PLOS ONE: caracterización in vitro de la citotoxicidad de rápido contra el cáncer Péptido HPRP-A2 a través de la membrana y la destrucción intracelular Mecanismo contra celulares de cáncer gástrico Lines

Extracto

En este estudio, HPRP-A2, un 15-mero sintético péptidos catiónicos con todos los D-aminoácidos, inhibieron eficazmente la supervivencia de las líneas de células gástricas de una manera dependiente de la dosis. matando a las células tumorales gástricas por HPRP-A2 implica un rápido colapso de la integridad de la membrana y vías intracelulares. El yoduro de propidio (PI) y los ensayos de lactato deshidrogenasa (LDH) demostraron que el tratamiento de una hora con HPRP-A2 condujo a cambios en la permeabilidad de la membrana de las células BGC-823 de una manera dependiente de la dosis. Por otra parte, la apoptosis inducida HPRP-A2 en las células BGC-823 consiste en un marcado incremento en la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), caspasa-3, -8 y -9 de activación, una reducción del potencial de membrana mitocondrial (MMP), y el ciclo celular arresto en la fase G1. Además de su citotoxicidad inherente, HPRP-A2 sinergizada fuertemente con doxorubicina (DOX) para mejorar la eficacia de la eliminación de células tumorales gástricas i n vitro
. Creemos que HPRP-A2 con todos los D-aminoácidos puede ser un potente candidato de la terapéutica contra el cáncer, especialmente en terapia de combinación

Visto:. Zhao J, Hao X, Liu D, Huang Y, Chen Y (2015 ) in vitro
Caracterización de la citotoxicidad de rápido contra el cáncer péptido HPRP-A2 a través de la membrana y la destrucción intracelular Mecanismo contra líneas celulares de cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (9): e0139578. doi: 10.1371 /journal.pone.0139578

Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos |

Recibido: 2 Julio, 2015; Aceptado: September 15, 2015; Publicado: 30 de septiembre 2015

Derechos de Autor © 2015 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel

Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81373445, YxC y No. 21442001, YBH) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jilin (núm 20150101189JC , YC y Nº 20140101042JC, YBH). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

en las últimas décadas, aunque se han logrado grandes avances en el desarrollo de terapias contra el cáncer, la resistencia y la toxicidad no específica de los fármacos convencionales siguen siendo problemas de cuello de botella para las prácticas clínicas potenciales [1-3]. Por lo tanto, se requiere con urgencia desarrollar nuevos fármacos con diferentes modos de acción que pueden superar las deficiencias de muchos fármacos disponibles
.

Actualmente, las aplicaciones potenciales de péptidos contra el cáncer (ACP) como agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer progresión de atraer más atención que la quimioterapia convencional debido principalmente a las siguientes propiedades: (1) una alta especificidad. Los péptidos cargados positivamente se dirigen selectivamente a células cancerosas que llevan cargas negativas y tienen diferentes componentes de la membrana de las células normales [4, 5]; (2) nuevo modo de acción. Se pudo evitar establecido mecanismos de resistencia a múltiples fármacos [5-7]; (3) efecto anticanceroso sinérgico con agentes quimioterapéuticos. Se ha informado de que ciertos ACPs pueden producir actividad anticancerígena sinérgica cuando se combina el uso con diferentes medicamentos contra el cáncer convencionales [8-10]
.

El mecanismo general de la muerte celular inducida por el péptido es disrupción de la membrana citoplásmica a través de la formación de micelas o la formación de poros , aunque se reportan algunos de los ACP para activar la apoptosis por vía del receptor de muerte y /o vía mitocondrial [8, 11]. Por otra parte, la formación de poros en la membrana celular y el cambio de la permeabilidad de la membrana puede proporcionar una mejor canal para la entrada de otros fármacos contra el cáncer en las células y mejorar sus actividades contra el cáncer [8, 12].

Nuestro estudio anterior ha demostrado que HPRP-A2 puede inducir la muerte de las células y al mismo tiempo una mayor DOX /epirubicina (EPI) apoptosis inducida en líneas celulares HeLa y HepG2 [12]. Además, debido a la composición de ácido D-amino, HPRP-A2 es resistente a la escisión proteolítica y retiene actividades contra el cáncer equivalentes a sus enantiómeros L [6, 12]. Con base en los estudios anteriores, nuestro objetivo es lograr dos objetivos en este estudio: para delinear el mecanismo contra el cáncer subyacente de HPRP-A2 y para investigar el efecto antineoplásico sinérgico sobre BGC-823 y las células SGC-7901 cuando se combina HPRP-A2 con DOX.

Materiales y Métodos

líneas celulares y cultivo celular

líneas celulares de cáncer gástrico humano BGC-823 y SGC-7901 se obtuvieron de la American Type Culture Collection que autentifica la célula líneas de corto tándem repetir la prueba de ADN, se usaron dentro de los 6 meses de la reanimación y se cultivaron en DMEM con suero bovino fetal (FBS; 10% v /v), penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 U /ml) en una atmósfera húmeda a 37 ° C con 5% de CO _2.

síntesis de péptidos y purificación

el péptido se sintetizó mediante la síntesis de péptidos en fase sólida utilizando Fmoc (9-fluorenil ) química-carbonil -methoxycar como se describe anteriormente [13]. Además de la caracterización se detectó mediante espectrometría de masas y análisis de aminoácidos. DOX · HCl se adquirió de Meilun Biología Tecnología Co., Ltd. (Dalian, China).

Ensayos de viabilidad celular

BGC-823 y las células SGC-7901 (5 × 10 ^{3) se sembraron por triplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos. El medio completo fue reemplazado después de 24 h con 100 l de medio fresco que contenía varias concentraciones de fármacos. Después de otras 24 h, las células se incubaron con 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT) a 37 ° C durante 4 h. A partir de entonces se añadió dimetilsulfóxido (DMSO) para disolver los cristales de formazán y la absorbancia a 492 nm se midió con un lector de microplacas (GF-M3000; Gaomi Caihong Analytical Instruments Co., Shandong, China). la fórmula de Jin se utilizó para cuantificar aún más el efecto sinérgico de la combinación de tratamiento de HPRP-A2 y DOX. La fórmula es: Q = Ea + b /(+ Ea Ea Eb-× Eb), donde Q es el índice de combinación; Ea + b representa la tasa de inhibición de la proliferación celular del fármaco combinado; Ea y Eb son signos de la tasa de inhibición de la proliferación celular de cada fármaco. Después del cálculo:. Q < 0,85, Q > 1,15 y 0,85 < Q < 1,15 indican antagonismo, sinergia, y el efecto aditivo, respectivamente [14]
análisis}

actividad hemólisis ensayo

actividad hemólisis era realizado como se describe anteriormente [13]. Para obtener células rojas de la sangre, sangre fresca humana estabilizada con EDTAK se centrifugó a 1000 rpm durante 5 min, se lavó dos veces con PBS y se diluyó a una concentración final de 2% en PBS. 70 l de eritrocitos humanos 2% se añadieron a una placa de 96 pocillos de fondo redondo, seguido por 70 l de diferentes concentraciones de HPRP-A2. Después de incubación a 37 ° C durante 1 h, la placa se centrifugó a continuación a 3.000 rpm durante 10 min y 90 l de sobrenadante se transfirió a una placa de 96 pocillos de fondo plano. La liberación de hemoglobina se determinó midiendo la absorbancia del sobrenadante a 540 nm. Los eritrocitos en PBS y agua destilada (dH _{2O) se utilizaron como controles negativos y positivos, respectivamente. La actividad hemolítica se calculó como el porcentaje de grupo experimental y de control positivo, después de la sustracción de control negativo, respectivamente. Los datos son la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.}

ensayo de PI

células BGC-823 (1 × 106 células /pocillo) se sembraron en placas de seis pocillos. Después de la incubación con HPRP-A2 (5, 10, 15 M) durante 1 h, se recogieron las células y luego tratados con 5 mg PI /ml a 4 ° C durante 10 minutos en la oscuridad. Las células se lavaron con PBS tres veces y luego se detectan la intensidad de fluorescencia de PI mediante citometría de flujo (FACSCalibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.).

liberación de LDH

liberación de LDH la actividad se midió por el kit de ensayo LDH (Jiancheng Bioingeniería, Ltd., china) según las instrucciones de los fabricantes. células BGC-823 fueron sembradas a 5 × 10 ^{3 células /pocillo en una placa de 96 pocillos. Después de la incubación con HPRP-A2 (5, 10, 15 M) durante 1 h, la liberación de LDH en el sobrenadante se midió con un lector de microplacas (GF-M3000; Gaomi Caihong Analytical Instruments Co., Ltd. Shandong, China) a 450 nm. Las células sin tratamiento o se lisaron con Triton X-100 se utilizaron como controles negativos y positivos, respectivamente. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. actividad de la LDH se calculó como el porcentaje de grupo experimental y el control positivo, después de restar el control negativo, respectivamente.}

ROS ensayo

kit de ensayo de ROS (BestBio, Co Shanghai, China) se utilizó para detectar la generación de ROS. Las células (1 x 106) fueron tratados por HPRP-A2 (5, 10, 15 M) durante 1 hora. Los procedimientos posteriores se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, las células digeridas por la tripsina se centrifugaron a 1500 rpm durante 3 min, se lavaron tres veces con PBS y después se suspenden en 500 l de PBS. Después de la incubación con 2 ', 7'-diacetato dichlorofluorescin (DCFH-DA) sonda fluorescente durante 20 min a 37 ° C, las células se lavaron con PBS tres veces y se detectaron la intensidad de fluorescencia verde (en media geométrica) por citometría de flujo. La intensidad de la fluorescencia verde se correlacionó positivamente con el nivel de ROS.

La medición de MMP

MMP se determinó mediante el kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial con 5,5 ', 6,6'-tetracloro -1,1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine yoduro (JC-1), que es una sonda de la actividad mitocondrial (BestBio, Co., Shanghai, china). JC-1 siempre se utiliza para detectar la despolarización mitocondrial se produce en las primeras etapas de la apoptosis. Cuando las células con alta MMP, JC-1 se reunieron en la matriz mitocondrial, formando J-agregados y producir fluorescencia roja. Por el contrario, las células que contienen JC-1 monómero monómero monomermonomer tienen baja MMP y muestran fluorescencia verde. despolarización mitocondrial se determinó por una disminución en el rojo (590 nm, FL-2 canales) /verde (530 nm, FL-1 canal) Relación de intensidad de fluorescencia. En pocas palabras, después del tratamiento con HPRP-A2 (5, 10, 15 M) durante 1 h, se recogieron y se incubaron con 0,5 ml JC-1 solución para 20 min de trabajo a 37 ° C BGC-823 células, después se lavaron dos veces con PBS, suspendida en PBS, y se analizaron mediante citometría de flujo (FACSCalibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.).

actividad de la caspasa ensayo

Las células fueron tratadas con HPRP-A2 (10, 15 M) durante 24 horas y luego los niveles de actividad de caspasa se midió utilizando los kits de detección de actividad de caspasa correspondientes (BestBio, Co., Shanghai, china), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Promedio de los datos se presentan como la media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes.

análisis del ciclo celular

BGC-823 células (1 × 10 ^{6) fueron sembradas en 6 pocillos placas para 24 h. Después de la inducción con HPRP-A2 (5, 10, 15 M) durante 24 h, la distribución del ciclo celular se determinó mediante un citómetro FACScan y software Cell Quest (FACS Calibur, Becton-Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.}

El análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres determinaciones independientes. La significación estadística de las diferencias entre los grupos fueron analizados por t-test
, con un significado aceptado en P Hotel < 0,005 (*) y P Hotel < 0,001 (**).

Resultados

Péptidos y la citotoxicidad

Como se muestra en la figura 1, el péptido HPRP-A2 es un residuo de α-15-helicoidal anfipática activos de membrana péptido compuesto de todos los D-aminoácidos. Al comparar la toxicidad selectiva de HPRP-A2 en dirección a células de cáncer gástrico y las células normales (glóbulos rojos humanos), podemos encontrar fácilmente que el CI _{50 (la concentración de fármaco en la que la viabilidad celular se redujo en un 50% en comparación con los no tratados células) los valores son mucho menores que la concentración hemolítica mínima (la concentración de fármaco que dio lugar a la hemólisis celular 20%) del HPRP-A2. Estos resultados indicaron que HPRP-A2 puede matar selectivamente las células de cáncer gástrico y sobra las células normales (Figs 2 y 3). actividades contra el cáncer similares de las dos líneas celulares (BGC-823 y SGC-7901) indicaron que no había un efecto de amplio espectro en la acción contra el cáncer de HPRP-A2. Debido a su característica de membrana activa, HPRP-A2 muestra el potencial terapéutico contra el cáncer, ya que es más selectivamente tóxico hacia las células tumorales que las células normales.}

HPRP-A2 indujo el aumento de la permeabilidad de la membrana

con el fin de verificar el cambio de permeabilidad de la membrana después de la incubación con HPRP-A2, la captación celular de PI y liberación de LDH extracelular fueron investigados con citometría de flujo y lector de microplacas hacia las células BGC-823. Como se muestra en la figura 4, los gráficos de citometría de flujo de la PI se mueven poco a poco a la dirección de alta intensidad de la fluorescencia de una manera dependiente de la concentración, y el aumento de la liberación de LDH también se observó en las células incubadas con HPRP-A2. Es decir, HPRP-A2 podría causar el daño de la membrana celular y el resultado en la mejora de la permeabilidad de la membrana celular.

HPRP-A2 causó los daños de la función mitocondrial

El oxígeno reactivo intracelular especies (ROS) y la liberación potencial de membrana mitocondrial (MMP) se detectaron con FACS para reflejar la función de las mitocondrias de las células BGC-823 in vitro
. Como se muestra en la figura 5A, el histograma de citometría de flujo de las células incubadas con una concentración más alta de HPRP-A2 reveló la intensidad de fluorescencia más alta después de la incubación durante 1 h. El correspondiente de citometría de flujo comparación cuantitativa de la intensidad de fluorescencia en media geométrica en estos diferentes concentraciones mostró una tendencia similar, es decir, que el aumento de la liberación de ROS en células BGC-823 en presencia de HPRP-A2 era dependiente de la concentración. Similar dependiente de la concentración cambio de tendencia también se observó en la figura 5B, la relación de FL2-H /FL1-H marcadamente disminuido, lo que indica una despolarización de MMP.

La activación de caspasa y el ciclo celular análisis

la activación de la caspasa-3, -8 y -9 en las células inducidas-A2 HPRP se midió utilizando un con un lector de microplacas a 405 nm. Como se muestra en la figura 5C, la caspasa-3, -8 y -9 fueron todos aumentó después del tratamiento con HPRP-A2 durante 24 h en células BGC-823, lo que sugiere que la inducción de apoptosis por el HPRP-A2 puede ser dependiente de caspasa . Como se muestra en la figura 6, BGC-823 células tratadas con las diferentes concentraciones de HPRP-A2 (5, 10, 15 M) durante 24 h dieron como resultado el aumento de la detención sub-G1 y detención en G1. Estos hallazgos también fortalecen el aumento de la actividad caspasa-3 después del tratamiento de HPRP-A2.

inducida por aumento de HPRP-A2 en DOX citotoxicidad

BGC-823 y las células SGC-7901 fueron seleccionados para estudiar el efecto sinérgico anticáncer de HPRP-A2 y fármaco quimioterapéutico DOX. Las células se trataron con HPRP-A2 (6 M) y /o Dox (1,6 g /ml) durante 4, 24 y 48 h. ensayos de MTT se utilizaron para evaluar los efectos contra el cáncer en las células combinacionales. Las concentraciones de los fármacos seleccionados en este estudio se basaron en la IC _{50 valores de cada fármaco solo. No hubo reducción obvia la citotoxicidad o el crecimiento cuando cada fármaco se utiliza solo. Por el contrario, cuando se utiliza en las combinaciones de péptidos /Drug (HPRP-A2 /DOX) en las mismas dosis de ser utilizado por sí solo, la combinación mostró una citotoxicidad significativa (Fig 7). También es claro que la actividad contra el cáncer de HPRP-A2 no fue muy afectada por el tiempo de incubación; Por el contrario, con el aumento del tiempo de incubación a 48 horas, DOX muestra mucho mayor actividad contra el cáncer que la de 4 h, indicando las dramáticamente diferentes mecanismos de acción entre ACP y el fármaco quimioterapéutico. De acuerdo con la fórmula de la Jin, todos los valores de Q (índice de combinación) fueron mayores que 1,15, lo que indica que hubo significativas efectos de sinergia entre el péptido α-helicoidal HPRP-A2 y el fármaco contra el cáncer convencional DOX en BGC-823 y las células SGC-7901 .}

Discusión

péptidos anticancerosos (ACP) recientemente han recibido una gran atención como agentes quimioterapéuticos prometedores que evitan los inconvenientes de los fármacos actuales. Muchos estudios han comprobado que algunos péptidos catiónicos sintéticos y naturales poseen un espectro rápido y amplio de actividad contra el cáncer hacia células tumorales en lugar de las células normales como las células rojas de la sangre humanas [4, 15]. Por otra parte, los ACP también se verificaron tener capacidad para superar el mecanismo de resistencia a múltiples fármacos, y los efectos sinérgicos en el tratamiento de combinación [11].

HPRP-A2 posee un espectro rápido y amplio de actividad contra el cáncer, sin embargo, algunas diferencias también se producen en la sensibilidad de la HPRP-A2 a diferentes líneas celulares. Sobre la base de los distintos IC _{50 valores para HPRP-A2 a BGC-823 (8,65 ± 0,38 M), SGC-7901 (10,42 ± 0,30 M), PC3 (21,38 ± 0,56 M) y B16 (19,16 ± 0,38 M ), se optó por BGC-823 y las células SGC-7901 como objetivos de investigación. Además, las actividades contra el cáncer de HPRP-A2 a otras líneas celulares de cáncer tales como HeLa y HepG2 se han publicado en nuestro trabajo previo [12]. Ambos BGC-823 y las células SGC-7901 pertenecen a las líneas de células gástricas, por lo tanto, se seleccionaron BGC-823 como un ejemplo para investigar el mecanismo contra el cáncer de HPRP-A2 in vitro
.}

en este estudio, hemos demostrado que HPRP-A2 es un péptido α-helicoidal anfipática con actividad anticancerígena significativa de líneas celulares de SGC-7901 BGC-823 y. Nuestros estudios han indicado que HPRP-A2 exhibió una toxicidad cáncer selectivo, principalmente debido a que las células cancerosas se componen de fosfolípidos aniónicos y contienen mucina O-glicosilada, lo que aumenta la carga negativa en la superficie de células de cáncer [16, 17]. Por otra parte, más microvellosidades en células cancerosas pueden aumentar la concentración de péptido de unión mediante la ampliación de la superficie de la membrana y por lo tanto muestran citotoxicidad más fuerte contra las membranas celulares de cáncer [11, 18].

ACPs son capaces de alterar la membrana celular, que puede causar cambios en la permeabilidad de la membrana celular. En este estudio, se observó el cambio de la membrana celular BGC-823 mediante la detección de PI-permeabilización y la liberación de LDH. Los aumentos graduales de PI y la permeabilización de la liberación de LDH son de maneras dependientes de la concentración después del tratamiento con HPRP-A2. Por otra parte la muerte celular, inducida por HPRP-A2 está asociada con la generación de especies reactivas de oxígeno, la despolarización de MMP, la activación de las actividades de caspasa y el bloque en la fase G1 del ciclo celular.

Además de la citotoxicidad de HPRP-A2, que demostró que podría aumentar la eficacia de DOX contra BGC-823 y las células SGC-7901, que es consistente con nuestro estudio anterior. En nuestro estudio anterior, hemos explorado la terapia contra el cáncer combinacional utilizando péptidos α-helicoidales HPRP-A1 y A2-HPRP con las drogas químicas DOX y PAI en líneas de células HeLa y HepG2 [12]. La sinergia se muestra permite el uso de concentraciones relativamente bajas de péptidos y fármacos para lograr efectos anticancerígenos significativos in vitro
y in vivo
. Esta reducción de la dosis de la droga minimiza los efectos secundarios sobre las células normales y permite un efecto eficaz contra el cáncer apoptosis mediada. Nuestro presente estudio tiene implicaciones en la que HPRP-A2 puede convertirse en un agente terapéutico contra el cáncer prometedor contra el cáncer con alta selectividad y fuerte efecto sinérgico en la terapia de combinación. Nuestros estudios ilustran principalmente el mecanismo de la muerte celular inducida por HPRP-A2 y pueden ser útiles en el diseño de productos quimioterapéuticos contra líneas de células gástricas.

Conclusiones

HPRP-A2 muestra una fuerte actividad contra el cáncer de BGC- 823 y SGC-7901 líneas celulares y baja toxicidad contra los glóbulos rojos humanos. HPRP-A2 muerte de células cancerosas inducida por tanto a través de un efecto directo de la membrana destructivo y mecanismos intracelulares, incluyendo un aumento dramático en la caspasa-3, -8 y -9 de activación, una reducción del potencial de membrana mitocondrial (MMP), y la generación de ROS y la detención del ciclo celular en G1. Además, HPRP-A2 sinergizada fuertemente con DOX para mejorar la eficacia de la eliminación de células tumorales gástricas in vitro
. Nuestros resultados ponen de relieve el amplio potencial contra el cáncer de HPRP-A2 y dilucidar su mecanismo de acción. Creemos que dotar a los ACP con propiedades más eficaces y de metas tumorales abrirá nuevas formas de combatir el cáncer con éxito.

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