Ploche ONE: Identifikácia sérového mikroRNA ako nové neinvazívna biomarkery skoré detekciu žalúdočné Cancer

abstraktné

Pozadie

Ak chcete preskúmať potenciál v sére miRNA ako biomarkery na skorú detekciu žalúdočné rakovina (GC), populačná bola vykonaná v LINQ, vysoko rizikové oblasti GC v Číne.

Metodické /hlavných zistení

Všetky subjekty boli vybrané z dvoch veľkých štúdií kohorty , Rozdielové miRNA boli zistené v sére bazénoch GC a kontroly s využitím TaqMan poľa nízkou hustotou, a overený v jednotlivých z 82 párov GC a kontroly, a 46 párov dysplázia a riadenie v reálnom čase kvantitatívne reverznej transkripcie-polymerázovej reťazovej reakcie. The časové trendy of identifikovanej serum miRNA expression boli ďalej skúmané v retrospektívnej štúdii na 58 GC pacientok, ktoré mali aspoň naplnenú GC sample diagnosis serum vychádzajúci z dlhodobého-dlhodobé sledovanie populácie. Profilovanie Výsledky ukázali, že 16 miRNA miRNA boli Výrazne sa zvyšuje u pacientov s GC v porovnaní s kontrolami. Ďalej validácia identifikovali panel troch séra miRNA (MIR-221, mier-744 a mier-376c) ako potenciálnych biomarkerov pre detekciu GC a prijímačom prevádzkové charakteristická krivka-analýza založená na hodnotenie rizík (ROC) ukázala, že táto doska by mohla rozlíšiť GCS z kontrol s 82,4% senzitivitou a 58,8% špecifickosti. Mir-221 a mier-376c sa zistila významne pozitívnu koreláciu so zlou diferenciáciou GC a mier-221 zobrazí vyššiu úroveň v dysplázia než pod kontrolou. Okrem toho retrospektívna štúdia odhalila vzrastajúci trend týchto troch úrovní miRNA v priebehu vývoja GC ( P
k trendu menšie ako 0,05), a tohto panelu mohli kvalifikovať vzorkách séra odobratých do 5 rokov pred klinickú diagnózu GC s 79,3 % celková presnosť.

Závery /Význam

Tieto údaje naznačujú, že sérum mir-221, mier-376c a mier-744 majú silný potenciál ako nové neinvazívne biomarkery pre včasnú detekciu GC.

Citácia: Song My, Pan KF, Su Hj, Zhang L, Ma Ji, Li JY, et al. (2012) Identifikácia sérového mikroRNA ako nové neinvazívna biomarkery skoré detekciu rakoviny žalúdka. PLoS jeden 7 (3): e33608. doi: 10,1371 /journal.pone.0033608

Editor: Joseph Califano, John Hopkins Medical School, United States of America

prijatá: 15. novembra 2011; Prijaté: 13. februára 2012; Uverejnené: 14.března 2012

Copyright: © 2012 Song et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený dotácií z Národného programu výskumu Základné Číny (973 program: 2010CB529303), A3 Foresight program od Natural Science Foundation Číny (30921140311) a Národná prírodná Science Foundation Číny (81041012 a 81171989). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu vo svete, s takmer polovica vyskytujúce sa v Číne [1], [2]. Prognóza GC sa líši pozoruhodne od štádiu rakoviny s 5-ročné relatívnej prežitie a dosahuje 90% vo fáze I, ale menej ako 5% v stupni IV [3]. Tak, skorá detekcia GC je kľúčovým opatrením na zníženie úmrtnosti a zlepšiť prognózu GC.

Aj keď gastroskopicky skríning pre GC je vysoko spoľahlivý, to je invazívne a nákladné, najmä pre rozvojové krajiny. Z tohto dôvodu bolo dosiahnuté veľkého úsilia vyvinúť menej nákladné predbežné skríningové testy v ľahko prístupných vzoriek. Avšak, mnoho skôr skúmané stanovovanej látky, ako je napríklad pepsinogénu (PG) I /II pomer, karcinoembryonální antigén (CEA) a sacharidového antigénu 19-9 (CA 19-9), neboli dostatočne citlivý a špecifický pre GC skríningu [3], [ ,,,0],4]. Existuje teda naliehavá potreba nových neinvazívnych biomarkerov k zlepšeniu skorú detekciu GC.

mikroRNA (miRNA) sú hojné trieda malých nekódovacích RNA, ktoré negatívne regulujú expresiu génov pomocou párovanie báz s 3'-nepreložené oblasti cieľových mRNA, čo má za následok buď štiepenie mRNA, alebo transláciu [5], [6]. Pribúdajú dôkazy, ukázali, že miRNA sa zúčastňuje rôznych biologických procesov, vrátane vývoja, diferenciácie buniek, proliferácie a apoptózy [7], a podieľať sa na ľudskom karcinogenézy ako onkogény alebo nádorových supresor [8]. Štúdie ukázali, že miRNA profil expresie pohybuje medzi typmi nádorov a môžu diferencovať rakovinu a normálne tkanivá [9], [10]. V poslednej dobe boli cirkulujúcej miRNA boli navrhnuté veľký potenciál ako biomarkerov pre mnoho druhov rakoviny, vrátane GC [11] - [16]. Avšak hodnota cirkulujúcich miRNA včasného záchytu GC doteraz nebola hlásená.

Od roku 1989 sme vykonali množstvo štúdií v LINQ County, vysoko rizikové oblasti GC v provincii Šan-tung, Čína vrátane kohorty populačné štúdie z prekanceróznych žalúdočných lézií [17], [18], a randomizovanej štúdii inhibovať progresiu žalúdočných lézií [19]. Táto kohorta nám umožňuje skúmať dynamické zmeny v cirkulujúcich hladín miRNA počas vývoja GC, a poskytuje nám jedinečnú príležitosť preskúmať potenciál cirkulujúcich miRNA včasného záchytu GC.

Tu sme správu o výsledkoch diferenciálu miRNA v sére GC a dysplázia (DYS) a retrospektívnej štúdii, zameranej na vyhodnotenie dynamických zmien v priebehu vývoja GC.

materiáloch a metódach

štúdium dizajnu a obyvateľstvo

podrobnosti o študovanej populácii, postupy endoskopické vyšetrenie, kritériá žalúdočné histopathology a následná-up boli popísané inde [17] - [19]. Stručne povedané, endoskopická screening Prieskum sa začal v roku 1989 medzi 3399 obyvateľov vo veku 35-64 rokov rokmi v LINQ County, vysoko rizikové oblasti GC, a subjekty bez GC diagnózy boli následne nadviazala s opakovaným vyšetrením endoskopické vykonaného v roku 1994 [17 ], [18]. V roku 1995, randomizovanej, placebom kontrolovanej štúdie zásah sa začal v tejto populácii až do roku 2003, kedy bol opakovaný vyšetrenie endoskopická vykonané [19]. Všetky subjekty podstúpili krvný žrebovanie v oboch východiskových a koncových bodov prieskumov každej štúdie, a niektoré s pokročilými žalúdočných lézií, ako sú črevné metaplázia (IM) alebo DYS, a to aj za predpokladu, krv a dostali endoskopické vyšetrenie v roku 1992 a 1999.

v súčasnej štúdii, viacstupňový, vnorené case-control štúdie z dvoch veľkých kohorty bol navrhnutý tak, aby identifikovať a overiť rozdiel v sére miRNA v GC a dysfunkciami, a retrospektívna štúdia bola vykonaná za účelom zistenia potenciálnych kandidátske séra miRNA v skorej detekcie GC (obrázok 1).

Táto štúdia bola rozdelená do štyroch postupným fáz. Vo fáze I, sér zo 14 pacientov, GC a 14 rovnakého pohlavia a veku uzavreté ovládacie prvky s diagnózou superficiálna gastritídy (SG), alebo jemným chronickej atrofickej gastritídy (CAG) boli použité na vytvorenie miRNA profily analýzou poľa. Boli identifikované diferenciálnej miRNA a extrémne up-regulovaná miRNA alebo mierne stimulovaná miRNA, ktoré majú funkčné alebo biomarkerov spojených s správy boli vybrané pre ďalšiu analýzu. Vo fáze II, určená miRNA boli overené za použitia kvantitatívne reverznej transkripcie-polymerázovej reťazovej reakcie (QRT-PCR) na jednotlivých vzorkách séra 14 GC a kontrol, ktoré boli použité pre skúšku poľa vo fáze I. V prvej fáze III bola významne ovplyvnená miRNA boli následne overené v 68 GC a 46 DYS pacientov aj ich rovnakého pohlavia a veku uzavreté kontrol. Receiver operating charakteristika (ROC) krivky založené na analýze hodnotenia rizík Potom bola vykonaná medzi 68. GC kontroly párov vyhodnotiť diskriminačný účinok séra miRNA na GC. Každý subjekt bol pridelený do buď vysokým alebo s nízkym rizikom skupín porovnaním hladín expresie miRNA biomarkerov do príslušných limitných hodnôt odvodených z ROC krivky. Vo fáze IV, retrospektívna štúdia bola vykonaná u 58 pacientov GC, ktorí poskytli aspoň v jednom spôsobilom pre-diagnózu vzorka séra v dlhodobej follow-up štúdii, ako bolo popísané vyššie, aby preskúmala časovú trend potenciálnych miRNA biomarkerov a určiť ich hodnota v včasnú detekciu GC. Celá štúdia bola schválená Institutional Review Board of Cancer Peking University Hospital & Inštitút, a všetky predmety dal písomný informovaný súhlas.

spracovania vzorky a RNA extrakcia

Až 5 ml plnej krvi od každého účastníka nalačno bola odobratá prípadov a kontrol vykonaných v tom istom roku. Krvné vzorky boli ponechané stáť po dobu 30-40 min a séra oddeľovanie bola vykonaná centrifugáciou pri 965 g počas 15 min. Supernatant sérum bolo získané a uloží sa pri teplote -80 ° C až do analýzy. RNA bola izolovaná z 100 ul séra pomocou miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Nemecko) po protokolu výrobcu s drobnými zmenami [20]. Pre miRNA profilovanie, dva bazény boli vytvorené kombináciou zmesi hornom vodnej fáze po oddelení fáz a etanolu od pacientov 14 GC (12 samcov, dve samice, vek, 62 (SD 6,4) rokov) a 14 pohlavné a kontrol zodpovedajúceho veku (vek, 61 (SD 5,9) rokov), resp. Po väzbe na membráne RNeasy Mini spin kolóny a následnom premytí, RNA bola nevylúhujú s 40 ul vody bez RNázy. Pre všetky experimenty QRT-PCR, RNA extrahovaná z 100 ul séra bol eluovaný 100 ul RNázy voľnej vody. Normalizovať variantu vzorka-k-vzorky v izolácii RNA kroku, syntetické ath-MIR-159a bol pridaný do každej vzorky séra pre miRNA profilovanie pri ciel-MIR-39 bolo pridané do QRT-PCR analýzou, ako je opísané v Mitchell et al
[11].

Mirna profilovanie

Mirna profilovanie bola vykonaná s použitím TaqMan s nízkou hustotou poľa A (v2.0) podľa odporúčaného protokolu výrobcu (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Toto profilovanie platforma QRT-PCR sa skladá z jedného 384 jamkami s prúdovou mikroskopickú štruktúrou karty, ktorá môže byť 377 miRNA analyzované spolu s tromi endogénnych kontrol (U6, RNU44 a RNU48) a jeden negatívne kontroly, ktoré nesúvisia s ľudskou (ath-MIR-159a). Stručne povedané, RNA zlúčené oddelene od 14 pacientov, GC a uzavreté ovládacie prvky, ako je popísané vyššie, bola reverzne transkribovaných s použitím reverznej transkripcie kit TaqMan miRNA a TaqMan miRNA testy multiplexové RT (ľudský bazéna, Applied Biosystems). Pre každú RNA bazéna, 3 ul celkovej RNA bolo pridané do každej z multiplexných reakciách reverznej transkripcie.

Pre zvýšenie množstva cDNA k dispozícii pre analýzu, obohatenie cieľových génov bola vykonaná s predzosilňovača kroku. 25-ul reakčná zmes sa skladala z 2,5 ul neriedeného cDNA v kombinácii s 12,5 ul TaqMan predzosilňovač Master Mix (2 ×), 2,5 ul Megaplexu predzosilňovač Základný náter (10 x) a 7,5 ul bez nukleázy vody. Preamplification kroku bola vykonaná na GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) podľa protokolu výrobcu.

pre real-time PCR analýzy, produkt sa zriedi pridaním 75 ul vody bez nukleázy a 9 ul zriedenej zmesi sa následne spojí s 450 ul TaqMan Universal 2x PCR Master Mix bez uracil-N-glykosylázou a 441 ul vody bez nukleázy. Po načítaní 100 ul každého multiplexu bazén zmesi, pole sa odstredí a utesnené. Amplifikácia bola vykonaná na Applied Biosystems 7900 HT termocykléra (Applied Biosystems) za použitia odporúčanej Podmienky cyklovania výrobcu. Dáta boli analyzované pomocou RQ Manager Software verzie 1.2 a DataAssist ™ software verzia 2.0 (Applied Biosystems). Po normalizácii použitím špicatý-in ath-MIR-159a, prehyb zmena hladín miRNA v GC v porovnaní s kontrolou bola vypočítaná metódou.

Mirna kvantifikácie v reálnom čase QRT-PCR

reverznej transkripcie bola vykonaná s použitím reverznej transkripcie kit TaqMan miRNA a miRNA-špecifických kmeňových slučkou primerov (Applied Biosystems). 7,5-ul reakčná zmes obsahovala 0,75 ul 10 x Reverse-transkripčného pufra, 0,095 ul inhibítora RNázy (20 jednotiek /ul), 0,075 ul 100 mM dNTP s dTTP, 0,5 ul MultiScribe s reverznej transkriptázy (50 jednotiek /ul), 1,5 ul priméru, 2,5 ul RNA, a 2,08 ul RNázy bez vody. Reverzný transkripcie bola vykonaná na T profesionálnej PCR System (Biometre, Nemecko) podľa protokolu výrobcu.

Real-time PCR bola vykonávaná v duplikátu a zahŕňali ne-šablónu negatívne kontroly. Pre 20 ul reakcie, cDNA (3 ul) sa zmieša s 10 ul TaqMan Universal 2x PCR Master Mix bez uracil-N-glykosylázou, 1 ul na TaqMan miRNA testovanej zmesi, a 6 ul vody. Amplifikácia bola vykonaná na 7500 real-time PCR systému (Applied Biosystems) po protokolu výrobcu. Hladiny expresie miRNA boli normalizované na špicatý-in mobilné t-MIR-39, a boli vypočítané metódou.

Štatistická analýza

Párovanie t
test použitý na skúmanie rozdiel v priemernom veku medzi skupinami. Wilcoxonova testu alebo Mann-Whitney U test bol použitý pre porovnanie sérové ​​hladiny miRNA rôznych skupín, kde je to vhodné. ROC krivky boli založené na vyhodnotení diagnostické účinky miRNA, a bol použitý zovšeobecnený lineárny model s opakovanými meraniami na analýzu časovej trendy sérové ​​hladiny miRNA v priebehu vývoja GC po logaritmickej transformácii. Všetky P
hodnoty boli obojstranné a menej ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú. Všetky štatistické analýzy boli vykonané s použitím štatistického balíček pre sociálnych vied (SPSS 13,0, Chicago, IL).

Výsledky

Subject charakteristiky

Celkom 82 pacientov GC, 46 osôb s dysfunkciami a 128 kontrol s SG alebo jemným CAG boli zahrnuté v tejto štúdii. Ako je uvedené v tabuľke 1, nebol zistený žiadny významný rozdiel vo veku od pacientov s GC alebo dysfunkciami a ich zodpovedajúcich kontrol ( P
= 0,329 a 0,214, v danom poradí).

miRNA profilovanie

rozdielne vyjadrené miRNA boli zistené v sére kalužiach 14 GC a 14 kontrol s využitím TaqMan poľa nízku hustotu. Medzi 377 miRNA analyzovaných, 99 ukázal, zlúčenina, 2-násobne up-regulované a 40 ukázali, < 0,5-násobne downregulated zmeny v sére GC bazéne (tabuľka S1). Šestnásť stimulovaná miRNA (MIR-221, MIR-744, MIR-376c, MIR-191, MIR-27a, nechajte-7E, MIR-27b, MIR-222, MIR-21, MIR-18a, MIR-19a, spätných 17, mier-106b, MIR-106a, mier-20a a mier-155) preukázal významné expresie zmeny v GC sére a majú funkčné alebo rozdielna expresia správy v GC tkaniva boli vybrané ako kandidáti pre validáciu v päsť fáze [21] - [28]

Prvá etapa validácia

vyjadrenie 16 kandidátskych miRNA boli merané v jednotlivých vzorkách séra 14 GC a kontrol, ktoré boli použité pre skúšku pole .. V súlade s výsledkami profilovanie, všetkých 16 miRNA vykazovali vyššie hladiny u GC skupiny než u kontrolnej skupiny (Obrázok S1). Medzi nimi, 9 sérové ​​miRNA (MIR-221, MIR-744, MIR-376c, MIR-191, MIR-27a, nech-7e, MIR-27b, mier-222 a mier-21) mala zlúčenina, 2 priemernú násobne zmena GC skupine v porovnaní s kontrolnou skupinou ( P Hotel < 0,05), a preto bol vybraný pre ďalšiu validáciu

validácia Druhá fáza

skúmali sme 9 Mirna. výrazy na veľkom súbore séra z 68 párov GC a kontroly. Ako je znázornené na obrázku 2, 8 z 9 miRNA (MIR-221, MIR-744, MIR-376c, MIR-191, MIR-27a, nech-7e, mier-27b a mier-222) sa zistila významne zvýšené hladiny v GC skupiny s viac ako 2-násobné zmeny ( P Hotel < 0,05). tieto miRNA boli vybrané z týchto analýz a

hodnotenie rizika prípadov GC za použitia panelu miRNA

pre vyhodnotenie diskriminačný účinok séra miRNA na GC, ROC krivky boli stanovené pre každý z 8 miRNA za použitia 68 párov GC a kontroly v validácie v druhej fáze (obrázok 3). Výsledky odhalili, že mier-744, MIR-376c, mier-221 a nechajte-7e prinieslo najväčšie plochy pod krivkami ROC (AUC) a môže mať potenciál ako biomarkerov pre detekciu GC.

báze Hodnotenie rizika na štyri miRNA bol použitý na rozlíšenie vzoriek séra z prípadov GC od kontrol. Pri každej miRNA sme najprv vypočíta optimálnu hodnotu cut-off relatívnej úrovne expresie (MIR-744: 5,49 × 10 ^{-4; MIR-376c: 6,05 × 10 -4; MIR-221: 1,47 × 10 -3, nech 7E: 1,61 × 10 -3), u ktorého bola vykonaná Youdenových je index (citlivosť + špecifickosť-1) pre GC diagnózy bol najväčší u ROC krivkou. Potom sme rozdelili na subjekt v skupine s vysokým rizikom, ktoré predstavujú potenciálne GC prípad, keď hladina v sére niektorého zo štyroch miRNA bola rovná alebo väčšia ako zodpovedajúca hodnota cut-off, a skupina s nízkym rizikom, ktorá predstavuje ovládacie , kedy sérové ​​hladiny všetkých štyroch miRNA boli menšie ako hodnoty cut-off.}

v súlade s týmto kritériom na posúdenie, 56 a 32 GC kontroly boli správne predikovaných ako GC a non-GC prípadoch, produkovať citlivosť o 82,4% a špecifickosťou 47,1%. Vzhľadom k tomu, Let-7e demonštroval najmenšiu hodnotu a najširší interval spoľahlivosti AUC medzi štyrmi miRNA v analýze ROC krivky (obrázok 3), sme opakovali uvedené posúdenie rizika po vylúčení nechať 7E a získať vyššiu špecifickosti (40/68, 58,8 %), zatiaľ čo citlivosť zostala bez zmeny, čo znamená, že príspevok let-7e k rozlišovaniu GCS z kontrol bol zanedbateľný, a panel s troma miRNA (MIR-221, mier-376c a mier-744) bol účinnejší kombinácia biomarkerov GC diagnózu.

Ak chcete ďalej skúmať potenciál tohto panelu pre včasnú detekciu GC sme hodnotili podskupinu 30 pacientov GC v ranej fáze, a 22 boli správne predpovedal, ako GC prípadoch s citlivosťou 73,3% .

pridružení medzi séra miRNA expresie a diferenciácie stupňa GC

Okrem toho sme sa snažili preskúmať súvislosť medzi úrovňou expresie MIR-221, mier-744 a mier-376c, a stupňov diferenciácie GC. Ako je znázornené na obrázku 4A-C, všetky tri miRNA vykazovali vyššie hladiny u zle diferencované GC skupiny (43 GCS vrátane 29 samcov a 14 žien; veku, 60 (SD 8,3) rokov) ako v dobre alebo stredne diferencovaného GC skupiny (24 GC vrátane 19 mužských a 5 žien; veku, 60 (SD 6.2) rokov). Medzi nimi sérum Mir-221 a mier-376c sa zistila významne pozitívnu koreláciu so zlou diferenciáciou GC ( P
= 0,006 a 0,004, v uvedenom poradí).

Expresné hladiny v sére miRNA biomarkerov v predmetoch s dYS

Pre ďalšie objasnenie významu týchto troch miRNA s premalígnych lézií žalúdka, sme skúmali ich výrazy v 46 párov dys a kontroly. Ako je znázornené na obrázku 4D-F, bol nájdený významne zvýšená hladina MIR-221 v skupine DYS v porovnaní s kontrolami ( P
= 0,027), zatiaľ čo žiadny významný rozdiel bol zistený pre mier-376c alebo spätných 744. Ďalšie analýzy posúdenie rizík po vopred stanovených postupov bolo zistené, že tento panel s troma miRNA by mohla rozlíšiť dys od kontroly s citlivosťou 56,5% a špecifickosť 47,8%.

Dynamické zmeny v sére miRNA biomarkerov počas vývoja GC

V retrospektívnej štúdii, dynamické zmeny troch sére miRNA biomarkerov boli zistené u 58 pacientov GC, ktorí boli rozdelení do štyroch skupín podľa časovom intervale od odberu krvi do GC diagnózu: pre-diagnózu 2-5 roky , 6-9 rokov, 10 - 14-ročné a ≥15-ročné skupiny (tabuľka 2). Niektoré predmety môžu súčasne existovať v dvoch alebo viac ako dvoch skupín, pretože poskytuje vzorky séra v niekoľkých časových bodoch follow-up obdobia.

Ako je znázornené na obrázku 5A, všetky tri séra miRNA zobrazené zreteľne zvyšuje expresiu počas GC vývoj, s výnimkou mierneho zvýšenia sérového Mir-744 v pre-diagnózu ≥15 rokov skupiny. Ďalšie trend testu ukázali štatisticky významný lineárneho trendu v troch úrovniach miRNA medzi 20 pacientov GC, ktorí prispeli tri vzorky séra v rôznych časových bodoch v priebehu sledovaného obdobia (obrázok 5B).

Nakoniec sme zhodnotili potenciál Mirny biomarkerov pre včasné predvídanie GC na 29 pacientov, kto poskytoval vzorky séra at 2-5 years before GC diagnózy. Podľa kritéria pre hodnotenie rizík zriadený pred 23 z 29 GC pacientov (79,3%) bolo správne klasifikovaný ako zastúpených prípadoch GC podľa tohto trojročného séra miRNA panelu.

Diskusia

Cieľom tejto štúdie bolo zistiť rozdielové miRNA v sére GC a dysfunkciami, a preskúmať potenciál v sére miRNA ako biomarkeru pre včasnú detekciu GC. Zistili sme sa významne zvýšené hladiny séra MIR-221, mier-376c a MIR-744 u pacientov GC prostredníctvom systematického mikročipov na báze skríning a validáciu dvojstupňové. Tento troch-sérum miRNA panel mohol rozlíšiť GCS z kontrol a stúpala počas vývoja GC. Podľa našich najlepších vedomostí je to prvá štúdia populácie založenú na skúmanie dynamických zmien v sére miRNA spojené s GC a jeho prekurzorov v oblasti vysoko rizikové GC.

Výskyt GC sa výrazne líši po celom svete s najvyššou miera výskytu vo východnej Ázii, vrátane Japonska, Kórei a Číne [1], [2]. V Číne, väčšina z GC sú diagnostikované v pokročilom štádiu za následok zlou prognózou s priemerným 5-ročné prežitie < 30%, zatiaľ čo v Japonsku a Kórei viac než 60% GC je diagnostikovaná v ranom štádiu komunitnej endoskopickú screening s 5-ročné prežitie > 80% [29], [30]. Hoci vplyv včasnú detekciu GC endoskopického skríningu je významné LINQ, došlo len niekoľko populačný screening na báze GC v Číne kvôli vysokým nákladom a nedostatku kvalifikovaných endoscopists.

GC je koniec výsledkom viacstupňových žalúdočných lézií s rôznymi biologickými funkciami, ktoré poskytuje príležitosť pre detekciu GC v ranej fáze pomocou biomarkerov. V našej predchádzajúcej štúdii sme zistili, že pomer sérového PG I /II monotónne klesal so závažnosťou žalúdočných lézií, však citlivosť a špecifickosť pre predpovedanie pokročilých žalúdočné lézie a GC boli chudobné [31]. V poslednej dobe sa hromadia dôkazy, je uvedené, že miRNA zohrávajú dôležitú úlohu v onkogenézy a miRNA nádorovo derivovaný môže vstúpiť do krvného obehu v pozoruhodne stabilnej forme [11], [32], [33], čo naznačuje, že miRNA by mohli byť použité ako nové neinvazívna biomarkery na skorú detekciu GC.

V nedávnej štúdie identifikované štyri stimulovaná GC spojené s miRNA (mir-17-5p, mir-21, Mir-106a a mier-106b) [34], ktorý tiež zobrazí vyššej úrovne expresie v GC sére na našom poli, zatiaľ čo nápadný downregulace rokov-7a vo ​​svojej štúdii nebola pozorovaná u nás. Iná štúdia zistila, päť zvýšené sérové ​​miRNA (Mir-1, MIR-20a, MIR-27a, mier-34 a mier-423-5p) v GC pacientov [13], zatiaľ čo iba Mir-20a a mier-27a bola aktivovaná na našej polia, a mier-27a bolo potvrdené, ktoré majú byť výrazne nadmerne exprimovaný u pacientov s GC. Čiastočne rozporné výsledky môžu odrážať rozdiely v typov vzoriek, skríningové nástroje alebo metódy kvantifikácie [35].

Medzi tromi séra miRNA identifikovaných v našej štúdii, MIR-221 bolo zistené, abnormálne up-regulované v tkanivách mnohých rakoviny typu, ako je žalúdočná [24], [21] kolorektálny, prostaty [36] a rakoviny prsníka [37]. Mir-221 by post-transkripčný potláčajú P27 a P57, čo uľahčuje G1 /S fázový prechod a zvýšiť bunkovú proliferáciu a rast nádoru [24], [36], [38], [39]. Štúdie ukázali, že hladina expresie Mir-221 v plazme bola spojená s celkovým prežitím kolorektálneho karcinómu, [40] a progresii karcinómu prostaty [41]. niekoľko štúdií skúmalo iba funkčný význam MIR-376c, ako je MIR-376c by mohli zvýšiť proliferáciu, prežitie a chemorezistenci vaječníkov nádorové bunky zacielením ALK7 [42]. Pre mier-744, jeho výrazu vzor, ​​fyziologické funkcie a vzťah s karcinogenéze sú v súčasnej dobe známe.

V našej štúdii sme zistili, že tento panel s troma miRNA by mohla rozlíšiť vzorkách séra GC z kontrol s citlivosťou 82,4% a špecificita 58,8%. Navyše, naše štúdia ukázala, že u 30 pacientov v ranej fáze GC, 22 (73,3%) bolo správne klasifikovaný, čo naznačuje tento panel by mohlo slúžiť ako biomarker pre včasné odhalenie GC. To tiež zvyšuje pravdepodobnosť, že tento panel miRNA môžu byť užitočné ako predbežná skríningová metóda pre GC v bežnej populácii s vysokým rizikom GC.

Boli sme tiež záujem o skúmanie vzťahu medzi týmito tromi sére miRNA a diferenciáciu stupňa GC. Porovnaním hladín miRNA v sére pacientov GC s rôznymi stupňami, sme zistili vyšší sérum miRNA expresie v zle diferencované GC. Tento výsledok ukázal, že vysoká hladina expresie týchto sérových miRNA u pacientov s GC bola spojená s pokročilom štádiu GC. Hoci mechanizmus tohto javu nie je jasné, vysoká úroveň týchto miRNA v sére môže mať nejakú hodnotu pre uvedenie progresie a liečby výber GC.

Ďalej posúdiť, či tento panel s troma miRNA by mohla predpovedať pokročilé žalúdočné lézie, ako je napríklad dys. Zistili sme iba MIR-221 zobrazí zvýšenú hladinu expresie v dys, čo naznačuje, tento panel bol konkrétnejší pre GC. Aj napriek obmedzený účinok tohto panelu na detekciu DYS, mier-221, jeden z troch v sére miRNA, môžu byť užitočné pre identifikáciu tých dys predmetov na extrémne vysoké riziko vzniku GC. Zaujímavé je, že tým, perspektívne sleduje vývoj týchto DYS predmetov, sme zistili, že nižšiu rýchlosť regresie na menej závažné lézie a jeden prípad GC v predpovedanej vysoko rizikové skupiny, ktorí mali vyššie hladiny sérovej MIR-221 (dáta nie sú ukázaná).

podľa spätne skúmanie expresie troch séra miRNA vo vzorkách pre-diagnózu pacientov GC sme zistili, že stúpajúci trend počas vývoja GC, a ďalej analýza ukazuje, že tento panel by mohol predvídať GC do 5 rokov pred klinickým GC diagnóza. Tieto výsledky silne podporoval hodnotu týchto troch miRNA pre predikciu výskytu GC. Kombináciou tohto tri-sérum miRNA podpis s patologickou diagnózou môže zvýšiť skorú detekciu GC u jedincov s pokročilým žalúdočných lézií, ako sú IM a dysfunkciami.

Ak chcete vylúčiť možnosť, že pribúdajúcim vekom a kratšia doba uchovávania vzoriek séra prispelo k vyššej úrovni miRNA v priebehu času, sme analyzovali expresiu miRNA v 82 kontroly, ktorí sa podrobili odberu krvi v rovnakých časových bodoch s pacientmi GC. Žiadny významný rozdiel bol pozorovaný v priebehu sledovaného obdobia (dáta nie sú uvedené), čo naznačuje, že zvyšujúce sa hladiny sérového miRNA v celom vývoj GC nemožno pripísať zvýšenému veku a podporovať, že miRNA boli prítomné v sére v stabilnej forme. V súlade s tým, cirkulujúci miRNA by mohol byť použitý ako biomarker vyvinúť neinvazívne test pre detekciu GC v budúcnosti vzhľadom k jeho ľahkej dostupnosti, vysokou stabilitou a nízku cenu testu.

Naša štúdia má niekoľko silných stránok. Po prvé, všetky predmety pochádzajú z populácie vysoko rizikové GC a podstúpil prísnu nich stanovená diagnóza, čím je odôvodnené našu hypotézu, že pozorované rozdiely v sére miRNA medzi GC a kontroly možno pripísať hlavne, ak nie všetky, na nádorové transformácie. Po druhé, náš populačnej štúdie s vysokým dodržiavanie a viac než 20 rokoch sledovania zvyšuje spoľahlivosť štúdie, a za predpokladu, že prvé poznatky o dynamických zmenách v sére miRNA v priebehu vývoja GC, ako aj ich potenciál ako biomarkery na identifikáciu vysoko rizikových jedincov GC.

Táto štúdia má tiež určité obmedzenia. Vzhľadom k tomu, veľmi málo subjektov bolo diagnostikovaných s normálnou žalúdočnej sliznice u tejto skupiny [17], sme použili subjektov s miernou SG /CAG ako kontroly. Avšak v porovnaní s štúdií používajúcich všeobecne normálnych subjektov ako kontrola, naša patologická voľba stratégie riadenia diagnóza založená na zriedený nepomer medzi prípadov a kontrol, a tak mohol spôsobiť iba podhodnotení výsledkov. Okrem toho zistenia tejto predbežnej štúdii s malou veľkosťou vzorky vyžadovať ďalšie potvrdenie vo veľkých prospektívnych štúdií a funkčný význam novo identifikovaných miRNA je potrebné ďalej objasniť.

Na záver prostredníctvom tejto populačnej štúdie sme identifikovali rad diferenciálnych séra miRNA (MIR-221, mier-376c a MIR-744) v GC a navrhla ich potenciál ako nové neinvazívne biomarkery pre včasnú detekciu GC.

Podporné informácie
obrázok S1. Hladiny
sére 16 vybraných miRNA v 14 párov GC a kontrol vo validácie prvého stupňa. Medián zložiť zmeny hladín miRNA porovnaní GC s kontrolou boli uvedené a skúšky boli vykonané Wilcoxonovy skúmať rozdiel medzi dvoma skupinami. Relatívna hladina miRNA (log10 stupnice na osi Y) boli normalizované na vychýlila-in CEL-Mir-39
doi :. 10,1371 /journal.pone.0033608.s001
(JPG)
Tabuľka S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0033608.s002
(XLS)

• Ploche ONE: kyslé mlieko podľa Propionibacterium freudenreichii indukuje apoptózu u HGT-1 rakovina žalúdka ľudských buniek
• Ploche ONE: genetická náchylnosť na ČAGA-interagujúcich molekúl a medzi génmi a prostredím Interakcia s fytoestrogény: domnelý rizikový faktor pre vznik rakoviny žalúdka