Plos ONE: Identifikacija Serum MicroRNAs kot Novel neinvazivna bioloških označevalcev za zgodnje odkrivanje želodčnega raka

Povzetek

Ozadje

Da bi raziskali možnosti serumu miRNAs kot bioloških označevalcev za zgodnje odkrivanje raka želodca (GC), je bila študija, ki temelji na prebivalstvo poteka v Linqu, z visokim tveganjem območje GC na Kitajskem.

Metodologija /Glavne ugotovitve

Vsi predmeti so bili izbrani iz dveh velikih študij kohorte. Diferencialne miRNAs so bile ugotovljene v serumu bazenih GC in nadzor s pomočjo TaqMan paleto nizke gostote, in potrjena v posameznih od 82 parov GC in nadzora, in 46 parov displazije in nadzora, ki jih v realnem času kvantitativno reverzno transkripcijo-verižne reakcije s polimerazo. Časovni trendi ugotovljene serum miRNA izražanja so nadalje raziskati v retrospektivni študiji 58 bolnikov, GC, ki so imeli vsaj eno predhodno GC diagnoza serumu vzorec, ki temelji na dolgoročni spremljanja populacije. Mirne profiliranje rezultati pokazali, da je 16 miRNAs izrazito povečana pri bolnikih GC v primerjavi s kontrolno skupino. Nadaljnje potrjevanje ugotovila ploščo treh serumskih miRNAs (MIR-221, MIR-744, in miR-376c) kot potencialnih biomarkerjev za odkrivanje GC, in sprejemnik, ki delujejo lastnost (ROC) analizo ocene tveganja, ki temelji na krivulja je pokazala, da bi ta plošča razlikovati GCS iz nadzora s 82,4% občutljivost in 58,8% specifičnost. MIR-221 in miR-376c je pokazala močno pozitivno korelacijo s slabim diferenciacijo GC in miR-221 prikaže višjo raven v displazije kot pri kontroli. Poleg tega je retrospektivna študija je pokazala trend naraščanja teh treh ravneh miRNA pri razvoju GC ( P
za trend < 0,05), in te plošče lahko vzorce seruma do 5 let pred klinično GC diagnozo z 79,3 razvrstitev % na splošno natančnost.

Sklepi /Pomen

Ti podatki kažejo, da serum MIR-221, miR-376c in miR-744 ima velik potencial kot novih neinvazivnih bioloških označevalcev za zgodnje odkrivanje GC.

Navedba: Pesem My, Pan Kf, Su Hj, Zhang L, Ma Jl, Li Jy, et al. (2012) Identifikacija Serum MicroRNAs kot nova neinvazivna bioloških označevalcev za zgodnje odkrivanje želodca raka. PLoS ONE 7 (3): e33608. doi: 10,1371 /journal.pone.0033608

Urednik: Joseph Califano, John Hopkins Medical School, Združene države Amerike

Prejeto: 15. november 2011; Sprejeto: 13. februar 2012; Objavljeno: 14. marec 2012

Copyright: © 2012 Song et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprta s sredstvi iz državnega Temeljni raziskovalni program Kitajske (973 Program: 2010CB529303), A3 Predvidevanja programa iz Natural Science Foundation Kitajske (30921140311) in National Natural Science Foundation Kitajske (81041012 in 81171989). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka na svetu, s skoraj polovico, ki se pojavljajo na Kitajskem [1], [2]. Prognoza GC se občutno spreminja s stopnjo raka s 5-letno relativno stopnjo preživetja v fazi IV [3] dosegla 90% v fazi I, vendar manj kot 5%. Tako zgodnje odkrivanje GC je ključni ukrep za zmanjšanje smrtnosti in izboljšanje prognozo GC.

Čeprav gastroscopic presejanje za GC je zelo zanesljiva, je invazivna in draga, zlasti za države v razvoju. Zato je bilo veliko prizadevanja za razvoj manj dragih predhodnih presejalne teste na lahko dostopnih osebkov. Vendar pa veliko prej preiskovanih analitov, kot pepsinogen (PG) I /II razmerje, karcinoembrionski antigen (CEA) in antigenom ogljikovih hidratov 19-9 (CA 19-9), niso bili občutljivi in ​​dovolj natančna za GC testiranjem [3], [ ,,,0],4]. Tako obstaja nujna potreba po novih neinvazivnih biomarkerjev za izboljšanje zgodnjega odkrivanja GC.

MicroRNAs (miRNAs) so bogat razred majhnih RNA brez kodiranja, ki negativno uravnavajo izražanje genov, ki jih osnovno seznanjanje z 3'-neprevedeno regijo ciljnih mRNA, ki izhajajo iz obeh mRNA cepitev ali translacijskih represijo [5] [6]. Povečanje dokazi kažejo, da so miRNAs vključeni v različne biološke procese, vključno z razvojem, celično diferenciacijo, proliferacijo in apoptozo [7], in sodelovati v človeški karcinogeneze kot onkogeni ali tumorske razbijal [8]. Študije so pokazale, da miRNA izraz profil razlikuje med vrstami tumorjev in se lahko razlikujejo raka in normalnega tkiva [9], [10]. V zadnjem času je bilo predlagano v obtoku miRNAs velik potencial kot biomarkerjev za mnoge, vključno z rakom GC [11] - [16]. Vendar vrednost v obtoku miRNAs v zgodnje odkrivanje GC še niso poročali.

Od leta 1989 smo izvedli vrsto raziskav v Linqu County, območje z visokim tveganjem GC v provinci Shandong, China , vključno s študijo, ki temelji na populacijski kohorte predrakavih želodca poškodb [17], [18], in randomizirani sojenja zavira napredovanje želodca poškodb [19]. Ta kohorta nam omogoča, da razišče dinamične spremembe v obtoku ravni Mirna med razvojem GC, in nam ponuja edinstveno priložnost za raziskovanje potenciala obtoku miRNAs v zgodnje odkrivanje GC.

Tu se bomo poročajo o rezultatih diferencialom miRNAs v serumu GC in displazije (dis), in retrospektivni študiji, zasnovani za ocenjevanje dinamične spremembe v razvoju GC.

Materiali in metode

zasnova študija in prebivalstvo

podrobnosti o populaciji v študiji, postopki endoskopski pregled, merili želodca histopatologijo in spremljanja so opisani drugje [17] - [19]. Na kratko, je bila endoskopska raziskava prebiranje začel leta 1989 med 3399 prebivalcev v starosti 35-64 let v Linqu County, območje z visokim tveganjem za GC in predmetom brez GC diagnoze so nato sledili z ponovljenem izpitu endoskopski izvedena v letu 1994 [17 ], [18]. Leta 1995 je bila randomizirana, s placebom kontrolirana poseg poskus začeti pri tej populaciji do leta 2003, ko se je ponovil pregled endoskopski izvaja [19]. Vse teme opravili žreb krvi v obeh raziskavah na izhodiščno in končno točko za vsako študijo, in nekateri z naprednimi želodčnih poškodb, kot so intestinalno metaplazijo (IM) ali dis, tudi kri in dobila endoskopski pregled v 1992 in 1999.

v sedanji študiji je večstopenjski, ugnezdeni študija primerov in kontrol iz dveh velikih kohorte je bil zasnovan za ugotavljanje in potrjevanje razlika v serumu miRNAs so v GC in dis in retrospektivna študija je bila izvedena, da razišče možnosti seruma kandidatke miRNAs v zgodnje odkrivanje GC (slika 1).

Ta študija je bila razdeljena na štiri postopnimi faze. V fazi I, serum bazeni iz 14 GC bolnikov in 14, po starosti in spolu usklajenih nadzorov z diagnozo površno gastritis (SG) ali blagim kronični atrofični gastritis (OAS) so bile uporabljene za ustvarjanje Mirne profilov po analizi matrike. so bile ugotovljene diferencialne miRNAs, in za nadaljnjo analizo so bili izbrani izjemno molekul miRNAs ali zmerno molekul miRNAs imajo funkcionalne ali v zvezi z biomarkerjev poročila. V fazi II, so bile ugotovljene miRNAs potrjena s kvantitativno reverzno transkripcijo-verižna reakcija s polimerazo (QRT-PCR) na posameznih vzorcev v serumu 14 GK in nadzora, ki so bili uporabljeni za test diod v fazi I. V fazi III, so bistveno spremenjeni miRNAs so se nato potrjen pri bolnikih 68 ° C in 46 dis kot tudi njihove starosti in spolu ujemajo kontrol. Sprejemnik deluje lastnost temelji krivulja (ROC) analizo ocene tveganja, je bila nato izvedena med 68. GC-kontrolnih parov za oceno diskriminatorne učinke serumskih miRNAs na GC. Vsak predmet je bila dodeljena bodisi v visoko ali nizko ogroženih skupinah s primerjavo ravni izražanja miRNA biomarkerjev v ustrezne vrednosti cut-off, ki izhajajo iz ROC krivulje. V fazo IV, je bila retrospektivna študija, opravljena pri 58 bolnikih, GC, ki so predvideni vsaj eno primerno predhodno diagnozo serumu vzorec v dolgoročnega spremljanja študije, kot je opisano zgoraj, da razišče časovni trend potencialnih miRNA biomarkerjev in določi njihovo vrednost v zgodnje odkrivanje GC. Celotna raziskava je odobril Institutional Review Board je Peking University Cancer Hospital & Inštitut, in vsi preiskovanci dali pisno obveščene privolitve.

obdelava vzorcev in RNA ekstrakcija

Do 5 ml polne krvi, iz vsake tešče udeleženca smo zbrali primerov in kontrol, podpisan v istem letu. Vzorce krvi smo pustili stati 30-40 min in serumu ločitev izvedemo s centrifugiranjem pri 965 g 15 minut. Serum Supernatant predela in shranimo pri -80 ° C do analize. RNA smo izolirali iz 100 ml seruma z miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Nemčija), ki sledi protokolu proizvajalca z manjšo spremembo [20]. Za miRNA profiliranja, so dva bazena nastala z združitvijo mešanice zgornjo vodno fazo po separaciji faz in etanola pri bolnikih 14 GC (12 moških, 2 ženski, starosti, 62 (SD 6,4) let) in 14 spolno in nadzora starostno primerljivimi (starost, 61 (SD 5,9) let), oz. Po vezave na membrano RNeasy Mini spin kolono in kasnejše izpiranju smo RNK eluiramo s 40 p.L z RNaze proste vode. Za vse poskuse QRT-PCR, RNA pridobljen iz 100 ul seruma eluiramo s 100 p.L RNaze proste vode. Normalizirati variacijo na vzorec-za-vzorec v koraku RNA izolacijo, je sintetična ath-miR-159a dodali vsakemu vzorcu seruma za miRNA profiliranje, medtem ko je bil cel-miR-39 Dodana za analizo QRT-PCR, ki ga Mitchell et opisano al
[11].

Mirna profiliranje

Mirna profiliranje je bila izvedena z TaqMan nizke nizi gostota A (v2.0) glede na priporočeno protokolu proizvajalca (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA). Ta QRT-PCR profiliranje platforma je sestavljena iz enega 384-tudi mikrofluidni kartico, v katerem se 377 miRNAs mogoče analizirati skupaj s tremi notranjih kontrol (U6, RNU44 in RNU48) in eno negativno kontrolo, ki niso povezani s prehrano (ATH-pokoj-159a). Na kratko, RNA združeni ločeno od 14 bolnikov GC poveže in kontrole, kot je opisano zgoraj, je bila reverzno prepisana z uporabo TaqMan Mirna reverzne transkripcije kit in TaqMan Mirna multiplex RT teste (človeški bazen; Applied Biosystems). Za vsako RNA bazen je 3 ul celokupnega RNA dodamo k vsakemu od multipleks reverzne transkripcijske reakcije.

povečati količino cDNA na razpolago za analizo, obogatitev ciljnih genov smo izvedli s korakom preamplification. 25-ul reakcijsko zmes sestavljena iz 2,5 ul z nerazredčeno cDNA v kombinaciji s 12,5 ul iz TaqMan predojačevalec Master Mix (2 ×), 2.5 xl Megaplex predojačevalec Temeljne barve (10 x), in 7,5 xl nukleazo brez vode. Korak preamplification je bil opravljen na GeneAmp PCR sistema 9700 (Applied Biosystems) po protokolu proizvajalca.

Za realnem času analize PCR, je bil izdelek razredčili z dodatkom 75 xl nukleazo brez vode in 9 tjj- razredčene mešanice smo nato združili s 450 ul v TaqMan 2 x Universal PCR Master Mix brez uracil-N-glikozilazo in 441 ul z nukleazo brez vode. Po vstavljanju 100 ml vsake multipleks mešanice bazen, je bil niz centrifugirali in zapečatena. Amplification je bila izvedena na Applied Biosystems 7900 HT toplotno ciklerja (Applied Biosystems) z uporabo proizvajalca priporočene pogoje za kolesarjenje. Podatke smo analizirali z RQ Manager Software verzija 1.2 in DataAssist ™ različico programske opreme 2.0 (Applied Biosystems). Po normalizaciji z uporabo obogatenih-v ATH-pokoj-159a, pokrovček sprememba ravni miRNAs v GC v primerjavi s kontrolo je bila izračunana po metodi.

Mirna kvantifikacija s sprotnim QRT-PCR

Reverse prepis je bila narejena z TaqMan Mirna reverzne transkripcije kit in miRNA-specifičnih matičnih zanke začetnih oligonukleotidov (Applied Biosystems). 7,5-ul reakcijsko zmes sestavljena iz 0,75 li 10 × Reverse prepisovanje buffer, 0.095 ul zaviralca RNase (20 enot /ul), 0,075 ul 100 mm dNTP z DTTP, 0,5 ul iz MultiScribe reverzne transkriptaze (50 enot /ul), 1.5 ul s primerjem, 2.5 ul RNA in 2,08 ul RNase brez vode. Reverzno transkripcijo smo izvedli na T strokovni sistema PCR (Biometra, Nemčija) po protokolu proizvajalca.

Real-time PCR smo izvedli v dveh izvodih in jih vključiti brez predlogo negativne kontrole. Za 20-ul reakciji smo cDNA (3 ul) v kombinaciji z 10 ul iz TaqMan 2 x Universal PCR Master Mix brez uracil-N-glikozilazo, 1 ul v testnem mešanice TaqMan miRNA in 6 ul vode. Amplification je bila izvedena na 7500 Real-Time PCR sistem (Applied Biosystems) po protokolu proizvajalca. Ravni izraz za miRNAs smo normalizirali s obogatenih-v cel-pokoj-39, in so bile izračunane po metodi.

Statistična analiza

paru t
Test je bil uporablja preučiti razlike v povprečni starosti med skupinami. Test Wilcoxonov ali preizkus Mann-Whitney U je bila uporabljena za primerjavo serumskih ravni Mirna različnih skupin, kjer je to primerno. ROC krivulje so bile določene za ovrednotenje diagnostične učinke miRNAs, in je bil zaposlen posplošena linearni model z večkratnim ukrepov analizirati časovne trende serumskih vrednosti miRNA pri razvoju GC po logaritemsko transformacijo. Vse
P vrednosti so dvostranski in manj kot 0,05 je zdelo statistično značilne. Vse statistične analize smo izvedli s pomočjo statističnega paketa za družbene vede (SPSS 13.0, Chicago, IL).

Rezultati

Zadeva značilnosti

Skupno 82 bolnikov GC, 46 oseb z dis in 128 kontrol z GS ali blagim OAS so bili vključeni v to študijo. Kot je prikazano v tabeli 1, ni bilo pomembne razlike v starosti, med bolniki s PK ali dis in ustrezne kontrole ( P
= 0,329 in 0,214, v tem zaporedju).

Mirna profiliranje

različno izražene miRNAs so bile ugotovljene v serumu bazenih 14 GK in 14 kontrol uporabljajo TaqMan paleto z nizko gostoto. Med 377 miRNAs analiziranih 99 pokazala > 2-krat molekul in 40 pokazala < 0,5-krat navzdol reguliranih spremembe GC serumu bazenu (tabela S1). Šestnajst molekul miRNAs (MIR-221, MIR-744, miR-376c, MIR-191, miR-27a, naj-7e, miR-27b, MIR-222, MIR-21, miR-18a, miR-19a, miR- 17, miR-106b, miR-106a, miR-20a, in miR-155), ki dokazujejo izjemne izrazne spremembe v GC serumu in imajo funkcionalne ali diferencialnih poročila izražanja v PK tkiva so bili izbrani kot kandidati za potrjevanje v pest fazi [21] - [28]

Prva faza validacije

izrazi 16 miRNAs kandidatkami so bile izmerjene v posameznih vzorcih seruma po 14 GK in nadzora, ki so bili uporabljeni za test diod.. Skladno z profiliranja rezultate vseh 16 miRNAs pokazala višje koncentracije v serumu v PK skupini kot v kontrolni skupini (slika S1). Med njimi je bilo >9 serumskih miRNAs (MIR-221, MIR-744, miR-376c, MIR-191, miR-27a, naj-7e, miR-27b, MIR-222, in MIR-21); 2 povprečni krat sprememba GC skupini v primerjavi s kontrolno skupino ( P
< 0,05), in so bili tako izbrani za nadaljnje validacije

Druga etapa potrditev

Proučili smo 9 Mirne. izrazi na velike skupine seruma 68 parov GC in nadzora. Kot je prikazano na sliki 2, 8 od 9 miRNAs (MIR-221, MIR-744, miR-376c, MIR-191, miR-27A, naj-7e, miR-27b, in MIR-222) je pokazala znatno povišane ravni v GC skupini z več kot 2-kratno spremembo ( P
< 0,05)., in te miRNAs so za naslednje analize izbrana

ocena tveganja primerov GC z uporabo ploščo miRNAs

za oceno diskriminatorne učinke serumskih miRNAs na GC, so ROC krivulje določena za vsakega od 8 miRNAs uporabo 68 parov GC in nadzora v potrditev na drugi stopnji (slika 3). Rezultati so pokazali, da miR-744, miR-376c, miR-221 in pustite, 7e prinesla največje območja pod krivuljami ROC (AUC) in lahko imajo potencial kot biomarkerjev za detekcijo GC.

temelji ocena tveganja na štirih miRNAs je bila uporabljena za razlikovanje vzorcev v serumu primerih GC iz nadzora. Za vsako miRNA, smo najprej izračunali optimalno mejno vrednost relativne ravni izražanja (miR-744: 5,49 x 10 ^{-4; miR-376c: 6.05 x 10 -4; miR-221: 1.47 × 10 -3, naj-7e: 1.61 x 10 -3), na kateri je bil YOUDENOVIM indeks (občutljivost + specifičnost-1) za GC diagnozo največja na krivuljo ROC. Nato smo razdelili predmet v skupino z visokim tveganjem, ki predstavljajo možne primera GC, ko je raven seruma po kateremkoli od štirih miRNAs enaka ali večja od ustrezne mejne vrednosti, in skupina majhnim tveganjem, predstavlja nadzor , ko so bile koncentracije v serumu vseh štirih miRNAs manj od vrednosti, cut-off.}

v skladu s tem merilom ocenjevanja, 56 GK in 32 kontrol bili pravilno napovedanih kot GC in ne-GC primerih, ki proizvajajo občutljivost za 82,4% in specifičnost 47,1%. Ker Ponovitev-7e dokazali najmanjšo vrednost in širši interval zaupanja AUC med štirimi miRNAs v analizi ROC krivuljo (slika 3), smo ponovili zgoraj oceno tveganja po izključitvi pustiti-7E in doseže višjo specifičnost (40/68, 58,8 %), medtem ko je občutljivost ostala nespremenjena, kar pomeni, da je bil prispevek pustil-7e, da razlikovanje GCS iz nadzora zanemarljiv, in tri-miRNA plošča (miR-221, je miR-376c in miR-744) bolj učinkovita kombinacija biomarkerjev za GC diagnozo.

Da bi še dodatno preučiti potencial te komisije za zgodnje odkrivanje GC, smo ocenili podskupino 30 bolnikov GC v zgodnji fazi, in 22 so pravilno napovedali kot primeri GC z občutljivostjo 73,3% .

zveza med serumu miRNA izraz in diferenciranje razrede GC

Poleg tega smo poskušali raziskati povezavo med izražanjem miR-221, mIR-744 in pokoj-376c in razlikovanje razredov GC. Kot je prikazano na sliki 4A-C, vsi trije miRNAs so pokazale višje koncentracije v serumu v slabo diferenciranega GC skupine (43 GCS vključno 29 moških in 14 žensk; starosti, 60 (SD 8,3) let) kot v dobro ali zmerno diferenciranega GC skupine (24 GK vključno 19 moških in 5 ženskih; starosti, 60 (SD 6,2) let). Med njimi, serum miR-221 in miR-376c je pokazala močno pozitivno korelacijo s slabim diferenciacije GC ( P
= 0,006 in 0,004, v tem zaporedju).

ravni Expression serumskih biomarkerjev miRNA pri osebah z dis

Da bi še dodatno osvetlili pomen teh treh miRNAs z predrakave želodca lezijo, smo pregledali njihovo izražanje v 46 parov dis in nadzora. Kot je prikazano na sliki 4D-F je bila pomembno zvišana raven miR-221 so v skupini dis v primerjavi s kontrolno skupino ( P
= 0,027), medtem ko ni bilo bistvene razlike, ugotovljena za pokoj-376c ali miR- 744. Nadaljnja analiza ocena tveganja po že uveljavljenih postopkov je pokazala, da bi lahko ta tri-miRNA plošča razlikuje dis iz nadzora z občutljivostjo 56,5% in specifičnost 47,8%.

Dinamične spremembe serumskih biomarkerjev miRNA med razvojem GC

v retrospektivni študiji so odkrili dinamičnih sprememb treh serumskih biomarkerjev miRNA na 58 bolnikih GC, ki so bili razdeljeni v štiri skupine glede na časovni interval od žrebanja krvi GC diagnozo: pred diagnozo 2-5 let , 6-9 let, 10-14-letne in ≥15-letne skupine (tabela 2). Nekateri predmeti lahko hkrati obstaja v dveh ali več kot dveh skupinah, saj če serumskih vzorcih v različnih časovnih točkah obdobju spremljanja.

Kot je prikazano na sliki 5A, vsi trije v serumu miRNAs prikazane izrazito poveča izražanje med GC razvoj, z izjemo rahlega povečanja serumskega miR-744 v pre-diagnoze ≥15 let skupini. Nadaljnji trend test je pokazal statistično značilno linearno gibanje v treh ravneh miRNA med 20 bolnikih GC, ki so v različnih časovnih točkah med obdobju spremljanja (slika 5B) prispeval tri serumu.

Na koncu smo ocenili potencial Mirna biomarkerjev za zgodnje napovedovanje GC v 29 bolnikov, ki so določene vzorce v serumu na 2-5 leti pred GC diagnoze. V skladu z merilom za oceno tveganja, ustanovljen pred 23 od 29 bolnikov, ki so GC (79,3%) so bili pravilno razvrščeni kot zastopanih primerih GC s tem tri-seruma miRNA plošči.

Pogovor

Cilj te raziskave je bil ugotoviti diferencialne miRNAs v serumu GC in dis, in raziskati možnosti serumu miRNAs kot biomarker za zgodnje odkrivanje GC. Našli smo znatno povišane ravni seruma miR-221, miR-376c in MIR-744 pri bolnikih GC s sistematičnim, ki temelji na mikromrež pregleda in dvostopenjskega potrjevanja. Ta tri-serum miRNA plošča se lahko razlikuje GCS iz nadzora in pokazala, da se trend v razvoju GC. Kolikor nam je znano, je to prvi, ki temelji na prebivalstvo študija raziskuje dinamične spremembe serumskih miRNAs, povezanih z GC in njegovih predhodnikov v območju z visoko stopnjo tveganja za GC.

Pojavnost GC zelo razlikuje po vsem svetu, pri čemer so najvišje stopnje, ki se pojavljajo v vzhodni Aziji, vključno z Japonsko, Korejo in Kitajsko [1], [2]. Na Kitajskem je večina GK so bile ugotovljene v poznejših fazah, ki izhajajo iz slabo prognozo s povprečno 5-letno stopnjo preživetja < 30%, medtem ko so na Japonskem in v Koreji več kot 60% GK diagnosticirali v zgodnji fazi, ki temeljijo na skupnosti endoskopske pregleda s 5-letno preživetje > 80% [29], [30]. Čeprav je vpliv zgodnjega odkrivanja GC ga endoskopske pregleda pomembno Linqu, je prišlo le nekaj, ki temelji na prebivalstvo presejanje za GC na Kitajskem zaradi visokih stroškov in pomanjkanja usposobljenih endoscopists.

GC je konec rezultat večstopenjskih želodca poškodb pri različnih bioloških značilnosti, ki zagotavlja možnost, da se odkrije GC v zgodnji fazi z uporabo biomarkerjev. V naši prejšnji raziskavi smo ugotovili, razmerje v serumu PG I /II monotono znižala z resnostjo želodčnih poškodb, pa so bili občutljivost in specifičnost za napovedovanje naprednih želodčne poškodbe in GC slaba [31]. V zadnjem času se kopičijo dokazi pokazali, da miRNAs igrajo pomembno vlogo pri onkogenezo, in tumor izvira miRNAs lahko vstopijo v krvni obtok v izredno stabilno obliko [11] [32] [33], kar kaže, da bi se lahko miRNAs uporablja kot roman neinvazivno biomarkerjev za zgodnje odkrivanje GC.

Pred kratkim je študija opredelila štiri molekul-GC povezana miRNAs (MIR-17-5p, MIR-21, miR-106a in miR-106b) [34], ki je tudi prikaže višjo raven izražanja v PK serumu na naši array, ker je presenetljivo downregulation za oddajal-7a v svoji študiji niso opazili pri nas. Druga študija je pokazala, pet povišane serumske miRNAs (MIR-1, miR-20a, miR-27a, MIR-34 in miR-423-5p) pri bolnikih GC [13], medtem ko so le miR-20a in miR-27a molekul na naše matrika, in miR-27a je potrdil, da se izredno močno izraženi pri bolnikih GC. V delno neskladnih rezultatov lahko odraža razlike v vrstah vzorcev, presejalne orodij ali metod za količinsko [35].

Med tremi serumskih miRNAs opredeljenih v naši raziskavi, miR-221 je bilo ugotovljeno neobičajno molekul v tkivih številnih raka vrste, kot so želodčni [24], debelega črevesa [21], prostate [36] in raka dojke [37]. MIR-221 lahko objavili-transkripcijsko zatreti P27 in P57, kar bi olajšalo G1 /S fazni prehod in krepitev proliferacijo in rast tumorjev [24] [36] [38] [39]. Študije so pokazale, da je nivo izražanja miR-221 v plazmi povezana s splošnim preživetjem kolorektalnega raka [40] in napredovanja raka prostate [41]. Le nekaj študijah so raziskovali funkcionalno ustreznost pokoj-376c, kot so pokoj-376c lahko okrepila proliferacije, preživetje in chemoresistance ovarijskih celic raka z usmerjanjem ALK7 [42]. Za miR-744, njenega izražanja vzorec, fiziološke funkcije in povezave z kancerogenosti niso znani trenutno.

V naši trenutni raziskavi smo ugotovili, da ta tri-miRNA plošče lahko vzorce serumu GC razlikuje od nadzora z občutljivostjo 82,4% in specifičnost 58,8%. Poleg tega je naša študija je pokazala, da je med 30 bolnikov GC na začetku poklicne poti, 22 (73,3%) so bili pravilno razvrščeni, kar kaže na to ploščo lahko služi kot biomarker za zgodnje odkrivanje GC. Prav tako odpira možnost, da je lahko ta plošča miRNAs koristen kot predhodni presejalni testi za GC v splošni populaciji z visokim tveganjem za GC.

smo bili zainteresirani za raziskovanje povezav med temi tremi serumskih miRNAs in diferenciacije tudi stopnje za GC. S primerjavo vrednosti Mirna v serumu bolnikov GC z različnimi stopnjami, smo ugotovili višjo serum Mirna izraz v slabo diferencirano GC. Ta rezultat je pokazala, da je bila visoka stopnja izražanja teh serumskih miRNAs pri bolnikih GC povezana s fazi GC. Čeprav mehanizem tega pojava ni jasno, lahko visoka raven teh miRNAs v serumu imajo določeno vrednost za navedbo izbor napredovanja in zdravljenja z GC.

nadalje smo ocenili, ali bi ta tri-miRNA plošča napovedati napredno želodca lezij, kot dis. Našli smo le miR-221 prikaže povišan nivo izražanja v dis, kar kaže na to plošča je bolj specifično za GC. Kljub omejen učinek te komisije za odkrivanje dis, miR-221, eden od treh serumskih miRNAs, so lahko koristne za identifikacijo tistih dis predmete na izjemno visoko tveganje za razvoj GC. Zanimivo je, da ga naprej sledenje razvoj teh dis predmetov, smo ugotovili nižjo stopnjo regresije do manj hudih poškodb in en incident GC na napovedane skupine z visokim tveganjem, ki so imeli višjo raven v serumu miR-221 (podatki niso prikazani).

z naknadno pregledovanje izražanje treh serumskih miRNAs v vzorcih pred diagnozo bolnikov GC, smo našli vse večji trend v razvoju GC, in nadaljnja analiza je pokazala, da bi lahko ta odbor napovedati GC do 5 let pred klinično GC diagnoze. Ti rezultati močno podprl vrednost teh treh miRNAs za napovedovanje GC pojav. Združili tri serumu Mirna podpis s patološko diagnozo mogoče izboljšati zgodnje odkrivanje GC pri osebah z naprednimi želodčnih poškodb, kot so UI in dis.

Da bi izključili možnost, da večjo starost in krajše obdobje shranjevanja vzorcev seruma prispevale k višji ravni miRNAs več časa, smo analizirali Mirna izražanje v 82 kontrol, ki so bile opravljene remi krvi v istih časovnih točkah pri bolnikih GC. Ni pomembna razlika je bila v obdobju spremljanja (podatki niso prikazani) opazili, kar kaže, da povečanje serumske Mirna skozi razvoj GC ni mogoče pripisati povečani starosti in podporo, ki so bili prisotni v serumu v stabilno obliko miRNAs. Zato lahko v obtoku miRNAs se uporablja kot biomarkerja za razvoj neinvazivno test za odkrivanje GC v prihodnosti zaradi svoje lahke dostopnosti, visoko stabilnost in nizko ceno analiznega.

Naša raziskava ima več prednosti. Prvič, vsi predmeti prišel iz populacije z visokim tveganjem za GC in doživel strog patološko diagnozo, ki upravičuje našo hipotezo, da je mogoče opaziti razlike v serumskih vrednosti miRNA med GK in nadzora pripisati predvsem, če ne vse, da neoplastične transformacije. Drugič, naša raziskava, ki temelji na prebivalstvo z visoko skladnostjo in več kot 20 let spremljanju izboljšano zanesljivost študije, in če je prvi dokaz o dinamičnih sprememb serumskih miRNAs med razvojem GC, kakor tudi njihov potencial kot biomarkerjev za identifikacijo posamezniki z visoko stopnjo tveganja GC.

Ta študija ima tudi nekatere omejitve. Ker je bilo zelo malo preiskovancev z diagnozo normalno želodčne sluznice v tej populaciji [17], smo uporabili predmete z GS /blago OAS kot kontrole. Vendar pa je v primerjavi s študijami, ki uporabljajo splošno običajne predmete, kot je nadzor, naš patološki ki temelji diagnoza strategija izbor nadzor razredčen nesorazmerje med primerov in kontrol, s čimer lahko povzroči le podcenjevanje rezultatov. Poleg tega ugotovitve te predhodne študije z majhnim vzorcem zahteva dodatno potrditev v velikih prospektivnih študij in je treba funkcionalno ustreznost na novo opredeljene miRNAs treba dodatno pojasniti.

Na koncu, s pomočjo te študije, ki temeljijo na populacijski smo ugotovili vrsto diferencialnih serumskih miRNAs (MIR-221, miR-376c in MIR-744), v GC in predlagal njihov potencial za nova neinvazivnih biomarkerjev za zgodnje odkrivanje GC.

Podpora Informacije
Slika S1.
serumu v 16 izbranih miRNAs v 14 parov GC in kontrolne skupine v potrditev na prvi stopnji. Mediana krat spremembe ravni miRNA primerjali GC z nadzorom je bila dana in testi Wilcoxonov smo izvedli preučiti razlike med obema skupinama. Relativne ravni miRNAs (log10 lestvica na Y-osi) so bili normalizirani s obogatenih-in cel-pokoj-39
doi:. 10,1371 /journal.pone.0033608.s001
(JPG)
Tabela S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0033608.s002
(XLS)

• Plos ONE: fermentirano mleko s Propionibacterium freudenreichii inducira apoptozo HGT-1 Human želodca Rak Cells
• Plos ONE: genska odpornost na CagA učinkujejo vzajemno molekul in Gene-okolje Medsebojno delovanje z fitoestrogene, dejavnik Domnevna tveganja za želodca Cancer