оценки риска кривой на основе показали, что эта группа могла бы отличить GCs от управления с 82,4% чувствительности и 58,8% специфичности. MIR-221 и микроРНК-376C продемонстрировал значительно положительную корреляцию с плохой дифференциации GC, и микроРНК-221 отображается более высокий уровень в дисплазии, чем в контроле. Кроме того, ретроспективное исследование показало тенденцию к увеличению этих трех уровней микроРНК в процессе разработки GC ( P
для тренда и ЛТ; 0,05), и эта группа могла бы классифицировать образцы сыворотки, собранные до 5 лет меньше, чем в клинической диагностике GC с 79.3 % общая точность.

Выводы /Значение
<р> Эти данные свидетельствуют о том, что сыворотка MIR-221, микроРНК-376C и микроРНК-744 имеют большой потенциал в качестве новых неинвазивных биомаркеров для раннего выявления GC.
<р> Цитирование: Сонгми, Пан Кф, Су Hj, Чжан L, Ма Jl, Ли Jy, и др. (2012) Определение сывороточного микроРНК в качестве новых неинвазивных биомаркеров для раннего выявления рака желудка. PLoS ONE 7 (3): e33608. DOI: 10.1371 /journal.pone.0033608
<р> Редактор: Джозеф Califano, Джона Хопкинса медицинской школы, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 15 ноября 2011 года; Принято: 13 февраля 2012 года; Опубликовано 14 марта 2012
<р> Copyright: © 2012 песни и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа была поддержана грантами от Национальной программы фундаментальных исследований Китая (+973 программы: 2010CB529303), A3 Форсайт программы из фонда естественных наук Китая (30921140311) и Национального фонда естественных наук Китая (81041012 и 81171989). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка (GC) является второй ведущей причиной смерти от рака в мире, причем почти половина происходит в Китае [1], [2]. Прогноз GC варьируется заметно стадией рака с относительной скоростью 5-летняя выживаемость достигает 90% в стадии I, но менее чем на 5% на стадии [3] IV. Таким образом, раннее обнаружение GC является ключевой мерой для снижения смертности и улучшить прогноз GC.
<Р> Хотя гастроскопической скрининг на GC отличается высокой надежностью, она является инвазивным и дорогостоящим, особенно для развивающихся стран. Поэтому много усилий было сделано для разработки менее дорогих предварительных скрининговых тестов в легко доступных образцов. Тем не менее, многие ранее исследованные аналиты, такие как пепсиногена (PG) I /II, соотношение, карциноэмбриональный антиген (СЕА) и антигена 19-9 (СА 19-9), не были чувствительны и достаточно специфичны для GC-сортировочные [3], [ ,,,0],4]. Таким образом, существует настоятельная потребность в новых неинвазивных биомаркеров для улучшения раннего выявления GC.

MicroRNAs (микроРНК) являются обильные класс малых некодирующих РНК, которые отрицательно регулируют экспрессию генов путем спаривания оснований с 3'-нетранслируемой области мРНК мишеней, что приводит к расщеплению мРНК либо или трансляционной репрессии [5], [6]. Растущие доказательства показали, что микроРНК участвуют в различных биологических процессах, в том числе развития, клеточной дифференцировки, пролиферации и апоптоза [7], а также участвовать в человеческом канцерогенеза в качестве онкогенов или супрессоров опухолей [8]. Исследования показали, что экспрессия микроРНК профиля варьируется в зависимости от типов опухолей и может дифференцировать рак и нормальные ткани [9], [10]. В последнее время циркулируют микроРНК были предложены большой потенциал в качестве биомаркеров для многих видов рака, в том числе GC [11] - [16]. Тем не менее, значение циркулирующих микроРНК в раннем выявлении GC не сообщалось еще.
<Р> С 1989 года мы провели ряд исследований в Линьцюй, зону высокого риска GC в провинции Шаньдун, Китай , в том числе населения на основе когортного исследования предраковых поражений желудка [17], [18], и рандомизированном исследовании ингибировать прогрессирование поражений желудка [19]. Эта когорта позволяет исследовать динамические изменения циркулирующих уровней микроРНК в процессе разработки GC, и предоставляет нам уникальную возможность исследовать потенциал циркулирующих микроРНК в ранней диагностике GC.
<Р> Здесь мы сообщаем о результатах дифференциала микроРНК в сыворотке ГХ и дисплазии (DYS) и ретроспективном исследовании, разработанном для оценки динамических изменений в процессе разработки GC.

Материалы и методы

дизайн исследования и население
<р> детали исследуемой популяции, процедуры эндоскопического обследования, критерии желудка гистопатологией и последующие были описаны в работах [17] - [19]. Вкратце, эндоскопическое обследование скрининг был начат в 1989 году среди 3399 жителей в возрасте 35-64 лет в Линьцюй, зону высокого риска GC, и пациентов без диагноза GC впоследствии последовали при повторном обследовании эндоскопической проведенного в 1994 году [17 ], [18]. В 1995 году, рандомизированное, плацебо-контролируемое исследование вмешательство не было начато в этой группе населения до 2003 года, когда повторная экспертиза была проведена эндоскопическая [19]. Все пациенты проходили забор крови в обоих исходных и конечных точек обследования каждого исследования, а некоторые с расширенными желудочных поражений, таких как кишечной метаплазии (IM) или DYS, а также при условии, кровь и получил эндоскопическое исследование в 1992 и 1999 годах
<р> в текущем исследовании, многоступенчатая, вложенными исследование случай-контроль из двух больших когорт был разработан для выявления и подтверждения дифференциальной сыворотки микроРНК в ГХ и DYS и ретроспективное исследование было проведено с целью изучения потенциала кандидата сыворотки микроРНК в ранней диагностике GC (Рисунок 1).
<р> Это исследование было разделено на четыре ступенчатых фазы. В фазе I, сывороточные бассейны из 14 пациентов GC и 14 возраста и пола из контрольной группы с диагнозом поверхностный гастрит (SG) или мягкий хронический атрофический гастрит (CAG) были использованы для создания профилей микроРНК при помощи анализа массива. Дифференциальная микроРНК были идентифицированы, и чрезвычайно активируемых микроРНК или умеренно активируемых микроРНК, имеющие функциональные или биомаркеров связанных отчетов были отобраны для дальнейшего анализа. В фазе II, идентифицированные микроРНК были проверены с использованием количественной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (QRT-PCR) на отдельных образцах сыворотки 14 ШС и управления, которые были использованы для испытания массива в фазе I. В фазе III, что значительно измененные микроРНК впоследствии были подтверждены в 68 GC и 46 Dys пациентов, а также их возраста и пола из контрольной группы. Приемник операционных характеристик анализа оценки риска (ROC) кривой на основе Затем был проведен среди 68 пар GC-управления для оценки дискриминационный эффект сыворотки микроРНК на GC. Каждый предмет был назначен в либо высокого или низкого риска групп путем сравнения уровней экспрессии микроРНК биомаркеров для соответствующих пороговых значений, полученных из кривой ROC. В фазе IV, ретроспективное исследование было проведено в 58-GC пациентов, которые представили по меньшей мере, один, имеющих право предварительного диагноза пробы сыворотки в долгосрочной последующее исследование, как описано выше, чтобы исследовать временную тенденцию потенциальных биомаркеров микроРНК и определить их значение в ранней диагностике GC. В целом исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом пекинской больницы и усилителя университета рака; Институт, и все субъекты дали письменное информированное согласие.

Обработка проб и РНК экстракция
<р> До 5 мл цельной крови из каждого поста участника собирали с случаями и контролем, подписанная в том же году. Образцы крови выдерживали в течение 30-40 мин и сыворотки разделения осуществляли путем центрифугирования при 965 г в течение 15 мин. Супернатант сыворотку извлекали и хранили при -80 ° С до анализа. РНК выделяли из 100 мкл сыворотки с использованием miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с протоколом производителя с незначительными изменениями [20]. Для профилирования микроРНК, два бассейна были созданы путем объединения смеси верхней водной фазы после разделения фаз и этанола из пациентов 14 GC (12 мужского, женского 2; возраст 62 (SD 6,4) лет) и 14 пола и возраста из контрольной группы (возраст 61 (SD 5,9) лет), соответственно. После связывания с мембраной RNeasy Mini ротационную колонку и последующей промывки, РНК элюировали 40 мкл РНКазы без воды. Для всех экспериментов QRT-ПЦР, РНК экстрагировали из 100 мкл сыворотки, элюировали 100 мкл РНКазы без воды. Для нормализации изменения образца к образцу на стадии выделения РНК, синтетический ATH-Mir-159a добавляли к каждой пробе сыворотки для микроРНК профилирования в то время как Cel-микроРНК-39 была добавлена ​​для анализа QRT-PCR, как описано Митчеллом и др аль
[11].

микроРНК профилирующие
<р> микроРНК профилирование осуществляли с использованием TaqMan массива низкой плотности A (v2.0) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем (Applied Biosystems, Foster City, Калифорния, США). Эта профилирование платформа QRT-PCR состоит из одного 384-луночного микрожидком карту, в которой 377 микроРНК могут быть проанализированы вместе с тремя эндогенного контроля (U6, RNU44 и RNU48) и одного отрицательного контроля, не связанным с человеческим (ATH-MIR-159A). Вкратце, РНК объединяли отдельно от 14 пациентов GC и контрольной группы, как описано выше, обратно транскрибируют с помощью обратной транскрипции набора TaqMan микроРНК и микроРНК TaqMan мультиплекс RT анализы (человеческий пул; Applied Biosystems). Для каждого пула РНК, 3 мкл тотальной РНК добавляли в каждую из мультиплексов обратных реакций транскрипции.
<Р> Чтобы увеличить количество кДНК, доступных для анализа, обогащение генов-мишеней проводили с шагом усилительные каскады. 25 мкл реакционной смеси состояла из 2,5 мкл неразбавленного кДНК в сочетании с 12,5 мкл TaqMan PREAMP Master Mix (2 ×), 2,5 мкл Megaplex PREAMP Грунтовки (10 ×) и 7,5 мкл нуклеазы без воды. Этап предусиление проводили на GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) в соответствии с протоколом производителя.

Для получения в режиме реального времени ПЦР-анализа, продукт разбавляют добавлением 75 мкл нуклеазы без воды и 9 мкл разбавленной смеси последовательно в сочетании с 450 мкл TaqMan 2 × Универсальный Master Mix ПЦР без урацила-N-гликозилаза и 441 мкл нуклеазы без воды. После загрузки 100 мкл каждого мультиплексного смеси бассейна, массив центрифугировали и запечатаны. Амплификацию проводили на Applied Biosystems 7900 HT термоциклеру (Applied Biosystems) с использованием рекомендованной заводом-изготовителем условий езды на велосипеде. Данные были проанализированы с помощью RQ Manager Software версии 1.2 и DataAssist ™ Software версии 2.0 (Applied Biosystems). После нормализации с использованием подскочили в ATH-MIR-159A, складка изменение уровней микроРНК в GC по сравнению с контролем рассчитывали методом.

микроРНК Количественное по реального времени QRT-PCR
<р> Обратную транскрипцию проводили с использованием обратной транскрипции набора TaqMan микроРНК и микроРНК-специфических праймеров стволовых цикла (Applied Biosystems). 7,5-мкл реакционной смеси состояла из 0,75 мкл 10 × обратной транскрипции буфера, 0,095 мкл ингибитора РНКазы (20 ед /мкл), 0,075 мкл 100 мМ дНТФ с дТТФ, 0,5 мкл MultiScribe обратной транскриптазы (50 единиц /мкл), 1,5 мкл праймера, 2,5 мкл РНК и 2,08 мкл РНКазы воды. Обратную транскрипцию проводили на Т профессиональной PCR System (Biometra, Германия) в соответствии с протоколом производителя.
<Р> ПЦР в реальном времени проводили в двух экземплярах и не включены в настоящее время не-шаблон отрицательного контроля. Для 20-мкл реакции, кДНК (3 мкл) смешивали с 10 мкл TaqMan 2 × Универсальный Master Mix ПЦР без урацила-N-гликозилаза 1 мкл анализируемой смеси TaqMan микроРНК и 6 мкл воды. Амплификацию проводили на 7500 в режиме реального времени система PCR (Applied Biosystems) в соответствии с протоколом производителя. Уровни экспрессии микроРНК были нормированы к игольчатым-в Cel-MIR-39, и были рассчитаны с использованием метода.

Статистический анализ
<р> в паре T
тест используется для изучения различий в среднем возрасте между группами. Испытание Вилкоксона или тест Манна-Уитни U был использован для сравнения уровней сывороточного микроРНК различных групп, где это необходимо. Кривые ROC были созданы, чтобы оценить диагностические эффекты микроРНК и обобщенная линейная модель с повторными измерениями использовали для анализа временных тенденций сывороточных уровней микроРНК в процессе разработки ГХ после логарифмического преобразования. Все значения P
были двусторонними и менее 0,05 считалось статистически значимым. Все статистические анализы проводились с использованием статистического пакета для социальных наук (SPSS 13.0, Чикаго, Иллинойс).

Результаты

Тематические характеристики
<р> В общей сложности 82 пациентов GC, 46 субъектов с DYS и 128 управления с SG или мягким CAG были включены в данное исследование. Как показано в таблице 1, не было никакой существенной разницы в возрасте между пациентами с ГХ или DYS и их соответствующих элементов управления ( P
= 0,329 и 0,214, соответственно).

микроРНК профилирование
<р> дифференцированно выраженные микроРНК были обнаружены в сыворотке крови бассейнах 14 ШС и 14 управления с использованием TaqMan массив низкой плотности. Среди 377 микроРНК проанализированных 99 показали > 2-кратным и 40 повышающей регуляции показали, &лт; 0,5 раза подавляются изменения в GC сыворотки пула (таблица S1). Шестнадцать активируемых микроРНК (MIR-221, MIR-744, микроРНК-376C, MIR-191, микроРНК-27а, пусть-7e, микроРНК-27b, MIR-222, MIR-21, микроРНК-18а, микроРНК-19а, зер- 17, микроРНК-106b, микроРНК-106а, микроРНК-20а и микроРНК-155) демонстрирует значительные изменения экспрессии в GC сыворотке и имеющие функциональные или дифференциальные отчеты экспрессии в GC ткани были выбраны в качестве кандидатов для проверки достоверности кулака стадии [21] - [28]

Первая стадия проверки
<р> выражения 16 кандидатов микроРНК были измерены в отдельных образцах сыворотки 14 ШС и управления, которые были использованы для тестирования массива.. Последовательно с профилирующих результатов, все 16 микроРНК показали более высокие уровни в сыворотке крови в группе GC, чем в контрольной группе (рис S1). Среди них 9 в сыворотке крови микроРНК (MIR-221, MIR-744, микроРНК-376C, MIR-191, микроРНК-27а, пусть-7e, микроРНК-27b, MIR-222, и MIR-21) имели > 2 средний раз изменение в GC группе по сравнению с контрольной группой ( P
&л; 0,05), и, таким образом, были выбраны для дальнейшей проверки

проверка на втором этапе
<р> Мы рассмотрели 9 микроРНК. выражения на большом наборе сыворотки из 68 пар GC и управления. Как показано на рисунке 2, 8 из 9 микроРНК (MIR-221, MIR-744, микроРНК-376C, MIR-191, микроРНК-27а, пусть-7e, микроРНК-27b и MIR-222) продемонстрировали значительно повышенные уровни в GC группе с более чем 2-кратное изменение ( P
&л; 0,05)., и эти микроРНК были выбраны для следующих анализов

оценка риска случаев GC с использованием панели микроРНК

для того, чтобы оценить дискриминационный эффект сыворотки микроРНК на GC, кривые ROC были установлены для каждого из 8 микроРНК с использованием 68 пар GC и контроля в проверке второго этапа (рисунок 3). Результаты показали, что микроРНК-744, микроРНК-376C, микроРНК-221, и пусть-7e принесли наибольшие площади под кривыми ROC (ППК) и могут иметь потенциал в качестве биомаркеров для обнаружения GC.
<Р> на основе оценки рисков на четырех микроРНК использовали, чтобы отличить образцы сыворотки случаев GC из контрольной группы. Для каждого микроРНК, мы в первую очередь рассчитывается оптимальный отсечения значение относительного уровня экспрессии (микроРНК-744: 5,49 × 10 ^{-4; микроРНК-376C: 6,05 × 10 -4; микроРНК-221: 1,47 × 10 -3, пусть-7e: 1,61 × 10 -3), при котором индекс в Youden в (чувствительность + специфичность 1) для постановки диагноза GC была самой большой на кривой ROC. Затем мы разделили предмет в группу высокого риска, представляющая возможный GC случай, когда уровень в сыворотке крови любого из четырех микроРНК была равна или больше соответствующего порогового значения, и группа с низким уровнем риска, представляющий контроль , когда сывороточные уровни всех четырех микроРНК были меньше пороговых значений.
<р> Согласно этому критерию оценки, 56 ШС и 32 управления были правильно предсказанных, как GC и не GC случаях, производя чувствительность на 82,4% и специфичность 47,1%. Так как LET-7e продемонстрировал наименьшее значение и широкий доверительный интервал AUC среди четырех микроРНК в анализе кривой ROC (рисунок 3), мы повторили выше оценку риска после исключения LET-7e и получил более высокую специфичность (40/68, 58,8 %), тогда как чувствительность осталась без изменений, что свидетельствует о том, что вклад LET-7E, чтобы дифференцировать GCs от управления было незначительным, а группа из трех микроРНК (MIR-221, микроРНК-376C и микроРНК-744) была более эффективной комбинацией биомаркеров для диагностики GC.
<р> для дальнейшего изучения потенциала этой панели для раннего обнаружения ГХ, мы оценили подгруппу 30 пациентов GC в ранней стадии, и 22 были правильно предсказаны случаев GC с чувствительностью 73,3% .}

Ассоциация между сывороточные микроРНК экспрессии и дифференциации сортов GC

Кроме того, мы стремились исследовать корреляцию между уровнями экспрессии микроРНК-221, микроРНК-744 и MIR-376C, а также классов дифференциации ГК. Как показано на рисунке 4A-C, все три микроРНК показали более высокие уровни в сыворотке крови в плохо дифференцированной GC группы (43 ШС в том числе 29 мужчин и 14 женщин; возраст, 60 (SD 8.3) лет), чем в хорошо или умеренно дифференцированной GC группы (24 ШС в том числе 19 мужчин и 5 самок; возраст, 60 (SD 6.2) лет). Среди них, в сыворотке крови микроРНК-221 и микроРНК-376C продемонстрировал значительно положительную корреляцию с плохой дифференциации GC ( P
= 0,006 и 0,004, соответственно).

Уровни экспрессии микроРНК в сыворотке крови биомаркеров у субъектов с DYS
<р> Для дальнейшего выяснения актуальности этих трех микроРНК с предраковые поражения желудка, мы исследовали их выражения в 46 пар DYS и контроля. Как показано на рисунке 4D-F, значительно повышен уровень микроРНК-221 был обнаружен в группе DYS по сравнению с контрольной группой ( P
= 0,027), в то время как никаких существенных различий не было найдено для MIR-376C или зер- 744. Дальнейший анализ оценки риска следуя ранее установленных процедур выяснилось, что эта группа из трех микроРНК может отличить DYS от контроля с чувствительностью 56,5% и специфичность 47,8%.

Динамические изменения в сыворотке крови биомаркеров микроРНК во время развития ГХ <бр>

в ретроспективном исследовании, динамические изменения трех сывороточных биомаркеров микроРНК были обнаружены на 58 пациентов GC, которые были разделены на четыре группы в зависимости от интервала времени от взятия крови до постановки диагноза GC: предварительно диагноз 2-5-летних , 6-9-го года, 10-14-летние и ≥15-летние группы (таблица 2). Некоторые предметы могут одновременно существовать в двух или более чем двух групп, поскольку они предоставили образцы сыворотки в различные моменты времени в период наблюдения.
<Р> Как показано на рисунке 5А, все три сыворотки микроРНК заметно отображается во время увеличения экспрессии GC развитие, за исключением незначительного увеличения сыворотки микроРНК-744 в предварительной диагностике ≥15 лет группе. Дальнейшее испытание тренда показали статистически значимый линейный тренд в трех уровней микроРНК среди 20 пациентов GC, которые внесли вклад трех образцов сыворотки в различные моменты времени в течение периода наблюдения (рис 5B).
<Р> Наконец, мы оценили потенциал из микроРНК биомаркеров для раннего прогнозирования GC у 29 пациентов, которые предоставили образцы сыворотки на 2-5 лет до постановки диагноза GC. В соответствии с критерием оценки риска, установленного ранее, 23 из 29 пациентов GC (79,3%) были правильно классифицированы как представленных случаев GC по этому три в сыворотке крови микроРНК панели.

Обсуждение
<р> Цель данного исследования заключалась в определении дифференциальной микроРНК в сыворотке ГХ и DYS, и исследовать потенциал сыворотки микроРНК в качестве биомаркеров для раннего выявления GC. Мы нашли значительно повышенные уровни сыворотки микроРНК-221, микроРНК-376C и MIR-744 у больных ГЦ путем систематического микрочипов на основе скрининга и подтверждения двухступенчатой. Это три сыворотки микроРНК панель может отличить ШС от контроля и показал тенденцию к росту во время развития ГХ. Насколько нам известно, это первое исследование, основанное на населении в изучении динамических изменений в сыворотке крови микроРНК, связанных с GC и его предшественников в зоне повышенного риска GC.
<Р> Частота GC колеблется в широких пределах по всему миру с самыми высокими показателями, происходящих в восточной Азии, в том числе Японии, Кореи и Китая [1], [2]. В Китае, большинство из ГКС диагностируется на поздних стадиях приводит к неблагоприятным прогнозом со средней скоростью 5-летняя выживаемость и ЛТ, 30%, в то время как в Японии и Корее более 60% ГКС диагностируется на ранней стадии по общинной эндоскопического скрининга с скорость 5-летняя выживаемость > 80% [29], [30]. Хотя влияние раннего обнаружения GC эндоскопическим скрининга является существенным в Linqu, там было лишь несколько популяционных скрининга для GC в Китае из-за высокой стоимости и отсутствия квалифицированных эндоскопистов.
<Р> GC является концом результат многоступенчатых желудка поражений с различными биологическими особенностями, что обеспечивает возможность обнаружения GC на ранней стадии с помощью биомаркеров. В нашем предыдущем исследовании, мы обнаружили, что соотношение сывороточного PG I /II монотонно уменьшалась с тяжестью поражений желудка, однако чувствительность и специфичность для прогнозирования передовых желудка поражений и GC были бедны [31]. В последнее время, накапливая свидетельства указывают на то, что микроРНК играют важную роль в онкогенеза, и полученные из опухоли микроРНК может войти в обращение в удивительно стабильной форме [11], [32], [33], предполагая, что микроРНК может быть использован как роман неинвазивным биомаркеры для раннего обнаружения GC.
<р> Совсем недавно, исследование выявило четыре активируемых GC-ассоциированной микроРНК (MIR-17-5p, MIR-21, микроРНК-106а и микроРНК-106b) [34], что также отображаются более высокие уровни экспрессии в GC сыворотке на нашем массиве, в то время как поразительный деактивация выпускаемой-7а в своем исследовании не наблюдалось нами. Другое исследование показало, пять повышенной сыворотки микроРНК (MIR-1, микроРНК-20а, микроРНК-27а, MIR-34 и микроРНК-423-5p) в GC больных [13], в то время как только микроРНК-20а и микроРНК-27а были повышающей регуляции на нашем массив, и микроРНК-27а была подтверждена, чтобы быть значительно избыточно экспрессируется у больных ГЦ. Частично противоречивые результаты могут отражать различия в типах образцов, скрининг инструментов или методов количественной оценки [35].
<Р> Среди трех микроРНК в сыворотке крови, выявленных в нашем исследовании, микроРНК-221 был обнаружен аномально активируемых в тканях многих рака типы, такие как желудка [24], ободочной и прямой кишки [21], простаты [36] и раком молочной железы [37]. MIR-221 может посттранскрипционно подавлять p27 и p57, способствуя тем самым /фазовый переход G1 S и усиление пролиферации клеток и рост опухоли [24], [36], [38], [39]. Исследования показали, что уровень экспрессии микроРНК-221 в плазме была связана с общей выживаемости колоректального рака [40] и прогрессированию рака предстательной железы [41]. Лишь в нескольких исследованиях исследовали функциональную значимость MIR-376C, такие как MIR-376C может усилить пролиферацию, выживание и химическую устойчивость яичников раковых клеток путем охвата ALK7 [42]. Для микроРНК-744, его паттерна экспрессии, физиологической функции и отношения с канцерогенеза неизвестны в настоящее время.
<Р> В нашем исследовании мы обнаружили это группа из трех микроРНК могли отличить образцы сыворотки от GC контроля с чувствительностью 82,4% и специфичность 58,8%. Кроме того, наше исследование показало, что среди 30 на ранней стадии больных GC, 22 (73,3%) были правильно классифицированы, предлагая эту панель может служить биомаркером для раннего обнаружения GC. Это также повышает вероятность того, что эта панель микроРНК может быть полезным в качестве предварительного метода скрининга для GC в общей популяции с высоким риском GC.
<Р> Мы также были заинтересованы в изучении связи между этими тремя микроРНК в сыворотке крови и дифференциации сорта GC. Сравнивая уровни микроРНК в сыворотке крови больных с ГЦ различных сортов, мы обнаружили более высокую экспрессию микроРНК в сыворотке крови слабо дифференцированной GC. Этот результат показал, что высокий уровень экспрессии этих микроРНК в сыворотке крови у больных GC была связана с продвинутой стадии ГХ. Хотя механизм этого явления остается неясным, высокий уровень этих микроРНК в сыворотке крови может иметь некоторое значение для указания выбора прогрессии и лечения GC.
<Р> Кроме того, мы оценили, может ли эта группа из трех микроРНК предсказывают современные язвы желудка поражений, таких как DYS. Мы нашли только микроРНК-221 проявил повышенный уровень экспрессии в DYS, предполагая, эта панель была более специфична для GC. Несмотря на ограниченный эффект этой панели на обнаружение DYS, микроРНК-221, один из трех сывороточных микроРНК, может быть полезным для определения тех Дыс предметов на чрезвычайно высокий риск развития GC. Интересно, что по перспективно отслеживания эволюции этих Dys субъектов, мы нашли более низкую частоту регрессии к менее тяжелых поражений и один инцидент GC в предсказанной группе высокого риска, которые имели более высокий уровень сывороточного MIR-221 (данные не показаны).
<р> по ретроспективно рассматривая экспрессию трех микроРНК в сыворотке крови в образцах предварительно диагностики пациентов GC, мы обнаружили тенденцию к увеличению в процессе развития GC, и дальнейший анализ показал, что эта панель может предсказать GC до 5 лет вперед клинической GC диагноз. Эти результаты решительно поддерживают значение этих трех микроРНК для прогнозирования возникновения GC. Комбинируя это три сыворотки микроРНК подписи с патологическим диагнозом может улучшить раннее выявление GC у пациентов с запущенными желудочных поражений, таких как IM и DYS.
<Р> Чтобы исключить возможность того, что увеличение возраста и короткий срок хранения образцов сыворотки способствовало повышению уровня микроРНК с течением времени, мы проанализировали экспрессию микроРНК в 82 контрольных, перенесших дро крови в то же моменты времени с пациентами GC. Не наблюдалось существенной разницы в течение периода наблюдения (данные не показаны), предполагая, что повышение уровня микроРНК в сыворотке крови на протяжении развития ГК не может быть связано с увеличением возраста и поддержки, что микроРНК присутствовали в сыворотке крови в стабильной форме. Соответственно, циркулирующие микроРНК может быть использовано в качестве биомаркера разработать неинвазивный тест для обнаружения GC в будущем из-за его легкой доступности, высокой стабильностью и низкой стоимости анализа.
<Р> Наше исследование имеет ряд сильных сторон. Во-первых, все субъекты происходил из популяции высокого риска ГХ и прошли строгий патологический диагноз, оправдывавшею нашу гипотезу о том, что наблюдаемое различие в уровнях сывороточных микроРНК между ШС и управления могут быть отнесены в основном, если не все, к неопластической трансформации. Во-вторых, наше население на основе исследования с высоким соблюдением и более чем 20 лет наблюдения повысило надежность исследования, и при условии, что первое свидетельство о динамических изменениях в сыворотке крови микроРНК во время развития ГХ, а также их потенциал в качестве биомаркеров для выявления с высокой степенью риска лиц ГК.
<р> Это исследование также имеет некоторые ограничения. Потому что очень немногие предметы были диагностированы с нормальной слизистой оболочки желудка в этой популяции [17], мы использовали предметы с SG /мягким CAG в качестве контрольной группы. Тем не менее, по сравнению с исследований с использованием в основном обычные предметы в качестве контроля, наша патологическая диагностика на основе стратегии выбора управления разводили несоответствие между случаями и контролем, и, таким образом, может привести лишь к занижению результатов. Кроме того, результаты этого предварительного исследования с небольшим размером выборки требуют дальнейшего подтверждения в больших перспективных исследованиях и функциональная значимость вновь выявленных миРНК нуждается в дальнейшем уточнении.
<Р> В заключение, в ходе данного исследования на основе населения мы определили ряд дифференциальных сыворотки микроРНК (MIR-221, микроРНК-376C и MIR-744) в GC и предложил свой потенциал в качестве новых неинвазивных биомаркеров для раннего выявления GC.

поддержка информация
Рисунок S1.
Уровни сыворотки из 16 отобранных микроРНК в 14 пар GC и группой контроля в проверке первой стадии. Медиана сложите изменения уровней микроРНК, сравнивающих GC с контролем были даны и тесты Вилкоксона были проведены, чтобы исследовать разницу между двумя группами. Относительные уровни микроРНК (log10 шкала по оси ординат) были нормализованы к зубчатым в Cel-MIR-39
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0033608.s001
(JPG)
Таблица S1.
DOI: 10.1371 /journal.pone.0033608.s002
(XLS)

• PLoS ONE: Молоко сбраживается Propionibacterium freudenreichii вызывает апоптоз HGT-1 рака желудка человека Cells
• PLoS ONE: генетической предрасположенности на CagA-взаимодействующими молекулами и генотипа и среды взаимодейств…