Plos ONE: In vitro Karakterizacija hitrega citotoksičnosti proti raku peptid HPRP-A2 skozi membranski uničevanje in celično mehanizma proti želodca rakave celične linije

Povzetek

V tej študiji, HPRP-A2, sintetični 15-mer kationski peptidi z vsemi D-amino kislin, ki učinkovito inhibira preživetje linij želodčnih celic na način, odvisen od doze. Želodčne tumorske celice ubijanje jih HPRP-A2 vključuje hiter propad celovitosti membrane in znotrajceličnih poti. Propidijevim jodidom (PI) in laktat dehidrogenaze (LDH) testi pokazali, da eno uro zdravljenje z HPRP-A2 privedlo do sprememb membranske prepustnosti BGC-823 celic na način, ki je odvisen od odmerka. Poleg tega HPRP-A2 inducirano apoptozo v 823 BGC celicah gre za izrazito povečanje proizvodnje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS), kaspaze-3, -8 in -9 aktivacija, zmanjšanje membranskega potenciala mitohondrijev (MMP), in celični cikel aretacija v G1 fazi. Poleg tega, da svoje naravne citotoksičnosti, HPRP-A2 močno synergized z doksorubicinom (DOX) povečati učinkovitost ubijanje želodčne tumorske celice i n vitro
. Menimo, da bi bilo HPRP-A2 z vsemi D-amino kislin močan kandidat proti raku terapij, še posebej v kombinaciji

Navedba. Zhao J, Hao X, Liu D, Huang Y, Chen Y (2015 ) in vitro
Karakterizacija hitro citotoksičnost proti raku peptid HPRP-A2 skozi membranski uničevanje in mehanizma intracelularnega proti želodca rakave celične linije. PLoS ONE 10 (9): e0139578. doi: 10,1371 /journal.pone.0139578

Urednik: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES

Prejeto: 2. julij 2015; Sprejeto: 15. september 2015; Objavljeno: 30. september 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v prispevku

Financiranje:. Ta študija je bila podprta z National Natural Science Foundation Kitajske (št 81373445, YXC in številka 21442001, YBH) in naravoslovni fundacija province Jilin (št 20150101189JC , YC in št 20140101042JC, YBH). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

v zadnjih desetletjih, čeprav so bili doseženi preboj pri razvoju raka terapij, odpornost in nespecifične strupenosti konvencionalnih zdravil še vedno vprašanja, steklenice vratu za morebitne klinične prakse [1-3]. Zato je nujno potreben za razvoj novih zdravil, z različnimi načini delovanja, ki lahko odpravi pomanjkljivosti številnih razpoložljivih zdravil.

Trenutno potencialne aplikacije peptidov proti raku (AKP), kot terapevtska sredstva za zdravljenje raka napredovanje pritegnejo več pozornosti kot konvencionalno kemoterapijo, predvsem zaradi naslednjih lastnosti: (1) z visoko specifičnostjo. Pozitivno nabite peptidi selektivno ciljanje rakavih celic, ki prenašajo negativne naboje in imajo različne komponente membrane iz normalnih celic [4, 5], (2) novega načina delovanja. To se izogibajo bi vzpostavila mehanizme multidrug uporom [7/5]; (3) sinergijski učinek proti raku z kemoterapevtiki. Ugotovljeno je bilo, da lahko nekatere ACP proizvajajo sinergistično proti raku dejavnost, ko kombinirano uporabo z različnimi običajnimi zdravili proti raku [8-10].

Splošna mehanizem-peptida povzroča celične smrti motnje citoplazemske membrane preko micelizacija oziroma tvorbe por čeprav so nekateri ACP poročali za sprožitev apoptoze po smrti receptorja poti in /ali mitohondrijske poti [8, 11]. Poleg tega je lahko nastanek por v celični membrani in spremembo prepustnosti membrane zagotavlja boljši kanal za vstop drugimi zdravili proti raku zdravil v celice in okrepiti svoje dejavnosti proti raku [8, 12].

Naša prejšnjo raziskavo se je izkazalo, da lahko HPRP-A2 povzroči smrt celic in hkrati okrepiti DOX /epirubicin (EPI) inducirano apoptozo v HeLa in HepG2 celičnih linij [12]. Poleg tega je zaradi sestave D-amino kisline, HPRP-A2 je odporen na proteolitično cepitev in ohrani enakovredna aktivnosti proti raku s svojim L enantiomerov [6, 12]. Na podlagi predhodnih študij, želimo doseči dva cilja v tej študiji: k določitvi osnovnega mehanizma proti raku HPRP-A2 in preučevanje sinergistični proti raku učinek na BGC-823 in SGC-7901 celic v kombinaciji HPRP-A2 s DOX.

materiali in metode

celične linije in celična kultura

človekove želodca rakave celične linije BGC-823 in SGC-7901 so bili pridobljeni iz American Type Culture Collection, ki potrdi celico proge po kratkih tandemskih testiranje ponavljanje DNK, so bile uporabljene v 6 mesecih oživljanje in gojimo v DMEM z fetalni goveji serum (FBS, 10% v /v), penicilin (100 U /ml) in streptomicinom (100 ie /ml) v vlažni atmosferi pri 37 ° C s 5% CO _2.

sinteza peptida in očiščevanje

peptid sintetiziramo s peptidno sintezo v trdni fazi ob uporabi Fmoc (9-fluorenil -methoxycar-karbonil) kemije, kot je prej opisano [13]. Nadalje karakterizacija bila odkrita z masno spektrometrijo in analizo amino kislin. DOX · HCl je bila kupljena od Meilun Biology Technology Co, Ltd (Dalian, Kitajska).

viabilnosti celic testi

BGC-823 in SGC-7901 celice (5 × 10 ^{3) smo nanesli v treh izvodih v 96 vdolbinami mikrotitrskih ploščah. Popoln medij zamenjati po 24 urah z 100 ul svežega medija, ki vsebuje različne koncentracije droge. Po nadaljnjih 24 urah smo celice inkubirali z 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolom bromid (MTT) pri 37 ° C 4 ure. Nato dodamo dimetilsulfoksid (DMSO), da se raztopi formazana kristalov in absorbance pri 492 nm smo merili z bralnikom mikroploščnem (GF-M3000; Gaomi CaiHong analitičnih instrumentov Co, Shandong, Kitajska). Jin formula je bila uporabljena za nadaljnjo količinsko sinergijski učinek zdravljenja kombinaciji z HPRP-A2 in DOX. Formula je: Q = Ea + b /(Ea + Eb-Ea × Eb), kjer je Q indeks kombinacija; Ea + b predstavlja proliferacije celic stopnja inhibicije kombiniranega zdravila; Ea in Eb znaki celične proliferativne stopnjo zaviranja vsake droge. Po izračunu. Q < 0,85, Q > 1,15 in 0,85 < Q < 1.15 kažejo, antagonizem, sinergija in aditiven učinek, oziroma [14]
analiza}

hemolizo dejavnost test

hemolizo dejavnost je bila izvedemo kot je opisano zgoraj [13]. Da dobimo rdečih krvnih celic, je bila svežo človeško kri stabilizirana z EDTAK centrifugirali pri 1.000 obratih 5 minut, dvakrat speremo s PBS in razredčimo do končne koncentracije 2% v PBS. 70 xl od 2% človeških eritrocitov dodamo k okroglim dnom 96 vdolbinicami, čemur sledi 70 p.L različnih koncentracij HPRP-A2. Po inkubaciji pri 37 ° C za 1 uro, je bilo ploščo nato centrifugirali pri 3.000 obratih na minuto za 10 minut in 90 xl supernatanta smo prenesli z ravnim dnom in 96-vdolbinami. Sprostitev hemoglobina smo določili z merjenjem absorbance supernatanta pri 540 nm. Eritrociti v PBS in destilirano vodo (dH _{2O) so bili uporabljeni kot negativnih in pozitivnih kontrol oz. Hemolitičnega aktivnost je bila izračunana kot odstotek eksperimentalni skupini in pozitivne kontrole, po odštetju negativno kontrolo oz. Podatki so povprečje ± SD treh neodvisnih poskusov.}

PI test

BGC-823 celice (1 x 106 celic /dobro) smo posejali v šestih vdolbinami. Po inkubaciji s HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) za 1 h, smo celice zbrali in nato obdelamo s 5 ug /ml PI pri 4 ° C za 10 minut v temi. Celice smo sprali s PBS za trikrat in nato zazna Intenziteta fluorescence PI uporabo citometrije tok (FACSCalibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, ZDA).

LDH javnost

LDH javnost aktivnost smo merili z LDH testa komplet (Jiancheng Bioengineering, Ltd., Kitajska), v skladu z navodili proizvajalca. BGC-823 celice smo posejali na 5 x 10 ^{3 celic /tudi v 96 vdolbinami. Po inkubaciji z HPRP-A2 (5, 10, 15 iM) za 1 h, je sproščanje LDH v supernatanta merjeno z bralnikom mikroploščnem (GF-M3000; Gaomi CaiHong Analytical Instruments Co., Ltd. Shandong, Kitajska), v 450 nm. Celice brez zdravljenja ali liziramo s Triton X-100 smo uporabili kot negativne in pozitivne kontrole oz. Vse poskuse smo izvedli v treh izvodih. LDH dejavnost je bila izračunana kot odstotek eksperimentalni skupini in pozitivne kontrole, po odštetju negativne kontrole oz.}

ROS test

ROS test kit (BestBio, Co. Šanghaj, Kitajska), je bila uporabljena za odkriti nastajanje ROS. Celice (1 x 106) smo obdelali z HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) 1 uro. Poznejši postopki so bili izvedeni v skladu s protokolom proizvajalca. Na kratko smo celice s tripsinom razgrajene centrifugiramo pri 1500 obratih na minuto za 3 minute, izperemo trikrat s PBS in nato suspendiramo v 500! Li PBS. Po inkubaciji z 2 ', 7'-dichlorofluorescin diacetat (DCFH-DA) fluorescentno sondo za 20 min pri 37 ° C, smo celice izperemo s PBS trikrat zaznan in zeleno intenzitete fluorescence (v GEOMEAN) s pretočno citometrijo. Zeleno Intenziteta fluorescence je bila v pozitivni korelaciji s stopnjo ROS.

Merjenje MMP

MMP je bila določena z morebitno komplet preskusnega mitohondrijske membrane z 5,5 ', 6,6'-tetrakloro -1,1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodid (JC-1), ki je sonda mitohondrijske aktivnosti (BestBio, Co., Šanghaj, Kitajska). JC-1 se vedno uporablja za odkrivanje mitohondrijske depolarizacijo, ki se pojavljajo v zgodnjih fazah apoptoze. Ko celice z visoko MMP, JC-1 zbrali v mitohondrijski matrico, tvorijo J-agregate in proizvajajo rdeče fluorescence. Nasprotno, celice, ki vsebujejo JC-1 monomera monomera monomermonomer imajo nizko MMP in pokazati zeleno fluorescenco. Mitohondrijski depolarizacija je bila določena z zmanjšanjem rdeče (590 nm, FL-2-kanalni) /zeleno (530 nm, FL-1 kanal) razmerje intenziteta fluorescence. Na kratko, po zdravljenju z HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) za 1 uro, je bilo BGC-823 celice zberemo in inkubiramo z 0,5 ml JC-1 delovne raztopine za 20 minut pri 37 ° C, nato dvakrat sprali s PBS, suspendiramo v PBS, in analizira citometrije pretoka (FACSCalibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, ZDA).

kaspazne aktivnosti test

Celice smo obdelali s HPRP-A2 (10, 15 LM) za 24 ur in nato ravneh kaspaze dejavnosti so bile izmerjene z uporabo ustreznih kompletov za odkrivanje kaspaze dejavnosti (BestBio, Co, Šanghaj, Kitajska), v skladu z navodili proizvajalca. Povprečni podatki so prikazani kot povprečje ± SD vsaj treh neodvisnih poskusih.

Cell ciklusu

BGC-823 celice (1 x 10 ^{6) smo posejali v 6-dobro plošče za 24 ur. Po indukciji z HPRP-A2 (5, 10, 15 uM) za 24 ur, je porazdelitev celični cikel določimo z FACSCAN citometrom in celično iskanju programski (FACS Calibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, ZDA). Vse poskuse smo izvajali v treh izvodih.}

Statistična analiza

Podatki so prikazani kot sredstva ± SD treh neodvisnih določitev. Statistična pomembnost razlik med skupinami smo analizirali s t
-test, s pomen sprejeta na P
< 0.005 (*) in P
< 0.001 (**).

Rezultati

peptidov in citotoksičnost

Kot je prikazano na sliki 1, peptid HPRP-A2 je 15-ostanek α-vijačnice amfipatičnega membrane aktivna peptid sestavljen iz vseh D-amino kislin. Primerjava selektivno toksičnost HPRP-A2 do želodca raka in normalnimi celicami (človeških rdečih krvnih celic), lahko z lahkoto našli, da je IC _{50 (koncentracija droge, na kateri je viabilnost celic zmanjšala za 50% v primerjavi z neobdelano celice) vrednosti so precej manj od minimalne hemolitično koncentracije (v koncentracijo zdravila, ki je povzročilo 20% celic hemolize) v HPRP-A2. Ti rezultati so pokazali, da lahko HPRP-A2 selektivno ubiti želodčne rakave celice in rezervni normalne celice (sliki 2 in 3). Podobne aktivnosti proti raku obeh celičnih linijah (BGC-823 in SGC-7901), je pokazala, da je bil učinek širokega spektra ukrepov proti raku v HPRP-A2. Zaradi svoje membransko aktiven lastnost, HPRP-A2 kaže proti raku terapevtski potencial, saj je bolj selektivno toksičen do tumorskih celic od normalnih celic.}

HPRP-A2 povzroča krepitev membrane prepustne

da bi preverili spremembo membranskega prepustnosti po inkubaciji z HPRP-A2, celični privzem PI in zunajcelični sproščanje LDH so raziskovali s pretočno citometrijo in mikroploščnem čitalniku proti BGC-823 celic. Kot je prikazano na sliki 4, je pretočno citometrijo grafi PI premikanje postopoma smeri visoke intenzitete fluorescence v odvisnosti od koncentracije in opazili tudi povečano sproščanje LDH v celicah inkubiranih z HPRP-A2. To se pravi, HPRP-A2 lahko povzroči poškodbe celične membrane in povzroči izboljšanje celične membrane prepustnost.

HPRP-A2 povzročil škodo mitohondrijske funkcije

Medcelična reaktivnega kisika vrste (ROS) sprostitev in membranski potencial mitohondrijev (MMP), so bile odkrite z FACS odraža funkcijo mitohondrijih BGC-823 celic in vitro
. Kot je prikazano na sliki 5A je pretočno citometrijo histogram celic inkubiranih z višjo koncentracijo HPRP-A2 pokazala višjo intenziteto fluorescence po inkubaciji za 1 uro. Ustrezna pretočno citometrijo količinsko primerjavo intenzitete fluorescence pri GEOMEAN na teh različnih koncentracijah pokazala podoben trend, in sicer da je povečana sproščanje ROS v BGC-823 celic v prisotnosti HPRP-A2 odvisen od koncentracije. Podobno odvisen od koncentracije spreminja trend je bilo opaziti tudi na sliki 5B, razmerje FL2-H /FL1-H izrazito zmanjšala, kar kaže na depolarizacijo od MMP.

aktivacija kaspazne in celični cikel analiza

aktivacija kaspaze-3, -8 in -9 v HPRP-A2-induciranih celic smo izmerili ob uporabi z mikroploščnem čitalniku pri 405 nm. Kot je prikazano na sliki 5C, kaspaze-3 -8 in -9 bili vsi povečala po zdravljenju s HPRP-A2 24 h pri BGC-823 celicah, kar kaže, da je lahko indukcija apoptoze, ki ga HPRP-A2 kaspaze odvisni . Kot je prikazano na sliki 6, BGC-823 celice obdelamo z različnimi koncentracijami HPRP-A2 (5, 10, 15 uM), za 24 ur povzročilo povišanja v sub-G1 prijetje in G1 aretacijo. Te ugotovitve okrepila tudi povečano kaspaze-3 aktivnosti po zdravljenju HPRP-A2.

HPRP-A2-povzroča povečanje DOX citotoksičnosti

BGC-823 in SGC-7901 celice so bili izbrani za preuči sinergistično proti raku učinek HPRP-A2 in kemoterapevtik drog DOX. Celice smo obdelali z HPRP-A2 (6 uM) in /ali dox (1,6 mg /ml) za 4, 24 in 48 ur. MTT testi so bili uporabljeni za ovrednotenje kombinacijskimi proti raku učinke na celice. Koncentracije drog, izbranih v tej študiji je temeljila na IC _{50 vrednosti samo posamezne droge. Ni očitne citotoksičnosti ali rast zmanjšanje, ko je bil vsak drog uporablja samostojno. V nasprotju s tem, ko se uporablja v peptidnih /kombinacije drog (HPRP-A2 /dox) pri enakih odmerkih, ki se uporablja samostojno, kombinacija razstavljena pomembno citotoksičnost (slika 7). Jasno je tudi, da antikarcinomsko aktivnost HPRP-A2 ni bil s časom inkubacijsko precej prizadela; V nasprotju s povečanjem časa inkubacijski do 48 h, DOX kaže veliko večjo aktivnost proti raku, kot jo ima 4 h, kar kaže na močno različne mehanizme delovanja med AKP in kemoterapevtskega zdravila. Po Jin formuli so vse vrednosti Q (kombinacija indeks) večja od 1,15, kar pomeni, da so bili pomembni sinergijski učinki med a-spiralni peptida HPRP-A2 in konvencionalne zdravila proti raku DOX v BGC-823 in SGC-7901 celic .}

Pogovor

proti raku peptidi (AKP), pred kratkim so prejeli veliko pozornosti kot obetavne kemoterapevtiki, ki se izogibajo pomanjkljivosti sedanjih zdravil. Številne študije so potrdili, da so nekateri sintetični in naravni kationski peptidi imajo hiter in širok spekter delovanja proti raku do tumorskih celic, ne pa normalnih celic, kot so človekove rdečih krvnih celic [4, 15]. Poleg tega so bile ACP preveri tudi, da imajo sposobnost za premagovanje mehanizem za multiplo odpornost in sinergijske učinke v kombinaciji z drugimi zdravili [11].

HPRP-A2 ima hiter in širok spekter delovanja proti raku pa nekatere razlike prav tako se pojavljajo pri občutljivosti HPRP-A2 na različnih celičnih linijah. Na podlagi različnih IC _{50 vrednosti za HPRP-A2 do BGC-823 (8,65 ± 0,38 uM), SGC-7901 (10,42 ± 0,30 LM), PC3 (21,38 ± 0,56 LM) in B16 (19,16 ± 0,38 uM ), smo se odločili BGC-823 in SGC-7901 celice so raziskovalne cilje. Poleg tega so bile aktivnosti proti raku v HPRP-A2 na drugih progah rakavih celic, kot so HeLa in HepG2 objavljena v prejšnjem dokumentu [12]. Oba BGC-823 in SGC-7901 celic spadajo v celičnih linijah želodca, zato smo izbrali BGC-823 kot primer, da razišče mehanizem proti raku HPRP-A2 in vitro
.}

v tej raziskavi smo pokazali, da je HPRP-A2 amfipatičnega α-vijačni peptid s pomembno aktivnost proti raku z BGC-823 in SGC-7901 celičnih linij. Naše raziskave so pokazale, da HPRP-A2 razstavljene toksičnost za raka selektiven, predvsem zato, ker se da rakave celice sestavlja več anionskih fosfolipidov in vsebuje O-glikoziliran mucin, ki povečuje negativni naboj na rakave celice površini [16, 17]. Poleg tega se lahko več microvilli na rakavih celicah poveča koncentracijo vezave peptida z razširitvijo membrane površino in s tem kažejo večjo citotoksičnost proti raku celične membrane [11, 18].

ACP so sposobni motenj celične membrane, ki se lahko povzroči celične membrane spremembe prepustnosti. V tej študiji je bila sprememba BGC-823 celične membrane opazili z odkrivanjem PI permeabilizacijo in sprostitev LDH. Se postopno povečuje od PI permeabilizacijo in sproščanje LDH v načine koncentracije odvisni po zdravljenju z HPRP-A2. Poleg tega HPRP-A2-inducirano celična smrt je povezana z nastajanjem reaktivnih kisikovih zvrsti, na depolarizacijo MMP, aktiviranja dejavnosti kaspaznih in blok v G1 fazi celičnega cikla.

Poleg tega, da citotoksičnost HPRP-A2, smo dokazali, da lahko poveča učinkovitost DOX proti BGC-823 in SGC-7901 celic, ki je v skladu z našo prejšnje študije. V naši prejšnji študiji smo raziskali kombinacijske terapijo proti raku, z uporabo α-spiralnimi peptide HPRP-A1 in HPRP-A2 z kemičnih drog dox in EPI v HeLa in HepG2 celičnih linij [12]. Sinergija pokazala dovoljuje uporabe relativno nizke koncentracije peptidov in zdravil za doseganje pomembnih proti raku učinke in vitro
in in vivo
. To zmanjšanje odmerka zmanjšuje droge stranske učinke na normalne celice in omogoča učinkovito-apoptozo posredovane učinek proti raku. Naša ta študija vpliva v tej HPRP-A2 lahko postane obetaven proti raku terapevtsko sredstvo z visoko selektivnostjo proti raku in močan sinergijski učinek pri kombiniranem zdravljenju. Naše raziskave večinoma prikazujejo mehanizem HPRP-A2-inducirane celične smrti in je lahko v pomoč pri oblikovanju kemoterapevtiki proti celičnih linij želodca.

Sklepi

HPRP-A2 kaže na močno aktivnost proti raku na BGC- 823 in SGC-7901 celične linije in nizka strupenost proti človeških rdečih krvnih celic. HPRP-A2 raka povzročajo smrt celic tako prek neposrednih membransko-destruktivni učinek in znotrajceličnih mehanizmov, vključno z dramatičnim povečanjem kaspaze-3, -8 in -9 aktivacije, zmanjšanje mitohondrijski membranski potencial (MMP), in za ustvarjanje ROS in zaustavitev celičnega cikla v G1. Poleg tega HPRP-A2 močno synergized z dox za povečanje učinkovitosti ubijanja želodčne tumorske celice in vitro
. Naši rezultati poudarjajo širok potencial proti raku HPRP-A2 in pojasnjevanju svojega mehanizma delovanja. Verjamemo, da bo dokapitalizacijo AKP z učinkovitejšimi in tumorskih ciljanje lastnosti odpirajo nove načine za boj proti raku uspešno.

• Plos ONE: znotraj tumorskih Heterogenost HER2, FGFR2, cMet in ATM želodčnega raka: Optimizacija osebno zdravstveno nego z inovativno patološko in statistični Analysis
• Plos ONE: Kvantifikacija joda Vsebina Perigastric maščobnega tkiva, ki ga Dual-Energy CT: novo metodo za predoperativno diagnozo T4-Stage želodca Cancer