Secreted Background VerfÜgung
Exosomes eng grouss Roll am Leeschtung Zell-ze -cell Kommunikatioun, gezielt Zellen exosomal Molekülle dorënner Proteinen, mRNAs, an microRNAs (miRNAs) duerch eng endocytosis-wëll Passerelle fir Transfert. miRNAs si kleng noncoding RNS Molekülle Duerchschnëtt 22 nucleotides zu Längt datt duerch gezielt mRNAs vill biologesch Prozesser dorënner Kriibs pathogenesis an Mediate Gentherapie verwandelt-Regulatioun regléieren RNS ofgeschnidden zu induce an /oder mat Iwwersetzung interfering. Rezent Rapporten préziséiert dass miRNAs kann stably zu libre Plasma an serum nogewise ginn zënter miRNAs vun exosomes Emballagen sinn aus RNS ofgeschnidden geschützt ze ginn. Sou, sinn profiling exosomal miRNAs brauchen intercellular sécher ze klären an engem Roman Krankheet Bewaacher souwéi entdecken. VerfÜgung
Methodik /Principal effektiv VerfÜgung
Exosomes sech vom cultured Kriibs Zell Linnen an hir Qualitéit validéiert huet vun Analysë vun Transmissioun Elektronen microscopy a westlech blotting. Ee vun de Zell Linnen getest, eng metastatic gastric Kriibs Zell Linn, AZ-P7a, zougedréckt a dem héchste RNS nozeginn an der Verëffentlechung exosomes an ënnerscheed Form an Wirklechkeet. Ausserdeem goufen RNAs vun Zellen a Kultur Medien isoléiert, an Profiler vun dësen dräi miRNA ufale benotzt microarray Analyse kritt. Signal intensities vun microarray Donnéeën an de folgende Confirmatioun benotzt RT-Hinnen alleguer Analyse vun vergläichen, hunn mir déi loosse-7 miRNA Famill an souwuel de intracellular an extracellular ufale vum AZ-P7a Zellen räich war, iwwerdeems niddereg metastatic AZ-521, den Elteren Zell Linn vum AZ-P7a, wéi och aner Linnen Zell Kriibs zougedréckt keen esou propensity. VerfÜgung
Konklusiounen /Grousses VerfÜgung
d'Beräicherung vun loosse-7 miRNA Famill an der extracellular ufale, besonnesch, an der exosomes vum AZ-P7a Zellen kann hir oncogenic Charakteristiken dorënner tumorigenesis an Metastasen spigelen. Well loosse-7 allgemeng miRNAs entholl-suppressive Roll spille wéi oncogenes wéi RAS VerfÜgung a HMGA2 VerfÜgung, eis Resultater hindeit, datt AZ-P7a Zellen release loosse-7 miRNAs via exosomes an de Reklamme extracellular Ëmwelt hir oncogenesis ze erhalen VerfÜgung Fro:. Ohshima K, Inoue K, Fujiwara a, Hatakeyama K, Kanto K, Watanabe Y, et al. (2010) Loosst-7 MicroRNA Family Ass selektiv Secreted an der Extracellular Ëmwelt via Exosomes zu engem Metastatic Gastric Cancer Zell Linn. PLoS NËMMEN 5 (10): e13247. Doi: 10.1371 /journal.pone.0013247 VerfÜgung Redakter: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Däitschland VerfÜgung Arnaque: 14. Abrëll 2010; Akzeptéiert: 10 September 2010; Publizéiert: Oktober 8, 2010 VerfÜgung Copyright: © 2010 Ohshima et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung Funding:. D'Aarbecht war duerch Subventiounen an Zesummenaarbecht mat innovativ Technologie an Détailléiert Fuerschung zu Evolutional Area (CITY SIN) aus dem Educatiounsministère, Kultur, Sport, Wëssenschaft an Technologie vun Japan ënnerstëtzt. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung BTS secrete verschidden Zorte vu klenge Membran vesicles. Exosomes sinn eent vun de vesicles mat 30-100 nm Duerchmiesser an physicochemically verschidde vun anere secreted vesicles [1]. Virum exosomes, bewosst Gentherapie Produiten dorënner Proteinen, mRNAs, an microRNAs (miRNAs) ginn dann an dëse Molekülle kënnen ze dru Zellen transferéiert ginn hir molekulare sécher ze liwweren wéi oncogenesis [2] - [4] an immun Äntwert [1], [ ,,,0],5]. Exosomes sinn déi vill Zorte vun Zellen Verëffentlechung [6] déi entholl Zellen, epithelial Zellen gehéieren, an hematopoietic Zellen wéi reticulocytes, cytotoxic T lymphocytes, Epstein-Barr Virus-transforméiert B Zellen, mastocytes, dendritic Zellen, an Plaquetten. Secreted exosomes gewiescht isoléiert an charakteriséiert kënschtlech VerfÜgung aus cultured Zell Linnen [7] zesumme mat zu VIVO VerfÜgung am Kierper Flëssegkeeten [7] och Blutt [8], Pipi [9], Spaut [10], amniotic Flesseggassystem [11], an malignant pleural effusions [12]. Zënter ville proliferating Zell Zorte observéiert, ass et erdenklech entholl Zellen ze Gehälterreform, wéi mat Kriibs duerch hir grouss Präsenz an Plasma an pleural effusions vun Patiente Siicht [8], [12]. Dëst fräi Präsenz an Net-invasiv kierperleche Flëssegkeeten vum Kriibs Patienten huet scho fir entdecken klinesch nëtzlech entholl lues a biomarkers molekulare Komponente vun der exosomes zu Profil [3], [7], [13]. VerfÜgung miRNAs eng sinn Klass vun noncoding kleng RNAs datt esouwuel am Post-respektiv Regulatioun vun der Gentherapie Ausdrock implizéieren Stabilitéit an Iwwersetzung vun mRNAs vun inhibiting [14]. Rezent Beweiser huet gewisen, datt miRNA kennen oder misexpression mat verschiddenen Mënsch Cancers vergläichen a weisen, datt e puer miRNAs als oncogenes oder entholl suppressors Funktioun kënnen [15], [16]. Ze analyséieren RNAs, ass et ëmmer hir Stabilitéit vun ofgeschnidden vun RNase ze considéréieren. Resultater weisen, datt endogenous Plasma miRNAs am Blutt Echantillon vun engem Formulaire stably festgestallt ginn, datt zu RNase Aktivitéit resistent ass [17], et vum Identifikatioun vun miRNAs am Kierper Flëssegkeeten wéi Blutt [17] - [24], Pipi [25], a Spaut [10], [26]. VerfÜgung Cultured Kriibs Zellen gebraucht goufen fir entholl lues ze sichen. Besonnesch, Erkenntnesser Proteinen an peptides an der Kultur Medien secreted huet vun proteomics-baséiert Approche entwéckelt [27], [28]. Wéi fir molekulare Ënnerschrëft vun der exosomes, hunn proteomics souwéi transcriptomics Analysë gemaach ginn tumorigenesis opgedeckt an entholl Bewaacher Kandidaten [2] z'identifizéieren - [4], [7], [29]. Hei, zu z'identifizéieren miRNA zu tumorigenesis an Metastasen dinn, standing mer extensiv miRNA Analyse vun dräi bewosst ufale dorënner Zellen, exosomes, a Mëttelbetriber aus cultured Zellen. Ranking Donnéeën vun dësen intracellular an extracellular miRNAs vun microarray Analyse kritt, hunn mir déi loosse-7 miRNA Famill an all déi ufale vum AZ-P7a Zellen räich ass, eng metastatic Linn gastric Kriibs Zell, déi Goss an kondenséiert Wirklechkeet produzéiert, an héich Erhuelung Taux vun exosomal miRNAs. Dës bruet huet verschidde vun anere Zell Linnen dorënner haett Kriibs Zell Linnen (SBC-3, NCI-H69, an DMS53), colorectal Kriibs Zell Linnen (SW480 an SW620), an AZ-521, den Elteren Zell Linn vum AZ-P7a. Que dass mer-7 miRNA Famill Funktiounen haaptsächlech als entholl suppressor Genen [30] oncogenes ze viséieren wéi RAS VerfÜgung an héich Mobilitéit Grupp A2 ( HMGA2 VerfÜgung) [31], proposéieren mir dass AZ -P7a Zellen selektiv secrete loosse-7 miRNAs an der extracellular Ëmwelt via exosomes hir tumorigenic an metastatic propensities ze erhalen. VerfÜgung Isolatioun vun exosomes aus verschiddenen Kriibs Zell Linnen VerfÜgung Exosomes sinn enke Zellen zu der extracellular Ëmwelt via eng exocytosis-wëll Passerelle produzéiert [1]. Nieft kierperleche Flëssegkeeten wéi serum a Plasma aus Randerscheinung Blutt [7], [8], exosomes sinn an der mëttel- vun cultured Zellen fonnt [7], Saachen Identifikatioun vun exosomal Molekülle dorënner Proteinen, mRNAs, an miRNAs fir d'Zil fir hire Krankheete benotzen. Profiling esou exosomal Molekülle an cultured Kriibs Zellen produzéiert hunn e Roman Kandidat Bewaacher geflitzt an antigen fir Kriibs Diagnos an immunotherapy [7] ze entdecken. An dëser Etude, fir den Zweck vun exosomal miRNAs profiling, mir éischt, mat verschiddenen Otemschwieregkeeten Zorte exosomes vu Kultur Medien vun 46 Kriibs Zell Linnen isoléiert déi fir Mo och 8, 16 fir haett, 5 fir Colon, 9 fir Bauchspaicheldrüs, 3 fir Aarbecht , an 5 fir Broscht gedon. No Zellen fir 48 h ugebaut goufen, exosomes huet mat enger Kombinatioun vu successive centrifugation a molekulare Gewiicht präventive gesammelt Schläimhait wéi an spontan a Methode beschriwwen. Hir Rengheet vum exosomal ufale war vun Analysë vun Transmissioun Elektronen microscopy a westlech blotting évaluéieren. Transmissioun vun Elektronen microscopy zougedréckt Ronn-gebuerene vesicular Membran Strukturen ongeféier an der Gréisst vun 100 nm am Duerchmiesser. Vun dräi Zell Linnen, SBC-3, AZ-521, an AZ-P7a, ass et interessant, dass d'Wirklechkeet vum AZ-P7a Zellen war méi Goss an kondenséiert wéi aner Zellen (Dorënner 1A). Immunoelectron microscopy gewisen, datt d'extracellular Deelchen aus der Kultur mëttel- vun AZ-P7a Zellen mat enger antibody géint CD63 haten immunoreactivity isoléiert, eent vun de exosomal Membran Proteinen, op der capsular Schläimhait (Dorënner 1B). D'Präsenz vun bekannt exosomal Proteinen dorënner CD29 /β1-integrin, Aip1 /Alix an entholl waat Gentherapie 101 (Tsg101) duerch westlech blot Analys confirméiert huet, während engem FAQ fir endoplasmic reticulum en der, BIP /Grp78, war undetectable (Dorënner 1c). Dëst Resultat beweist dass der kontaminéierte Material aus anere bewosst compartments an der exosomal ufale ofgeleet war minimal. De Rendement vun exosomal Proteinen vum AZ-P7a Zellen war 10 mol méi héich wéi déi vun AZ-521 Zellen; ~2.5 Mg Proteinen sech aus 1 × 10 Beräicherung vun exosomal RNAs ofgeleet vum AZ-P7a Zellen VerfÜgung der Isolatioun, huet exosomal total RNAs vom 46 cultured Zell Linnen. Spannen, huet den RNS noginn vum AZ-P7a Zellen vill méi grouss wéi déi vun anere Zellen (Dorënner 2A). D'Verdeelung vun Längt zougedréckt a Präsenz vum grousse Quantitéiten vu klenge RNAs zu exosomes (Zentrum erschéngt, well 2B). Et ass ze bemierken, datt et e wesentlechen Ënnerscheed am Ganzen exosomes ass an der exosomal miRNA Niveau tëscht Patienten mat haett adenocarcinoma an Kontrollen [8]. AZ-P7a Zell Linn vun widderholl inoculation vun den Elteren AZ-521 Zellen am Mais gegrënnt gouf, schéinen héich peritoneal-metastatic Potential [32], [33]. déi héich noginn souwuel RNS an FAQ zesumme mat der morphological Beméien an AZ-P7a Zellen kann un hir héich tumorigenic an metastatic propensities zougeschriwwen ginn also,. Zanter miRNAs hunn zu Zell-gratis kierperleche Flëssegkeeten nogewise ginn [17] - [20], mir standing och direkt Isolatioun vun insgesamt RNAs vu Kultur mëttelfristeg ouni Prozedur fir exosomes Isolatioune. D'Montanten vun insgesamt RNAs vu Kultur Medien sech allgemeng méi grouss wéi déi vun exosomes (Dorënner 2A). RNS Verdeelung vun Längt zougedréckt datt miRNA ufale zu der Palette vun 10 bis 40 Nukleotid Längt vun RNAs bereet aus Kultur mëttelfristeg (riets Rot) souwéi exosomes (Zentrum Rot) vum AZ-P7a Zellen (Dorënner 2B) nogewise goufen. Laut de Protokoll d'Fabrikatioun fir Bioanalyzer, Moundalpen mat méi wéi 40 Nukleotid Längt sëlwer kleng RNAs dorënner tRNAs um 70~90, 5s ribosomal RNS op 100, an 5.8S ribosomal RNS um 150, wéi am intracellular Ëmwandlung (lénks Rot) observéiert . Dës Resultater hindeit, datt miRNAs an der Kultur mëttelfristeg ausserhalb der exosomal Ëmwandlung existéieren kann obwuel RNAs gegleeft sinn aus RNases gin geschützt wéi an exosomes Emballagen ginn. Besonnesch, am Verglach zu Operstéiungszeen Zellen, war d'increment vun RNS noginn ganz grouss an de Wénkel gekäppt Zellen (NCI-H69 an Lu-135) oder Zellen mat Mëschung Populatiounen vun de Wénkel gekäppt an Operstéiungszeen Zellen (Colo205), déi duerch kontaminéierte spigelt kann vun RNAs datts aus lysed Zellen datt zu Kultur Medien kontinuéierlech lénks gewiescht. VerfÜgung miRNA profiling vun microarray Analyse VerfÜgung miRNA Profiler vun der intracellular an extracellular ufale vun microarray Analyse fir siwen Kriibs Zell Linnen dorënner AZ- alles sech 521, AZ-P7a, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480, an SW620. Echantillon vun Kultur Medien souwéi exosomes gëtt hybridization Signaler (Dorënner 3), beweist d'Existenz vun miRNAs an dës Echantillon. Bis de Moment, microarray Daten fir miRNA ënnert Echantillonen analyséiert, hu keng kloer Methode gouf fir normalization vun Signal Intensitéit huet zanter et ass schwéier op eng adäquat intern Standard Material [34] ze fannen. Sou, hunn miRNA microarray Donnéeën am Allgemengen ouni normalization analyséiert goufen, unzehuelen, datt de ganzen Montanten vun Infor- RNAs ënnert Echantillon konstant sinn [34], [35]. An dëser Etude, an der microarray Daten tëscht zwee gefaart miRNA averaging, klasséiert mir miRNAs no hirem Signal intensities. Mir hu fonnt, datt mer-7 miRNA Famill wéi loosse-7A, loosse-7b, loosse-7c, loosse-7d, loosse-7, loosse-7f, loosse-7g, a loosse-7i goufen uechter meeschte mat relativ héich Signaler fonnt vun der intracellular ufale aus der siwen Zell Linnen (Table 1, well 3). Mä keng oder wéineg Signal intensities fir d'loosse-7 miRNAs waren an der extracellular ufale ausser souwuel extracellular ufale vum AZ-P7a Zellen a Kultur mëttelfristeg Ëmwandlung vun NCI-H69 Zellen (Table 1, well 3) fonnt. Besonnesch, souwuel an der extracellular ufale vum AZ-P7a Zellen, all déi aacht loosse-7 miRNAs festgestallt goufen obwuel de Rang vun loosse-7g niddreg wéi aner siwen loosse-7 miRNAs. Baséiert op der z'ënnerscheedde Musteren vun loosse-7 miRNA Niveauen ënnert der dräi bewosst ufale, ënnerdeelt mir de siwe Zell Linnen an dräi Gruppen (Dorënner 3) wéi follegt; (1) AZ-P7a, Zellen, datt mer-7 miRNAs an all déi dräi ufale fonnt goufen, (2) AZ-521 mat SBC-3, DMS53, SW480, an SW620, Zellen, datt mer-7 miRNAs allgemeng fonnt goufen nëmmen intracellular ufale, (3) NCI-H69, Zellen, datt mer-7 miRNAs waren an der intracellular ufale wéi och an der Kultur mëttelfristeg gewëssermoossen fonnt. VerfÜgung RT-Hinnen alleguer Analysë vun intracellular an extracellular let- 7 miRNA Famill VerfÜgung Mir standing duerno mei grouss RT-Hinnen alleguer fir déi aacht loosse-7 miRNA Famill de microarray Donnéeën ze validéieren. Loosst-7 miRNAs waren an der intracellular an extracellular ufale vum AZ-P7a Zellen (Dorënner 4A) an AZ-521 Zellen (Dorënner 4B) geschloë fonnt. Den Niveau vun loosse-7 miRNAs pro Input RNAs sech generell méi an der extracellular ufale vum AZ-P7a Zellen wéi vum AZ-521 Zellen. Fir den Niveau vun Zil- miRNAs kritt vun RT-Hinnen alleguer norméierend, U6 snRNA gouf als eng intern Kontroll gängegen. Mir observéiert der Präsenz vun U6 snRNA an all déi dräi ufale vum AZ-P7a Zellen an AZ-521 Zellen (Dorënner 4C) an am Verglach dann den Niveau vun loosse-7 miRNAs tëschent de jeeweilegen ufale vun dësen zwou Zell Linnen. No normalization, dorënner de Niveau vun loosse-7 miRNAs loosse-7A, loosse-7b, loosse-7c, loosse-7d, loosse-7, a loosse-7i zu souwuel d'ufale vun exosomes a Kultur Medien vum AZ-521 Zellen sech Gang wéi vum AZ-P7a Zellen mat deenen Verglach. Am Géigendeel, gouf et keen groussen Ënnerscheed zu de Niveau vun der intracellular loosse-7 miRNAs. Mir Verglach nächsten Niveau vun exosomal loosse-7A vum AZ-P7a Zellen mat deene vun anere Kriibs Zell Linnen dorënner SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480, an SW620, an fonnt dass den loosse-7A Niveau nëmmen aus SW620 Zellen relativ enk war (0.7 mol) op den Niveau vum AZ-P7a Zellen (Dorënner 4E). Et soll festgestallt ginn, datt d'intracellular Niveau vun loosse-7A aus SW620 Zellen war ongeféier 3,5 mol méi räich wéi déi vun AZ-P7a Zellen. Baséierend op déi Resultater, gemengt mir Lokalisatioun vun loosse-7A an der ufale vun Zellen an exosomes (Dorënner 5), a weider Analyse gehaal. vun der U6 Niveauen Normalized, mir relativ Niveau vun loosse-7A Emballagen zu exosomes pro den Niveau vun bewosst loosse-7A (Dorënner 4F) berechent. Als Resultat, war de Montant vun exosomal loosse-7A vill grouss an AZ-P7a Zellen wéi aner sechs Zellen, suggeréiert datt AZ-P7a Zellen selektiv waren an aktiv Famill loosse-7 miRNA secreted an der extracellular Ëmwelt via exosomes. VerfÜgung am Moment studéieren, datt mer, datt mer-7 miRNA Famill an der extracellular Ëmwelt via exosomal Transport secreted war, déi gastric Kriibs Zell Linn, AZ-P7a zu engem metastatic spezifesch war. Loosst-7 miRNA Famill zu Mënsch besteet aus 10 Message vu 13 Etüd [30]. Am Allgemengen, loosse-7 miRNAs als entholl suppressor Akt vun gezielt oncogenes wéi RAS VerfÜgung a HMGA2 VerfÜgung a loosse-7 miRNAs sinn zu vill Cancers aus staark Organer downregulated [31]. AZ-P7a Zellen Besëtz vun engem metastatic Fähegkeet mat peritoneal Weiderleede vun Sauna Mais [32], [33]. Sou, proposéieren mir, datt d'exosomal release vun loosse-7 miRNAs an der extracellular Ëmwelt Resultater am Ofsenkung vun Anti-tumorigenic Effekt am Zellen, déi hir oncogenesis an invasiveness ze erhalen Féierung. Op der aner Hand, loosse-7 miRNAs manner oft eng oncogenic Funktioun spillen, well déi hypomethylation vun Ausdrock ze klammen um loosse-7 nët [36] oder caspase-3 mRNA gezielt [37]. An deem Fall kann de exosomal release vun loosse-7 miRNAs Ursaach Transformatioun an Zil- Zellen duerch hir oncogenic Eegeschafte II. VerfÜgung An Patienten mat haett Kriibs, Erhéijung vum ganzen Niveau vun exosomes an hir miRNAs Verglach zu Kontrollen [8 ]. Et ass bewisen, dass entholl exosomes zu Cancers vun spontan T Zell apoptosis [38] immun Auswee Mechanismus induce - [40]. An dëser Etude, hu mir eenheetleche Wirklechkeet an Beräicherung vun RNAs zu exosomes aus metastatic AZ-P7a Zellen gewisen. Dëst kann duerch hir tumorigenicity reflektéiert ginn. VerfÜgung miRNAs si ganz stabil am Blutt Plasma an serum zënter aus RNases geschützt [17]. Sou, mécht et miRNA Niveauen fir Medeziner Diagnos entholl lues a biomarkers getest. Wéi ass et geschitt? Chin et al. hunn zwee hypotheses fir d'Quell vun miRNAs ugeholl Bluttprouwen op libre; et kënnt zu engem Resultat vun entholl Zell Doud an lyses oder release vun entholl Zellen an der extracellular microenvironment vun Blutt kritt [19] wéinst ginn. Op de Géigendeel ze Operstéiungszeen Zellen, observéiert mir datt d'Quantitéiten vum Ganzen RNAs zu Kultur Medien sech relativ héich wéi zu exosomes fir Zellen mat Propriétéit Wénkel gekäppt wéi NCI-H69, Lu-135, an Colo205. Dëst increment schéinen wahrscheinlech an der kontaminéierte RNAs aus dout Zellen zu Kultur Medien. VerfÜgung Fir d'Entdeckung vun Roman Blutt entholl lues a biomarkers, omics Approche proteomics an transcriptomics dorënner sinn gehaal entweder direkt Analyse vun Bluttprouwen oder Uwendung vun profiling an Otemschwieregkeeten Echantillon. Et sinn widderspréchlech Rapporten wann ob der Profiler vun miRNA an mRNAs an Glukose verbënnt si parallel mat der Profil d'entholl. Der Ënnerschrëft vun exosomal miRNAs spigelt déi vun der Origine entholl Zellen zu Patiente mat haett adenocarcinoma [8] an Broscht Kriibs [41]. Wéinst dem Skog et al. datt microarray Analyse fir mRNA vu Gehirtumoren Zellen an den entspriechende exosomes réischt mRNAs exklusiv erwëscht an microvesicles, Spekuléieren datt mRNAs sinn en der zu enger spezifescher Regioun vun Zytoplasma [3] ofgeleet hunn gewisen. Zousätzlech, Tanaka et al. bewisen hunn, datt de Niveau vun Mir-92a am Blutt Plasma vun Leukämie Patienten ofgeholl während sengem staarke Wëllen an der Otemschwieregkeeten Echantillon [24] fonnt gouf. Eis Resultater op selektiv Beräicherung vun loosse-7 miRNA Famill vun AZ-P7a Zellen-ofgeleet exosomes fit mam Fonds de Fall. Ausser Zil- Molekülle miRNAs ofgeleet vun libre entholl Zellen sinn, seet et virsiichteg Enquête gi waren miRNA Profiler an Otemschwieregkeeten Echantillon fir ze erkennen an serum oder Plasma Echantillon ze benotzen. VerfÜgung Well exosomes zu hematopoietic Zellen souwéi epithelial Zellen produzéiert gi , Blutt libre enthält exosomes aus béide Typ vun Zellen ofgeleet. Am Allgemengen, exosomal Profiler vu Proteinen, mRNAs, an miRNAs zu serum a Plasma, exosomes ofgeleet vun erhéijen mat epithelial Charakteristiken sinn getrennt vun deenen aus hematopoietic Zellen [8], [13] ze ermëttelen. Dat ass mat Bezuch Offäll mat antibodies géint Molekülle standing wéi EpCAM datt op der Uewerfläch vun epithelial Zellen auszedrécken. Eis Conclusiounen datt et sech ähnlech Niveau vun loosse-7 miRNA Famill tëscht exosomes a Kultur Medien vum AZ-P7a Zellen hindeit, datt dës miRNA Niveauen exosomes vu Krankheete Echantillon wéi serum a Plasma ouni Isolatioune gemooss ginn. VerfÜgung An Conclusioun, hien huet dës Etude, déi loosse-7 miRNA Famill gastric Kriibs Zell Linn, AZ-P7a Zellen zu exosomes aus engem metastatic räich ass. Well loosse-7 miRNAs zu Prolifératioun Prozess bedeelegt sinn [31], kënnen hir exosomal secretion eng wichteg Roll an tumorigenesis an Metastasen Leeschtung. VerfÜgung Zell Kultur VerfÜgung Mënsch Mo. Kriibs Zell Linnen (AZ-521, MKN45, KATOIII, an NUGC-3), Mënsch haett Kriibs Zell Linnen (SBC-3, Lu-65, Lu-135, an KNS-62), a mënschlech pancreatic Kriibs Zellen ( Kostüm-2) sech vum japanesche Collection vun Research Bioresources kaaft. Mënsch Mo. Kriibs Zellen (SNU-1), Mënsch haett Kriibs Zell Linnen (DMS-53, DMS114, NCI-H69, A549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, an HCC827), Mënsch Vollek Zellen (MSTO-H211), Mënsch colorectal Kriibs Zell Linnen (SW480, SW620, Colo205, LoVo, an HCT116, Mënsch pancreatic Kriibs Zell Linnen (BxPC-3, AsPC-1, Panc-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45, an Capan-2), Linnen mënschlech Aarbecht Kriibs Zell (PC-3, SU145, an LNCaP), a mënschlech Zell Linnen Broscht Kriibs (T-47D, McF7, SK-BR-3, BT -474, a MDA-MB-231) sech vum amerikanesche Type Kultur Collection. MKN28 (mënschlech Mo. Kriibs Zellen) an PSN-1 (mënschlech pancreatic Kriibs Zellen) sech aus Jonker-biologesch Laboratoiren an europäesch Collection vun Zell Kultur kaaft hut, bzw. . Mënscherechter Zell Linnen Mo. Kriibs, AZ-P7a [32], [33] an MKN45P [42] huet Geschenk vum Drs. Yutaka Yonemura an Yoshio Endo. an AZ-521 an AZ-P7a Zellen, huet kee RT-Hinnen alleguer Produiten observéiert fir 14 ëm dorënner HPV16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, HIV1, HIV2, an ADV Typ 1 (Donnéeën net gewisen), déi dës ëm souwuel d'Zell Linnen ausser Wonn . Zellen sech am RPMI-1640 mëttelfristeg (Fläch-Aldrich) ergänzt mat 10% Hëtzt-inactivated An et Bovine serum (Invitrogen), 100 U /ml penicillin, an 0,1 mg /ml vun streptomycin. VerfÜgung Production an Isolatioun haten vun exosomes VerfÜgung Operstéiungszeen Zellen sech rangéiert vun 3 × 10 at passenden Zuel vun Zellen zu 150 mm-Platen rakommen Transmissioun Elektronen microscopy VerfÜgung D'pelleted exosomes deer sech mat gläiche Quantitéite vun frësch preparéiert 2% glutaraldehyde vun PBS, incubated Nuecht op 4 ° C, mat 1% Osmium tetroxide vun PBS bei 4 ° C fir 2 h, a léif an enger graded Serie vun Ethanol B. ‧. No eppes, goufen d'Echantillonen zu propylene It transferéiert an epoxy resin Quetol 812 (Nisshin EM) Ënnerbewosstsinn. Ultrathin Rubriken sech mat Ultracut UCT (LEICA) Géigewier, Kierchefënster mat uranyl acetate a Féierung citrate, an observéiert mat der Jem-1230 Elektronen Microscope (JEOL). Immunoelectron microscopic Analyse gouf no der Method vum Xiao et al beschriwwen gesuergt. [43] mat klengen Ännerungen. An dowéinst, sech exosomes gemëscht a mat Maus anti-Mënsch CD63 monoclonal antibody incubated (Katalog keen. Sc-51662, Santa Cruz) fir 1 h bei Raumtemperatur. D'Prouf war d'Membran Uewerfläch vun enger Koffer ech erschloen op fir 1 h bei Raumtemperatur an incubated (Astrofotographie /Kuelestoff 400 ech, Nisshin EM bedeckt). No wäschen mat PBS, immunogold conjugated Geess anti-Maus IgG (Katalog keen. EM.GMHL15, BBInternational) um 1:20 verdënntem war op der dënner erschloen. De Koffer ech war fir 30 min am droplets mat sengem Membran Uewerfläch konfrontéiert erof bei Raumtemperatur lenks. No wäschen mat PBS, war uranyl acetate Drëpsen op de Koffer ech Uewerfläch huet a bei Raumtemperatur fir 30 den Kierchefënster. Exosomes mat schwaarz colloidal Gold Deelercher op der capsular Schläimhait sech als positive ënnert der Transmissioun vun Elektronen microscope markéiert. VerfÜgung Western blot Analyse VerfÜgung BTS an exosomal ufale sech gewäsch, an engem lysis gefiermt resuspended [7.5 M urea (Fläch-Aldrich), 2,5 M thiourea (Fläch-Aldrich), 12,5% glycerol (Wako), 50 mm Tris, 2,5% n-kennt-Beta-D-glucoside (Fläch-Aldrich), 6,25 mm Tris (2- carboxyethyl) phosphine hydrochloride (Fläch-Aldrich), 1,25 mm protease inhibitor (Katalog keen. P2714, Fläch-Aldrich)], an incubated fir 1 h bei 4 ° C der Rotator RT-50 (TAITEC benotzt). No centrifugation bei 14.000 × g fir 60 min bei 4 ° C, gouf de supernatant gesammelt an FAQ Konzentratioun vun der Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad) sech war. En Deel vu Proteinen (10 μg) waren déi kachen an Laemmli Prouf gefiermt denatured, op 10% SDS-polyacrylamide gels lafen, an transferéiert ze Immobilon-P PVDF Schläimhait (0.45 μm pore Gréisst, Millipore). D'blots sech fir 1 h mat 5% Nët-Fett dréchen Mëllech an Tris-gefiermt Salins Tween 20 (10 mm Tris-HCl, pH 7.5, 150 mm NaCl an 0,01% Tween 20) wouvun gespaart. No Outil d'Schläimhait sech mat all Primärschoul antibody oder antiserum dorënner Kanéngchen anti-Tsg101 serum (Katalog keen. T5951, Fläch-Aldrich), Geess incubated anti-Aip1 /Alix serum (Katalog keen. Sc-49268, Santa Cruz), Maus monoclonal Anti-CD29 /β1-integrin (Katalog keen. sc-610468, BD Biosciences), a Maus monoclonal anti-BIP /Grp78 (Katalog keen. 610979, BD Biosciences) op engem dilution vun 1:200 fir 1 h bei Raumtemperatur. D'blots sech dann mat dem entspriechend anti-IgG Secondaire antibody conjugated mat horseradish peroxidase (Jackson Laboratoiren) op engem dilution vun 1:2,000 fir 1 h bei Raumtemperatur incubated. Spezifësch Proteinen sech mat der ECL System (GE Gesondheetswiesen) an der Fujifilm bloer Image Organer LAS3000 (Fuji Film) visualized. D'molekulare FAQ Gewiicht war mat der Villes Plus Protein Bestëmmungen (Bio-Rad Laboratoiren) Mëllechstrooss. VerfÜgung RNS Isolatioun VerfÜgung Fir RNS Isolatioun vun Kultur mëttelgrouss, huet Zellen rakommen wéi uewen beschriwwen. 48 h no gewuess, Kultur mëttelfristeg war fir 5 min an zousätzlech 2.000 × g fir 10 min bei 800 × g gesammelt an centrifuged. D'supernatant war op engem 0,22 μm pore polyethersulfone Membran filter (Corning) zu filtration ënnerworf, gefollegt vun Konzentratioun mat engem 5.000 MW präventive Membran (Centricon Plus-70, Millipore). D'Finale Volume vun supernatant war ongeféier 10-20 ml vum Original Volume vun 250-500 ml. D'supernatant war mat gläiche Volume vun QIAzol Lysis Reagent (QIAGEN) gemëscht an duerno d'Prozedur fir RNS Isolatioun ënnendrënner beschriwwe. Total RNS war vun Zellen, exosomes, oder Kultur Medien mat der miRNeasy Mini Kit (QIAGEN) laut der Fabrikatioun d'Instruktioune isoléiert. Ewechzehuelen Frankräich DNA, 40 μg vun bewosst total RNS sech mat 40 Unitéiten vun RQ1 RNase-Free DNase (Promega) fir 30 min an der Presenz vun 40 Unitéiten vun RNasin Plus RNase Inhibitor (Promega) bei 37 ° C incubated. Fir total RNS aus exosomes a Kultur Medien, all Montanten vun Brutto Produiten waren an déi selwecht Prozedur ausser der Benotzung vu 5 U DNase behandelt. RNS war sidd der RNeasy MinElute Donatiounen Kit benotzt (QIAGEN) no der Taktik vum Produzent. D'RNS Echantillon waren mat engem NanoDrop spectrophotometer (Thermo Fisher Wëssenschaftlech) laachen an évaluéieren d'Agilent klenger RNS Kit mat an d'Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). VerfÜgung Microarray Analyse VerfÜgung Fir miRNA profiling, 100 NG an 20 NG vun bewosst an extracellular total RNAs, respektiv, goufen fluorescence-Label der miRNA Komplett Etikette Reagent an Hyb Kit benotzt (Agilent Technologies) no Fabrikatioun d'Protokoll (Agilent miRNA microarrays Versioun 2.2). Déi detailléiert miRNA Analyse gouf mat de Mënscherechter miRNA Microarray Kit (8 × 15 K) Ver.3.0 (Agilent) gesuergt. Hybridization Signaler sech mat der DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies) fonnt. D'gescannt Biller waren mat der Agilent Spillfilmer Extraktioun Software an Daten analyséiert Analyse Leeschtung war d'GeneSpring GX Software (Agilent Technologies) benotzt. D'Daten an dësem mëttelalterlech Handschrëft diskutéiert hunn an NCBI d'Gene Expression Omnibus (Geo) a si accessibel duerch Geo Serie Bäitrëtt Zuel GSE21350 verschéckt goufen: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE21350). VerfÜgung Réckproduktioun Transkriptiouns (RT) a grouss RT-Hinnen alleguer fir miRNA Analyse VerfÜgung Chemeschen miRNA Niveauen sech mat der Obwuel Biosystems 7900 HT liichtkraaftarm Detektioun System real-Zäit RT-Hinnen alleguer alles mat (Obwuel Biosystems), TaqMan® Gene Expression assay (Obwuel Biosystems) fir Mënscherechter loosse-7A (assay ID 000377), loosse-7b (assay ID 002619), loosse-7c (assay ID 000379), loosse-7d (assay ID 002283 ), loosse-7 (assay ID 002406), loosse-7f (assay ID 000382), loosse-7g (assay ID 002282), loosse-7i (assay ID 002221), an U6 snRNA (assay ID 001973) als endogenous Kontroll . Zéng NG vun insgesamt RNS waren Transkriptiouns zu ëmgedréint mat TaqMan® Universal Hinnen alleguer Master Mix Nee AmpErase (Obwuel Biosystems) an der jeweileger TaqMan® reagents fir Zil- Genen. RT-Hinnen alleguer war an engem total Volume vun 20 μl Reaktioun Mëschung no der Fabrikatioun d'Protokoll duerchgefouert. Amplification war duerchgefouert wéi follegt: 95 ° C fir 10 min, 40 Zykle vun 95 ° C fir 15 s an 60 ° C fir 60 ass. Echantillon waren am triplicate als biologesch behaapten oder quadruplicate als technesch behaapten analyséiert. D'miRNA Niveauen sech aus dem Cycle loung (Kosovo), de Komparativ CT Method, an normalization vum Niveau vun U6 snRNA an all Prouf definéiert. Fantastesch Luucht oder erof an all miRNA Niveau vun Zell Strecken vun Referenz zu de Niveau vum AZ-P7a Zell Linn getest alles. VerfÜgung Mir soen de Membere vun der Shizuoka Cancer Center Research Institut fir hir vill hëllefräich Suggestioun. Mir soen och Drs. Yutaka Yonemura an Yoshio Endo fir Geschenk vum AZ-P7a an MKN45P Zell Linnen. VerfÜgung
Aféierung VerfÜgung
Resultater VerfÜgung
Diskussioun VerfÜgung
spontan a Methode VerfÜgung
Arbeschterlidder VerfÜgung
Fecal Transplantatioun vu bestëmmte Spender besser wéi anerer
COVID-19 Restriktiounen hunn zu 86 Prozent erofgaang an Norovirus Infektiounen an den USA gefouert,
Leaky Darm a mikrobiell Dysbiose kéinte bäidroe fir den Zytokin Stuerm a schwéier kranke COVID-19 Fäll
Eng schmuel Esophagus opmaachen
Berichten Etiketten op kommerzielle Kefir Produkter mikrobiell Niveauen korrekt?
Firwat COVID-19 Patienten méi pathogen Bakterien an hiren Nues hunn
Oral Hygiène a Gravitéit vum COVID-19-d'Verbindung
Britesch Fuerscher hunn eng Verbindung fonnt tëscht enger schlechter mëndlecher Hygiène an der Schwéierkraaft vun der COVID-19 Krankheet verursaacht duerch e schwéieren akuten Atmungssyndrom Coronavir
Laangfristeg Antibiotike Notzung a Preemie fördert Medikamentresistent Darmbakterien
Ganz virzäiteg Puppelcher si dacks krank a brauchen Antibiotikebehandlung fir hiert Liewen ze retten. Wéi och ëmmer, wann dës Form vun Therapie 20 Méint oder méi dauert, et kann den Darmmikrobiom op l
Thiopurine kéinte hëllefen eng viral Replikatioun a mënschleche Coronavirus ze stoppen
Fuerscher vum Departement Mikrobiologie &Immunologie, Dalhousie Universitéit, Universitéit vu Calgary, an Departement fir Biochemie a Molekularbiologie, Universitéit vu British Columbia, Kanada, huet