Plos ONE: Naj-7 MicroRNA Family selektivno Izločeni v zunajcelični okolje preko eksozomov, prostazomov v celični liniji metastatskega želodca raka

Povzetek

Ozadje

eksozomov, prostazomov igrajo pomembno vlogo pri komuniciranju mobilni-to-celici, ciljanje celice prenese exosomal molekule, vključno z beljakovinami, mRNA in microRNAs (miRNAs), ki se endocytosis- kot pot. miRNAs so majhne nekodirano RNA molekule v povprečju 22 nukleotidov, ki uravnavajo številne biološke procese, vključno z rakom patogenezo in posredujejo gen down-regulacije z usmerjanjem mRNK za indukcijo degradacije RNA in /ali motenje s prevodom. Nedavna poročila kažejo, da se miRNAs lahko trajno odkriti v obtoku plazme in seruma, saj se miRNAs zapakira eksozomov, prostazomov jih je treba varovati pred degradacijo RNA. Tako, profiliranje exosomal miRNAs so potrebo po razjasnitvi medcelično signaliziranje in odkrili označevalec nov bolezni, kot dobro.

Metodologija /Glavne ugotovitve

eksozomov, prostazomov smo izolirali iz kultiviranih raka celičnih linij in je bila potrjena njihova kakovost z analizami transmisijsko elektronsko mikroskopijo in zahodni blot. Eden izmed celičnih linij testiranih, metastatski želodčni rak celične linije, AZ-P7a, je pokazala najvišjo RNA donos sproščenih eksozomov, prostazomov in značilne oblike v morfologijo. Poleg tega so RNA izolirali iz celic in gojišč, in profilov teh treh miRNA frakcije so bili pridobljeni s pomočjo analize mikromrež. S primerjavo intenzivnosti signala podatkov mikromrež in naslednje potrditve s pomočjo analize RT-PCR, smo ugotovili, da naj-7 miRNA družina je bogat tako v znotrajceličnih in zunajceličnih frakcij od AZ-P7a celic, medtem ko nizko metastatskega AZ-521, starševske celice linija AZ-P7a, kot tudi drugih raka celičnih linijah ni pokazala takšno nagnjenje.

Sklepi /Pomen

obogatitev oddajal-7 miRNA družine v zunajceličnih frakcij, še posebej v eksozomov, prostazomov iz AZ-P7a celic lahko izražajo svoje onkogeni značilnosti, vključno tumorigeneze in metastaz. Ker dajmo-7 miRNAs glavnem igrajo tumor-omejevalno vlogo ciljnih onkogeni kot RAS
in HMGA2
, naši rezultati kažejo, da AZ-P7a celice javnost pusti-7 miRNAs preko eksozomov, prostazomov v zunajcelični okolje, da ohranijo svoje onkogenezo

Navedba. Ohshima k, Inoue k, Fujiwara A, Hatakeyama k, Kanto k, Watanabe Y, et al. (2010) Naj-7 MicroRNA Family selektivno Izločeni v zunajcelični okolje preko eksozomov, prostazomov v celični liniji metastatskega želodca raka. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10,1371 /journal.pone.0013247

Editor: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Nemčija

Prejeto: April 14, 2010; Sprejeto: 10. september, 2010; Objavljeno: 8. oktober 2010

Copyright: © 2010 Ohshima et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Delo je podprla z nepovratnimi sredstvi v sodelovanju z inovativno tehnologijo in naprednih raziskav v evolucijskih prostora (CITY AREA) od Ministrstva za izobraževanje, kulturo, šport, znanost in tehnologijo Japonske. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

celice izločajo različne vrste malih membranskih mehurčkov. Eksozomov, prostazomov eden izmed mešičkov s 30-100 premera nm in fizikalno-kemijsko razlikuje od drugih izločajo veziklov [1]. Inside eksozomov, prostazomov, celični genski produkti, vključno z beljakovinami, mRNA in microRNAs (miRNAs) so pakirani in te molekule se lahko prenesejo prejemnikom celic, da poda svojo molekularno signalizacijo kot onkogenezo [2] - [4] in imunski odziv [1], [ ,,,0],5]. Eksozomov, prostazomov se sproščajo veliko vrst celic [6], ki vključujejo tumorske celice, epitelijskih celic in hemopoetičnih celice kot retikulocitov, citotoksičnih limfocitov T, celice B virusom transformirana Epstein-Barr mastocitov, dendritičnih celic in trombocitov. Izločajo eksozomov, prostazomov so izolirali in karakterizirali in vitro
iz kultiviranih celičnih linij [7] skupaj z in vivo
v telesnih tekočinah [7], vključno s krvjo [8], urin [9], sline [10], plodovnica [11], in maligni plevralni izlivi [12]. Ker je opaziti v mnogih razraščajo tipov celic, ni mogoče izključiti, da se poslabša tumorske celice, kot je razvidno iz njihove povečane prisotnosti v plazmi in plevralni izlivi bolnikov z rakom [8], [12]. Ta povečana prisotnost v neinvazivnih telesnih tekočinah bolnikov z rakom je pospešila na profil molekularnih komponent v eksozomov, prostazomov za odkrivanje klinično uporabnih markerjev tumorjev in biomarkerjev [3], [7], [13].

miRNAs so razred nekodirano malih RNA, ki so vključeni v post-translacijskih regulacije genske ekspresije z zaviranjem tako stabilnost in prevajanje mRNA [14]. Novi dokazi kažejo, da Mirna mutacije ali misexpression korelaciji z različnimi človeškimi raka in kažejo, da se lahko nekateri miRNAs deluje kot onkogeni ali tumorske razbijal [15], [16]. Za analizo RNA, je vedno treba upoštevati njihove stabilnosti od propadanja z RNaze. Najnovejše ugotovitve kažejo, da so endogeni plazmi miRNAs v krvnih vzorcih stabilno zaznati v obliki, ki je odporen na aktivnost RNaze [17], kar se kaže s prepoznavo miRNAs v telesnih tekočinah, kot so kri [17] - [24], urin [25], in slina [10], [26].

Gojeni rakave celice so bile uporabljene za iskanje tumorskih markerjev. Predvsem je za prepoznavanje peptidi in proteini izločajo v gojišča razvila-proteinomiko osnovi pristopa [27], [28]. Kot za molekularno podpis v eksozomov, prostazomov, so proteomika kot tudi analize transkriptomike izvedemo razkriti tumorigeneze in prepoznajo tumorske označevalne kandidatov [2] - [4], [7], [29]. Tukaj, da prepoznajo miRNA, povezane z tumorigeneze in metastaz, smo izvedli obsežno analizo Mirna v treh celičnih frakcij, vključno s celicami, eksozomov, prostazomov in medij iz gojenih celic. Razvrstitev podatkov teh znotrajceličnih in zunajceličnih miRNAs, pridobljenih z analizo mikromrež, smo ugotovili, da naj-7 miRNA družina je bogata v vseh frakcij iz AZ-P7a celic, metastatski želodčni rak celične linije, ki proizvaja homogeno in kondenzirane morfologijo, in visoke okrevanje stopnja exosomal miRNAs. Te ugotovitve so bile za razliko od drugih vrst celic, vključno s pljučnim rakom celičnih linijah (SBC-3, NCI-H69, in DMS53), kolorektalnega raka celičnih linij (SW480 in SW620), in AZ-521, v skladu s starševsko celic AZ-P7a. Glede na to, da se pusti-7 Mirna družinske funkcije, predvsem zaviralnih genov [30] usmeriti onkogeni kot RAS
in visoka skupina mobilnost A2 ( HMGA2
) [31], predlagamo, da AZ -P7a celice selektivno izločajo naj-7 miRNAs zletela zunajcelični okolje preko eksozomov, prostazomov, da ohranijo svoje tumorogene in metastaznih nagnjenj.

Rezultati

Izolacija eksozomov, prostazomov iz celičnih linij različnih rakavih

eksozomov, prostazomov so izdelani iz notranje celic v zunajcelični okolja prek eksocitoze podobni poti [1]. Poleg telesnih tekočinah, kot serumu in plazmi iz periferne krvi [7], [8], eksozomov, prostazomov se nahajajo v mediju kultiviranih [7] celic, olajšati identifikacijo exosomal molekul, vključno s proteini, mRNA in miRNAs za cilj za njihovo klinično uporabo. Profiliranje takšne exosomal molekule, proizvedene v kultiviranih rakave celice so povzročile, da odkrijete novo kandidatko marker in antigen za raka diagnostiko in imunoterapije [7]. V tej študiji, za profiliranje exosomal miRNAs, smo najprej izolirali eksozomov, prostazomov iz gojišča prog 46 rakavih celic z različnimi vrstami tkiv, ki vključujejo 8 za želodec, 16 za pljuč, 5 za debelo črevo, 9 za trebušne slinavke, 3 za prostato in 5 za prsi. Potem ko so bile celice gojijo v 48 urah, smo eksozomov, prostazomov zbrani s kombinacijo zaporednega centrifugiranjem in molekulsko maso za ločitev membran kot je opisano v materialih in metodah. Njihovo čistost exosomal frakcij smo ocenili z analizami transmisijsko elektronsko mikroskopijo in zahodni blot. Presevna elektronska mikroskopija je pokazala, okrogle oblike vezikularnih membranskih struktur približno v velikosti 100 nm v premeru. Med tri celične linije, SBC-3, AZ-521, in AZ-P7a, da je v interesu, da je morfologija od AZ-P7a celic bolj homogena in zgoščeno kot druge celice (Slika 1A). Immunoelectron mikroskopija je pokazala, da so bile ekstracelularnih delci izolirane iz gojitvenem mediju AZ-P7a celic radioinkorporacijo s protitelesom proti CD63, eden izmed exosomal membranskih proteinov, od kapsularnih membrane (slika 1B). Prisotnost znanih exosomal beljakovin, vključno z CD29 /β1-integrin, Aip1 /Alix in tumorja dovzetnosti gena 101 (Tsg101) je potrdila zahodni blot analizo, medtem ko beljakovine lokalizirana endoplazemski retikulum, Bip /Grp78 je nezaznavne (slika 1C). Ta rezultat kaže, da je onesnaženje snovi, pridobljenih iz drugih mobilnih oddelkov frakcij exosomal minimalen. Donos exosomal proteinov iz AZ-P7a celic je bila 10-krat večja kot pri 521 AZ-celic; ~2.5 Mg proteini so bili pridobljeni iz 1 x 10 ^{8 AZ-P7a celic.}

Obogatitev exosomal RNA, ki izhajajo iz AZ-P7a celic

Po izolaciji, exosomal skupni RNA smo izolirali iz 46 kultivirani celične linije. Zanimivo je, da so bili RNA donosi iz AZ-P7a celic, veliko večje od tistih iz drugih celic (Slika 2A). Porazdelitev dolžine pokazala prisotnost velikih količin malih RNA v eksozomov, prostazomov (središče panelov, slika 2b). Opozoriti je treba, da obstaja velika razlika v skupnih eksozomov, prostazomov in ravneh exosomal miRNA med bolniki s pljučnim adenokarcinomom in nadzora [8]. AZ-P7a celično linijo je bila ustanovljena s ponovnim cepljenjem starševskih AZ-521 celic pri miših, povzročila visoko peritonealno-metastatskega potenciala [32], [33]. Tako lahko visoki donosi tako RNA in beljakovin skupaj z morfološkimi značilnostmi AZ-P7a celic pripisati visokih tumorogenih in metastatskih nagnjenj. Ker so miRNAs odkriti v telesnih tekočinah brezcelični [17] - [20], smo izvedli tudi direktno izolacijo celotne RNA iz gojišča brez postopka za izolacijo eksozomov, prostazomov. Zneski vseh RNA iz gojišč so na splošno večji od tistih iz eksozomov, prostazomov (slika 2A). Porazdelitev RNA z dolžino pokazala, da so bile Mirna frakcije zaznali v območju 10-40 dolžine nukleotidno v RNA narejenih iz gojišča (desno plošče), kot tudi eksozomov, prostazomov (središče plošče) iz AZ-P7a celic (slika 2b). Po protokolu proizvodnjo za Bioanalyzer, vrhovi z več kot 40 dolžine nukleotidov vsebuje druge majhne RNA vključno tRNAs na 70~90, 5S ribosomske RNA pri 100 in 5.8S ribosomske RNA na 150, kot je bilo ugotovljeno v znotrajcelični frakcij (levi plošči) . Ti rezultati kažejo, da lahko obstajajo miRNAs v gojitvenem mediju zunaj exosomal frakcije čeprav RNA verjeli, da je zaščiten pred RNases, da je bila pakirana v eksozomov, prostazomov. Zlasti v primerjavi z oprijetih celic, je prirastek RNA donosov izredno večja v plavajočem celice (NCI-H69 in Lu-135) ali celice s spleta populacijami plavajoče in oprijetih celic (Colo205), ki se lahko odraža z okužbo z RNA shed iz liziranih celic, ki so bili ves čas ostanejo v gojišč.

miRNA profiliranje, ki ga mikromrež analize

Mirna profili v znotrajceličnih in zunajceličnih frakcij smo določili z analizo mikromrež za sedem raka celičnih linijah vključno AZ- 521, AZ-P7a, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 ter SW620. Vzorci iz gojišč ter eksozomov, prostazomov iz hibridizacije signalov (slika 3), ki kažejo na obstoj miRNAs v teh vzorcih. Do sedaj, analiziranje podatkov mikromrež za miRNA med vzorci, ni bilo jasnih metod za normalizacijo intenzitete signala, saj je težko najti ustreznega notranjega standardnega materiala [34]. Tako so podatki mikromrež Mirna je na splošno analizirati brez normalizacije, ob predpostavki, da so skupna količina vhodnih RNA konstanta med vzorci [34], [35]. V tej študiji, po povprečju podatkov mikromrež Mirne med dvema ponovitev, smo uvrščeni miRNAs glede na njihove intenzitete signala. Ugotovili smo, da je pustil-7 Mirna družina, kot pustiti-7a, naj-7b, naj-7c, naj-7d, naj-7e, naj-7f, naj-7g, in pustiti-7i so bile odkrite pri relativno visokih signalov skozi najbolj znotrajceličnih frakcij iz sedmih celičnih linij (tabela 1, slika 3). Vendar pa ni ali pa malo signalov intenzivnosti za pustil-7 miRNAs so odkrili v zunajcelični frakcije, razen obeh zunajceličnih frakcij iz AZ-P7a celic in kulturo srednje frakcije iz NCI-H69 celic (tabela 1, slika 3). Še posebej, tako v zunajcelični frakcij iz AZ-P7a celic, vse osem naj-7 miRNAs so odkrili, čeprav je bil čin oddajal-7g nižja od ostalih sedmih naj-7 miRNAs. Ki temelji na različnih vzorcih oddajajo-7 stopenj miRNA med tremi celičnih frakcij, smo razdelili sedem celičnih linij v tri skupine (slika 3), kot sledi; (1) AZ-P7a, celice, ki omogočajo, 7 miRNAs so našli v vseh treh frakcij, (2), AZ-521, skupaj z SBC-3, DMS53, SW480 ter SW620, celice, ki omogočajo, 7 miRNAs so običajno na voljo v Samo znotrajceličnih frakcije, (3) NCI-H69, celice, ki omogočajo-7 miRNAs so bile ugotovljene v znotrajceličnih frakcij kot tudi v gojitvenem mediju do neke mere.

RT-PCR analize znotrajceličnih in zunajcelične akreditive 7 miRNA družina

potem smo izvedli kvantitativno RT-PCR za oddajal-7 miRNA družini osem za preverjanje podatkov mikromrež. Naj-7 miRNAs so zlahka odkriti v znotrajceličnih in zunajceličnih frakcij iz AZ-P7a celic (slika 4A) in AZ-521 celic (slika 4B). Ravni naj-7 miRNAs na vhodnih RNA so na splošno višje v zunajcelični frakcij iz AZ-P7a celic kot iz AZ-521 celic. Za normalizacijo ravni ciljnih miRNAs pridobiva z RT-PCR, U6 snRNA se na splošno uporablja kot notranje kontrole. Ugotovili smo prisotnost U6 snRNA v vseh treh frakcij iz AZ-P7a celic in AZ-521 celic (Slika 4c) in nato primerjali ravni pustijo-7 miRNAs med ustreznimi frakcij iz teh dveh celičnih linijah. Po normalizaciji, ravni pustijo-7 miRNAs tudi oddaja-7a, naj-7b, naj-7c, naj-7d, naj-7e, in naj-7i v obeh frakcij eksozomov, prostazomov in gojišč od 521 AZ celic so bili znižala v primerjavi s tistimi iz AZ-P7a celic. Nasprotno, ni velika razlika v ravneh znotrajceličnih pustijo-7 miRNAs. Mi poleg primerjali stopnjo exosomal naj-7a od AZ-P7a celic s tistimi iz drugih linij rakavih celic, vključno z SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 ter SW620, in ugotovila, da je raven naj-7a samo od SW620 celic je relativno blizu (0,7-krat), na ravni iz AZ-P7a celic (slika 4e). Treba je opozoriti, da je bila znotrajcelično raven oddajal-7a od SW620 celic približno 3,5-krat bolj bogat kot pri AZ-P7a celic. Na osnovi teh rezultatov smo predpostavili lokalizacijo pustiti-7a v frakcij celic in eksozomov, prostazomov (slika 5), ​​in izvedla nadaljnjo analizo. s stopnjami U6 normaliziral, smo izračunali relativne stopnje oddajal-7a pakirane v eksozomov, prostazomov na ravni celične oddajal-7a (Slika 4F). Kot rezultat, je znesek exosomal naj-7a je veliko večja v AZ-P7a celic od drugih šestih celic, kar kaže, da so bile AZ-P7a celice selektivno in aktivno izloča naj-7 Mirna družino v zunajcelični okolje preko eksozomov, prostazomov.

Pogovor

v tej raziskavi smo razkrili, da naj-7 miRNA družina je bila izloča v zunajcelični okolje preko exosomal prometa, ki je specifična za metastatskega želodčni rak celične linije, AZ-P7a. Naj-7 miRNA družina v človeku je sestavljena iz 10 sekvenc iz 13 predhodnimi sestavinami [30]. Na splošno velja, naj-7 miRNAs deluje kot zaviralnih, ki ciljajo onkogeni kot RAS
in HMGA2
in pustite, 7 miRNAs se navzdol reguliranih v mnogih raka zaradi čvrstih organov [31]. AZ-P7a celice imajo metastaz sposobnosti s peritonealno razširjanja v golih miših [32], [33]. Zato predlagamo, da se javnost exosomal za naj-7 miRNAs v zunajcelični okolje za posledico zmanjšanje anti-tumorogenega učinkom v celicah, ki vodijo, da ohranijo svojo onkogenezo in invazivnosti. Po drugi strani pa naj-7 miRNAs manj pogosto igrajo onkogenega funkcijo, ustrezno povečanje izražanja, ki hipometilacije na pustil-7 locus [36] ali ciljanje kaspaze-3 mRNA [37]. V tem primeru lahko javnost exosomal od pustijo-7 miRNAs povzroči preobrazbo v ciljnih celicah s prenosom svojih onkogeni lastnosti.

Pri bolnikih z rakom na pljučih, skupni ravni eksozomov, prostazomov in njihovi miRNAs povečanje v primerjavi s kontrolno skupino [8 ]. Dokazano je, da tumorske eksozomov, prostazomov inducira imunski odziv ubežni pri raka spontano celične apoptoze T [38] - [40]. V tej študiji smo pokazali homogeno morfologijo in obogatitev RNA v eksozomov, prostazomov z metastatskim AZ-P7a celic. To se lahko odraža v njihovi tumorjev.

miRNAs v krvni plazmi in serumu zelo stabilen, saj zaščiten RNases [17]. Tako, da naredi ravni Mirna testirali za klinično diagnozo kot tumorskih označevalcev in biomarkerjev. Kako se je zgodilo? Brado sod. so predlagali dve hipotezi za vir miRNAs v obtoku vzorce krvi; je lahko posledica posledica celične smrti in lyses tumorja ali sprostitev v tumorskih celicah v zunajcelični mikrookolju krvnih žil [19]. V nasprotju z oprijetih celic, smo ugotovili, da so bili zneski celotne RNA v kulturi medijih relativno višje kot v eksozomov, prostazomov za celice s plavajočo lastnino kot NCI-H69, Lu-135, in Colo205. Ta porast je verjetno povzročilo onesnaženje RNA iz mrtvih celic v gojišč.

Za odkritje novih krvnih tumorskih markerjev in biomarkerjev, -omikah pristopov vključno proteomika in transkriptomika izvajajo bodisi z neposredno analizo vzorcev krvi ali uporabe profiliranja v vzorcih tkiv. Obstajajo nasprotujoča si poročila, če so, ali so profili miRNA in mRNA v krvnem obtoku vzporedno s profilom tumorja je. Podpis exosomal miRNAs kaže, da od poreklom tumorskih celic pri bolnikih s pljučnim adenokarcinomom [8] in raka dojke [41]. Po drugi strani pa Skog sod. so pokazale, da analize mikromrež za mRNA, ki izhajajo iz glioblastoma celic in ustreznih eksozomov, prostazomov razkrila mRNA odkrita samo v microvesicles, špekulacij, da se mRNA lokalizirana na določeno območje citoplazmi [3]. Poleg tega Tanaka et al. so pokazale, da je raven pokoj-92a se je v krvni plazmi bolnikov akutne levkemije, medtem ko je bil njegov močan izraz našli v vzorcih tkiva [24]. Naši rezultati za selektivno obogatitev oddajal-7 miRNA družino AZ-P7a celic, ki izhajajo eksozomov, prostazomov ustrezni glede na slednjem primeru. Razen če ciljne molekule so miRNAs, ki izhajajo iz obtoku tumorske celice, to kaže, skrbno preiskavo so potrebni za uporabo Mirne profilov v tkivnih vzorcev za odkrivanje v vzorcih seruma ali plazme.

Ker so eksozomov, prostazomov proizvajajo v hematopoetičnih celicah kot tudi epitelijskih celic obtoku kri vsebuje eksozomov, prostazomov, ki izhajajo iz obeh vrst celic. Na splošno velja, da razišče exosomal profile proteinov, mRNA in miRNAs v serumu in plazmi, so eksozomov, prostazomov izpeljani iz tumorji epitelijskih značilnostmi ločiti od tistih iz hematopoetičnih celic [8], [13]. To se izvaja s pomočjo čiščenja afiniteto s protitelesi proti molekul, kot EpCAM, ki izražajo na površini epitelijskih celic. Naše ugotovitve, da so bili podobni ravni pusti-7 miRNA družine med eksozomov, prostazomov in gojišč iz AZ-P7a celic, kažejo, da se te vrednosti Mirna lahko merijo brez izoliranja eksozomov, prostazomov iz kliničnih vzorcev, kot so serumu in plazmi.

sklep, ta študija je pokazala, da naj-7 miRNA družina je bogata z eksozomov, prostazomov iz metastatskega želodčni rak celične linije, AZ-P7a celic. Ker se dajmo-7 miRNAs sodelujejo v procesu širjenja orožja [31], njihovo izločanje exosomal lahko igrajo pomembno vlogo pri tumorigeneze in metastaz.

Materiali in metode

celične kulture

rak želodca humane celične linije (AZ-521, MKN45, KATOIII in NUGC-3), človeške pljučne rakave celične linije (SBC-3, Lu-65, Lu-135, in KNS-62), in človeške trebušne slinavke rakave celice ( Suit-2) so bile kupljene od japonskih zbirke raziskovalnih BioResources. Human želodcu rakave celice (snu-1), človeške pljučne rakave celične linije (DMS-53, DMS114, NCI-H69, A549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SI-MES-1, in HCC827), človekove mezoteliom celice (MSTO-H211), človekove debelem rakave celične linije (SW480, SW620, Colo205, Lovo, in HCT116, človeške trebušne rakave celične linije (BxPC-3, ASPC-1, PANČ-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45, in Capan-2), človeški prostate rakave celične linije (PC-3, SU145 in LNCaP), in človeških celičnih linij raka dojke (T-47D, MCF7, SK-BR-3, BT -474, in MDA-MB-231), ki so bile kupljene od American Type Culture Collection. MKN28 (človeški želodec rakavih celic) in PSN-1 (človekove pankreatične rakave celice), so bile kupljene pri imunsko-biološke laboratorije in European Collection of Cell kulture, v tem zaporedju . linije človekovih rak želodca celic, AZ-P7a [32], [33] in MKN45P [42] je bilo darilo od Drs. Yutaka Yonemura in Yoshio Endo. V AZ-521 in AZ-P7a celice, niso opazili nobenih izdelkov RT-PCR 14 retrovirusov, vključno s HPV 16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, HIV1, HIV2 in ADV tipa 1 (podatki niso prikazani), razen okužbe s temi retro v obeh celičnih linij . Celice so bile vzdrževane v RPMI-1640 medij (Sigma-Aldrich), dopolnjenem z 10% toplotno inaktiviramo fetalni goveji serum (Invitrogen), 100 U /ml penicilina in 0,1 mg /ml streptomicina.

Proizvodnja in izolacijo od eksozomov, prostazomov

Prilepljene celice smo posejali na 150 mm-jedi na ustrezno število celic od 3 × 10 ^{6: 1 × 10 7 celic na posodo, medtem ko so bile plavajoče celice nasajenih v 75 cm 2-bučko na 2~2.5 × 10 7 celic na bučko. Celice smo kultivirali v popolni RPMI-1640 medij 25 ml in 50 ml za jedi in bučk, v tem zaporedju, za 24 ur pri 37 ° C in 5% CO _{2, dvakrat izperemo s fosfatnim pufrom (PBS), in inkubirali 48 ur pri brez fenol-rdečega RPMI-1640 medij (Sigma-Aldrich), ki vsebuje 10% toplotno deaktiviranega fetalni goveji serum, ki je bil prej osiromašen kontaminira microvesicles ga čez noč centrifugiranjem pri 100000 x g. Eksozomov, prostazomov smo izolirali iz celotnih celic v razponu od 6 x 10 7-3 x 10 8 celice, kot je prej opisane [29]. Na kratko smo gojišče zbrali in centrifugirali pri 800 x g 5 minut in dodatnih 2000 x g 10 minut, da odstranimo preklic celice. Supernatant izpostavimo filtracijo na polietersulfon membranski filter 0,1 um por (Corning), da odstranimo celične ostanke in velike mehurčke, sledi koncentracije s 100.000 MW razmejitveno membrane (CentriPlus-70, Millipore). Prostornina supernatanta se je zmanjšal s približno 250-500 ml do približno 30 ml. Supernatant smo nato ultracentrifugiranih na 100.000 x g za 1 h pri 4 ° C ob uporabi 70Ti rotor (Beckman Coulterjevega). Nastale pelete smo ponovno suspendirali v 6 ml PBS in ultracentrifugiranih na 100.000 x g za 1 h pri 4 ° C ob uporabi 100Ti rotor (Beckman Coulterjevega).}}

Menjalnik elektronska mikroskopija

peletirani eksozomov, prostazomov zmešamo pri enakih količinah sveže pripravljenega 2% glutaraldehidom v PBS, inkubiranih čez noč pri 4 ° C, postfixed z 1% osmijevim tetroksidom v PBS pri 4 ° C 2 h in dehidrirani v stopenjski seriji etanola. Sledi dehidracija, so bili vzorci prenesene na propilenoksida in vgrajeni v epoksi smolo Quetol 812 (Nisshin EM). Tankih sekcije smo razrezali z Ultracut UCT (Leica), obarvane z uranil acetat in svinca citrat, in ugotovili s JEM-1230 elektronskim mikroskopom (JEOL). Immunoelectron smo mikroskopska analiza izvedena po metodi, ki jo Xiao et al opisan. [43] z manjšimi spremembami. Na kratko smo eksozomov, prostazomov pomešamo in inkubiramo z miško anti-humani CD63 monoklonsko protitelo (kataloška št. Sc-51.662, Santa Cruz) za 1 h pri sobni temperaturi. Vzorec je bil padla na membranske površine bakrene mreže (Kolodij /ogljik obložene 400 mesh, Nisshin EM) in inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi. Po pranju s PBS, immunogold konjugiranega kozjega anti-miške IgG (kataloška št. EM.GMHL15, BBInternational) razredčimo na 1:20 je padla na membrano. Baker mreže so v zraku v kapljice s svojo membrane obrnjeni površini navzdol pri sobni temperaturi 30 minut. Po izpiranju s PBS, je uranilov acetatne kapljic čaka na površini bakra očes in obarvamo pri sobni temperaturi 30 sekund. Eksozomov, prostazomov s črnimi koloidnih delcev zlata na ekstrakapilarnih membrane so označene kot pozitivno v okviru prenosa elektronskim mikroskopom.

Western blot analiza

celice in exosomal frakcije speremo, resuspendirali v liznega pufra [7.5 M sečnina (Sigma-Aldrich), 2,5 M tiosečnino (Sigma-Aldrich), 12,5% glicerola (Wako), 50 mM Tris, 2,5% n-oktil-beta-D-glukozid (Sigma-Aldrich), 6,25 mM Tris (2- karboksietil) fosfin hidroklorid (Sigma-Aldrich), 1,25 mM inhibitorja proteaze (kataloška št. P2714, Sigma-Aldrich)], in inkubirali 1 uro pri 4 ° C ob uporabi rotator RT-50 (TAITEC). Po centrifugiranju pri 14,000 x g za 60 min pri 4 ° C smo supernatant zbrali in koncentracijo proteina določimo z Bradfordu beljakovine Vsebnost Kit (Bio-Rad). Del beljakovin (10 mikrogramov) so denaturira v vreli Laemmli vzorca pufru, ki potekajo na 10% SDS-poliakrilamidni geli, in prenese na PVDF membrane Immobilon-P (0,45 velikost um por, Millipore). So blots smo blokirali 1 h pri 5% nemastnega suhega mleka v tris-pufrom, ki vsebuje Tween 20 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl in 0,01% Tween 20). Po blokiranje membrane inkubiramo z vsako primarno protitelo ali antiseruma vključno zajca anti-Tsg101 serumu (kataloška št. T5951, Sigma-Aldrich), kozji anti-Aip1 /Alix serumu (kataloška št. Sc-49268, Santa Cruz), miška monoklonsko anti-CD29 /β1-integrina (kataloška št. sc-610.468, BD Biosciences) in miško monoklonsko anti-Bip /Grp78 (kataloška št. 610.979, BD Biosciences) po razredčenju 1:200 za 1 uro pri sobni temperaturi. So blots smo nato inkubirali z ustreznim anti-IgG sekundarnega protitelesa, konjugiranega s hrenovo peroksidazo (Jackson Laboratories) pri razredčitvi 1:2,000 1 h pri sobni temperaturi. Posebne proteine ​​smo vizualizirali s pomočjo sistema ECL (GE Healthcare) in FUJIFILM Luminescent Image Analyzer LAS3000 (Fuji Film). Protein molekulska masa je razbrati z Precision Plus Protein Standards (Bio-Rad Laboratories).

RNA Isolation

Za izolacije RNA iz gojišča kulture smo celice zasejali, kot je opisano zgoraj. 48 ur po goji, gojišče smo zbrali in centrifugirali pri 800 x g 5 minut in dodatnih 2000 x g 10 minut. Supernatant izpostavimo filtracijo na polietersulfon membranski filter 0,22 um por (Corning), čemur je sledilo koncentriranje z 5.000 MW cut-off membrano (CentriconR Plus-70, Millipore). Končni volumen supernatanta je približno 10-20 ml iz prvotnega volumna 250-500 ml. Supernatant smo zmešali z enakim volumnom liznega QIAzol Reagent (Qiagen) in sledil postopek izolacije RNA opisano spodaj. Total RNA smo izolirali iz celic, eksozomov, prostazomov ali kulture medijev, ki uporabljajo miRNeasy Mini Kit (Qiagen) v skladu z navodili proizvajalca. Odstraniti genomske DNA, 40

• Plos ONE: izražanje genov Podpis pridobljene Chemoresistance za cisplatin in fluorouracil kemoterapija želodčnega raka bolnikov
• Plos ONE: inducirajo s hipoksijo Factor 1α Določa Rak želodca Chemosensitivity z modulacijo p53 in NF-κB