PLoS ONE: В пробирке Характеристика быстрого цитотоксичности противоракового пептидных HPRP-A2 через мембрану разрушения и внутриклеточного механизма против рака желудка клетки Lines

Абстрактный

В этом исследовании, HPRP-A2, синтетический 15-меров катионные пептиды со всеми D-аминокислот, эффективно ингибирует выживание желудка клеточных линий в зависимости от дозы образом. Желудочный опухолевые клетки, убивающие с помощью HPRP-A2 включает быстрый распад целостности мембраны и внутриклеточных путей. Пропидиум йодида (PI) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) Анализы показали, что один час лечение с HPRP-A2 привело к изменениям проницаемости мембран клеток КУП-823 в зависимости от дозы образом. Кроме того, HPRP-A2 индуцирует апоптоз в BGC-823 клеток предполагает заметное увеличение генерации активных форм кислорода (ROS), каспазы-3, -8 и -9 активации, снижение митохондриального мембранного потенциала (ММР), и клеточного цикла арест в G1 фазе. В дополнение к присущей цитотоксичности, HPRP-A2 сильно synergized с доксорубицином (DOX) для повышения эффективности убийства опухолевых клеток желудка I п экстракорпорального
. Мы считаем, что HPRP-А2 со всеми D-аминокислот может быть мощным кандидатом противораковых терапевтических средств, особенно при комбинированной терапии
<р> Цитирование:. Чжао J, Хао Х, Лю D, Хуан Y, Y Чен (2015 ) В пробирке
Характеристика Rapid цитотоксичности противоракового пептидных HPRP-A2 через мембрану разрушения и внутриклеточного механизма против рака желудка клеточных линий. PLoS ONE 10 (9): e0139578. DOI: 10.1371 /journal.pone.0139578
<р> Редактор: Аамир Ahmad, Wayne State University школы медицины, Соединенные Штаты
<р> Поступило: 2 июля 2015 года; Принято: 15 сентября 2015 года; Опубликовано: 30 сентября 2015
<р> Copyright: © 2015 Чжао и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в работе
<р> Финансирование:. Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81373445, YXC и № 21442001, YBH) и фонд естественных наук провинции Цзилинь (№ 20150101189JC , YC и № 20140101042JC, YBH). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> на протяжении последних десятилетий, хотя прорывы были достигнуты в развитии рака терапии, резистентности и неспецифической токсичности традиционных препаратов по-прежнему проблемы узкость для потенциальных клинической практике [1-3]. Следовательно, необходимо срочно создать новые лекарства с различными способами действия, которые могут преодолеть недостатки многих доступных препаратов.
<Р> В настоящее время возможности применения противоопухолевых пептидов (ACPS) в качестве терапевтических средств для лечения рака прогрессирование привлекают больше внимания, чем обычные химиотерапии в основном из следующих свойств: (1) высокая специфичность. Положительно заряженные пептиды селективно нацелены на раковые клетки, которые несут отрицательные заряды и имеют различные компоненты мембраны от нормальных клеток [4, 5], (2) нового способа действия. Она могла бы избежать созданы механизмы множественной лекарственной устойчивости [5-7]; (3) синергический противоопухолевый эффект с химиотерапевтическими. Сообщалось, что некоторые ACPS могут производить синергетический противоопухолевую активность при комбинировании с различными применение обычных противоопухолевых препаратов [8-10].
<Р> Общий механизм пептида-индуцированной гибели клеток является цитоплазматический разрушение мембраны через мицеллообразования или порообразования , хотя некоторые из ACPS сообщается, чтобы вызвать апоптоз пути рецептора гибели и /или митохондриального пути [8, 11]. Кроме того, образование пор на клеточной мембране и изменение проницаемости мембраны может обеспечить лучший канал для вступления других противоопухолевых препаратов в клетки и повышения их противораковые деятельности [8, 12].
<Р> Наше предыдущее исследование доказал, что HPRP-A2 может вызывать гибель клеток и одновременно усиливается DOX /эпирубицин (EPI) -индуцированное апоптоз в HeLa и HepG2 клеточных линий [12]. Кроме того, из-за состава D-аминокислоты, HPRP-А2 устойчив к протеолитическому расщеплению и сохраняет эквивалентные действия противоопухолевых своим L энантиомеров [6, 12]. На основании предыдущих исследований, мы стремимся достичь две цели в данном исследовании: очертить основной противораковый механизм HPRP-A2 и исследовать синергический противораковое действие на BGC-823 и SGC-7901 клеток в сочетании HPRP-A2 с DOX.

материалы и методы

клеточные линии и клеточная культура
<р> человека линии клеток желудка BGC-823 и SGC-7901 были получены из американской коллекции типовых культур, который проверяет подлинность клетки линии путем тестирования повтор ДНК короткого тандемного, использовались в течение 6 месяцев реаниматологии и выращивали в среде DMEM с эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; 10% об /об), пенициллин (100 ед /мл), и стрептомицином (100 ед /мл) во влажной атмосфере при температуре 37 ° с с 5% CO <суб> 2.

пептидный синтез и очистка
<р> пептид синтезировали путем синтеза пептидов в твердой фазе с использованием Fmoc (9-флуоренил -methoxycar-bonyl) химии, как описано ранее [13]. Дальнейшая характеристика была обнаружена с помощью масс-спектрометрии и аминокислотного анализа. DOX · HCl был приобретен у Meilun биологии технологии Лтд (Далянь, Китай).

жизнеспособности клеток анализы
<р> BGC-823 и SGC-7901-клетки (5 × 10 3) высевали в трех повторах в 96-луночных планшетах. Полная среда была заменена после 24 ч с 100 мкл свежей среды, содержащей различные концентрации препаратов. Еще через 24 ч клетки инкубируют с 3- (4,5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид (МТТ) при 37 ° С в течение 4 ч. После диметилсульфоксид (ДМСО) добавляли для растворения кристаллов формазана и оптическую плотность при 492 нм измеряли с помощью планшет-ридере (GF-M3000; Gaomi Caihong аналитических приборов Co., Шаньдун, Китай). Формула Джина была использована для дальнейшей количественной оценки синергического эффекта комбинации лечения HPRP-A2 и DOX. Формула: Q = Еа + Ь /(Еа + Eb-Еа × Eb), где Q представляет собой индекс сочетания; E A + B представляет собой клеточную пролиферативную степень ингибирования комбинированного лекарственного средства; Ea и Eb признаки клеточного пролиферативного степени ингибирования каждого препарата. После расчета:. Q < 0,85, Q > 1,15 и 0,85 &л; Q &л; 1,15, указывают на антагонизм, синергизм, и дополнительный эффект, соответственно [14]

Гемолиз Анализ активности
<р> Гемолиз активность анализ был проводили, как описано ранее [13]. Для того, чтобы получить красные клетки крови, свежей крови человека, стабилизированного EDTAK центрифугировали при 1000 оборотах в минуту в течение 5 мин, дважды промывали ПБС, и разводили до конечной концентрации 2% в PBS. 70 мкл 2% эритроцитов человека добавляли к круглым дном 96-луночного планшета, а затем 70 мкл различных концентраций HPRP-A2. После инкубации при температуре 37 ° С в течение 1 ч планшет центрифугировали со скоростью 3000 оборотов в минуту в течение 10 мин и 90 мкл супернатанта переносили в плоским дном 96-луночного планшета. Высвобождение гемоглобина определяли путем измерения оптической плотности супернатанта при 540 нм. Эритроциты в PBS и дистиллированной воды (дН <суб> 2O) были использованы в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно. Гемолитическая активность рассчитывают как процент от экспериментальной группы и положительного контроля, после вычитания отрицательного контроля, соответственно. Данные представляют собой среднее ± SD трех независимых экспериментов.

ПИ-анализ
<р> Клетки КУП-823 (1 × 106 клеток /лунку) засевали в шесть-луночных планшетах. После инкубации с HPRP-A2 (5, 10, 15 мкМ) в течение 1 ч, клетки собирают, а затем обрабатывают 5 мкг /мл PI при температуре 4 ° С в течение 10 минут в темноте. Клетки промывали PBS три раза, а затем обнаружить интенсивность флуоресценции PI с помощью проточной цитометрии (FACSCalibur, Becton-Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США).

релиз ЛДГ
<р> ЛДГ релиз активность измеряли с помощью набора для анализа ЛДГ (Jiancheng биоинженерии, Ltd., Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки BGC-823 были посеяны в 5 × 10 3 клеток /лунку в 96-луночного планшета. После инкубации с HPRP-A2 (5, 10, 15 мкМ) в течение 1 ч, высвобождение ЛДГ в супернатанте измеряли с помощью микропланшет-ридера (ГФ-М3000; Gaomi Caihong Аналитические приборы Лтд Шаньдун, Китай) в 450 нм. Клетки без обработки или лизируют с Тритона Х-100 использовали в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно. Все эксперименты проводились в трех повторах. ЛДГ активность рассчитывают как процент экспериментальной группы и положительного контроля, после вычитания отрицательного контроля соответственно.

ROS анализ
<р> ROS набора для анализа (BestBio, Co. Шанхай, Китай) был использован для детектировать генерацию ROS. Клетки (1 × 106) обрабатывались HPRP-A2 (5, 10, 15 мкМ) в течение 1 часа. Последующие процедуры были выполнены в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, клетки перевариваются трипсином, центрифугировали при 1500 оборотах в минуту в течение 3 мин, промывали три раза PBS и затем суспендировали в 500 мкл PBS. После инкубации с 2 ', 7'-dichlorofluorescin диацетат (DCFH-DA) флуоресцентного зонда в течение 20 мин при температуре 37 ° С, клетки промывали PBS в течение трех раз и обнаружил зеленую интенсивность флуоресценции (в GEOMEAN) с помощью проточной цитометрии. Интенсивность зеленая флуоресценция положительно коррелирует с уровнем АФК.

Измерение ММР
<р> ММР определяли с помощью митохондриального мембранного потенциала набора для анализа с 5,5 ', 6,6'-тетрахлор -1,1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine йодид (JC-1), который представляет собой зонд митохондриальной активности (BestBio, Co., Шанхай, Китай). JC-1 всегда используется для обнаружения митохондриальную деполяризацию встречающийся на ранних стадиях апоптоза. Когда клетки с высоким ММР, JC-1 собрались в митохондриях, образуя J-агрегаты и производят красную флуоресценцию. С другой стороны, клетки, содержащие JC-1 мономер мономер monomermonomer имеют низкую ММР и показать зеленую флуоресценцию. Митохондриальной деполяризации определялся уменьшением красного (590 нм, FL-2 канала) /зеленый отношение интенсивности флуоресценции (530 нм, ФЛ-1 канал). Если коротко, то после обработки HPRP-A2 (5, 10, 15 мкМ) в течение 1 ч, клетки КУП-823, собирали и инкубировали с 0,5 мл JC-1 рабочий раствор в течение 20 мин при 37 ° С, а затем два раза промывали PBS, суспендировали в PBS и анализировали с помощью проточной цитометрии (FACSCalibur, Becton-Dickinson, Сан-Хосе, штат Калифорния, США).

каспазы анализ активности
<р> Клетки обрабатывали HPRP-A2 (10, 15 мкМ) в течение 24 ч, а затем уровни каспазы деятельности были измерены с помощью соответствующих каспазы активности обнаружения комплектов (BestBio, Co., Шанхай, Китай), в соответствии с инструкциями производителя. Средние данные представлены как среднее ± стандартное отклонение по меньшей мере трех независимых экспериментов.

клеточного цикла анализа
<р> BGC-823 клетки (1 × 10 6) высевали в 6-луночные планшеты в течение 24 ч. После индукции с HPRP-A2 (5, 10, 15 мкМ) в течение 24 ч, распределение клеточного цикла определяли с помощью FACScan цитометрии и программного обеспечения Cell Quest (FACS Calibur, Becton-Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США). Все эксперименты проводились в трех экземплярах.

Статистический анализ
<р> Данные представлены в виде средних значений ± SD трех независимых определений. Статистическая значимость различий между группами были проанализированы с помощью т
-test с значение принимается в P
&л; 0,005 (*) и P
&л; 0,001 (**).

Результаты

Пептид и цитотоксичность
<р> Как показано на рисунке 1, пептид HPRP-A2 представляет собой 15-остаток α-спиральную амфипатический мембраноактивных пептид, состоящий из всех D-аминокислот. Сравнивая селективную токсичность HPRP-A2 к желудочному раковых клеток и нормальных клеток (эритроциты человека), мы можем легко найти, что IC <югу от> 50 (концентрация лекарственного средства, при котором жизнеспособность клеток была снижена на 50% по сравнению с необработанной клетки) значения намного меньше минимальной гемолитической концентрации (концентрация лекарственного средства, что привело к 20% гемолизу клеток) из HPRP-A2. Эти результаты показали, что HPRP-А2 может избирательно убивать клеток рака желудка и пощади нормальные клетки (фиг.2 и 3). Подобные противораковые деятельность двух клеточных линий (КУП-823 и SGC-7901) показали, что существует эффект широкого спектра действия в противоракового действия HPRP-A2. Благодаря своей мембрано-активных свойств, HPRP-А2 показывает противоопухолевую терапевтический потенциал, поскольку он более селективно по отношению к токсичным опухолевые клетки, чем нормальные клетки.

HPRP-А2 индуцирует повышение проницаемости мембран
<р> для того, чтобы проверить изменение проницаемости мембран после инкубации с HPRP-A2, клеточному поглощению PI и внеклеточной высвобождение ЛДГ были исследованы с проточной цитометрии и микропланшет-ридера в направлении клеток КУП-823. Как показано на фиг.4, в проточной цитометрии графики ПИ постепенно переходить к направлению высокой интенсивности флуоресценции в зависимости от концентрации, и увеличение высвобождения ЛДГ также наблюдалась в клетках, инкубированных с HPRP-A2. То есть, HPRP-A2 может привести к повреждению клеточной мембраны и приводит к повышению проницаемости клеточных мембран.

HPRP-A2 вызвало повреждения митохондриальной функции
<р> внутриклеточное активные формы кислорода видов (ROS) выпуск и митохондриальный мембранный потенциал (ММР) были обнаружены с FACS, чтобы отразить функцию митохондрии клеток BGC-823 в пробирке
. Как показано на фиг.5А, то проточной цитометрии гистограмма клеток, инкубированных с более высокой концентрацией HPRP-A2 показали более высокую интенсивность флуоресценции после инкубации в течение 1 ч. Соответствующий проточной цитометрии количественное сравнение интенсивности флуоресценции в GEOMEAN в этих различных концентрациях показал аналогичную тенденцию, а именно, что повышенное высвобождение ROS в клетках КУП-823 в присутствии HPRP-А2 зависит от концентрации. Аналогичная зависимое от концентрации изменения тенденция наблюдалась также в фиг.5В, отношение FL2-H /FL1-H заметно уменьшилось, что указывает на деполяризацию ММР.

активации каспазы и клеточного цикла анализа
<р> Активация каспазы-3, -8 и -9 в HPRP-А2-индуцированных клеток измеряли с использованием с помощью микропланшет-ридера при 405 нм. Как показано на фиг.5С, каспазы-3, -8 и -9 все эти параметры увеличились после лечения с HPRP-A2 в течение 24 ч в клетках КУП-823, что свидетельствует о том, что индукция апоптоза с помощью HPRP-A2 может быть каспазы-зависимый , Как показано на фиг.6, клетки КУП-823 обрабатывали различными концентрациями HPRP-A2 (5, 10, 15 мкМ) в течение 24 ч привело к увеличению суб-G1 ареста и в G1 арестом. Эти данные также усилили повышенную активность каспазы-3 после обработки HPRP-A2.

HPRP-А2-индуцированное увеличение цитотоксичности DOX
<р> КУП-823 и СГК-7901 клетки были выбраны изучить синергетический противораковое действие HPRP-A2 и химиотерапевтического препарата DOX. Клетки обрабатывали HPRP-A2 (6 мкМ) и /или Dox (1,6 мкг /мл) в течение 4, 24 и 48 ч. MTT анализы были использованы для оценки комбинационной противоопухолевый эффект на клетки. Концентрации, выбранные в наркотиков данного исследования были основаны на IC <суб> 50 значений только каждого препарата. Там не было явного цитотоксичность или замедлению роста, когда каждый препарат был использован в одиночку. В противоположность этому, при использовании в пептидных /комбинаций лекарственных средств (HPRP-А2 /DOX) в тех же дозах, что они используются в одиночку, комбинация выставлены значительную цитотоксичность (рис 7). Также очевидно, что противораковая активность HPRP-A2 не сильно зависит от времени инкубации; в отличие от этого, с увеличением времени инкубации до 48 ч, DOX показывает значительно большую противоопухолевую активность, чем у 4 ч, что указывает на совершенно разные механизмы действия между АСР и химиотерапевтического препарата. Согласно формуле Джина, все Q (комбинации индексов) значения были больше 1,15, что указывает на то, что существуют значительные синергетические эффекты между альфа-спирального пептида HPRP-A2 и обычного противоопухолевого препарата DOX в BGC-823 и SGC-7901 клеток .

Обсуждение
<р> противоопухолевые пептиды (ACPS) в последнее время получили большое внимание как перспективные химиотерапевтические агенты, которые позволяют избежать недостатков существующих препаратов. Многие исследования подтвердили, что некоторые синтетические и природные катионные пептиды обладают быстрым и широким спектром противоопухолевой активностью по отношению к опухолевым клеткам, а не нормальных клеток, таких как эритроциты человека [4, 15]. Кроме того, ACPS также были проверены, чтобы иметь возможность преодолеть механизм множественной лекарственной устойчивости, а также синергетический эффект в комбинированной терапии [11].
<Р> HPRP-A2 обладает быстрым и широким спектром противоопухолевой активности, однако, некоторые различия также возникают в чувствительности HPRP-A2 на различные клеточные линии. На основе различных IC <суб> 50 значения для HPRP-A2 до BGC-823 (8,65 ± 0,38 мкМ), SGC-7901 (10,42 ± 0,30 мкМ), PC3 (21,38 ± 0,56 мкМ) и B16 (19.16 ± 0,38 мкМ ), мы выбрали BGC-823 и SGC-7901 клеток в качестве научно-исследовательских целей. Кроме того, противоопухолевые деятельность HPRP-A2 на другие линии раковых клеток, таких как HeLa и HepG2 были опубликованы в нашей предыдущей работе [12]. Оба BGC-823 и SGC-7901 клетки принадлежат к желудочным клеточных линий, таким образом, мы выбрали BGC-823 в качестве примера для исследования механизма противоракового из HPRP-A2 в пробирке
.

В данном исследовании мы показали, что HPRP-A2 представляет собой амфипатический α-спирального пептида со значительной противораковой активностью к BGC-823 и SGC-7901 клеточных линий. Наши исследования показали, что HPRP-A2 демонстрировали токсичность рака селективным, главным образом потому, что раковые клетки состоят из более анионных фосфолипидов и содержат O-гликозилированного муцина, что увеличивает отрицательный заряд на поверхности раковых клеток [16, 17]. Кроме того, все больше микроворсинки на раковые клетки могут повышать концентрацию связывающего пептида путем расширения поверхности мембраны и, таким образом, показывают сильную цитотоксичность против раковых клеток мембран [11, 18].

ACPS способны к разрушению клеточной мембраны, которая может вызывают изменения проницаемости клеточных мембран. В этом исследовании было отмечено изменение клеточной мембраны КУП-823 путем обнаружения PI-пермеабилизации и высвобождение ЛДГ. Постепенное увеличение П. И. пермеабилизации и выпуска ЛДГ в концентрационно-зависимых способами после обработки HPRP-A2. Кроме того, HPRP-А2-индуцированной гибели клеток связано с генерацией активных форм кислорода, деполяризации ММР, активации каспазы деятельности и блока в фазе G1 клеточного цикла.
<Р> В дополнение к цитотоксичность HPRP-A2, мы доказали, что это может повысить эффективность DOX против BGC-823 и SGC-7901 клеток, что согласуется с нашим предыдущим исследованием. В нашем предыдущем исследовании, мы исследовали комбинационный противораковой терапии с использованием α-спиральные пептиды HPRP-А1 и А2-HPRP с химическими препаратами DOX и EPI в клеточных линиях HeLa и HepG2 [12]. Синергетический показано разрешает использование относительно низких концентраций пептидов и лекарственных средств для достижения значительных противоопухолевый эффект в пробирке
и В естественных условиях
. Это сводит к минимуму снижение дозы препарата побочные эффекты на нормальные клетки, а также позволяет эффективно апоптоз-опосредованного противораковый эффект. Наше Настоящее исследование имеет значение в этом HPRP-A2 может стать многообещающим противораковым терапевтическим средством с высокой противоопухолевой селективностью и сильный синергетический эффект в комбинированной терапии. Наши исследования в основном иллюстрируют механизм HPRP-A2-индуцированной гибели клеток и могут быть полезны при проектировании химиопрепаратов против желудочных клеточных линий.

Выводы
<р> HPRP-A2 показывает сильную противоопухолевую активность в BGC- 823 и SGC-7901 клеточные линии и низкая токсичность в отношении человека красных кровяных телец. HPRP-A2 индуцированного рака гибель клеток как через прямой мембраной разрушительное действие и внутриклеточных механизмов, в том числе резкое увеличение каспазы-3, -8 и -9 активации, снижение митохондриального мембранного потенциала (ММР), а также генерации РОС и клеточного цикла в G1. К тому же, HPRP-A2 сильно synergized с DOX для повышения эффективности убийства опухолевых клеток желудка в пробирке
. Наши результаты подчеркивают широкий противораковой потенциал HPRP-A2 и выяснить механизм его действия. Мы считаем, что наделение ПАХ с более эффективными и опухолевые таргетирования свойств откроет новые способы борьбы с раком успешно.

• PLoS ONE: Intra-Опухолевый Неоднородность HER2, FGFR2, CMET и ATM в рака желудка: Оптимизация персонализированное здравоохра…
• PLoS ONE: Количественное йодного Содержание жировой ткани окружающий пищеварительный тракт с помощью двухэнерг…