PLoS ONE: Tegul-7 MicroRNA Šeimos selektyviai išskiriamas į tarpląstelinio Aplinkos per Exosomes į skrandžio vėžiui ląstelių linija

Anotacija

Fonas

Exosomes vaidina svarbų vaidmenį ląstelių-to-ląstelių komunikacijos, orientacija ląsteles perkelti exosomal molekulės įskaitant baltymų, mRNR ir mikro RNR (miRNAs) An endocytosis- kaip kelias. miRNAs yra maži nekoduojamame RNR molekulės vidutiniškai 22 nukleotidų ilgio, kurie reguliuoja daugelį biologinių procesų, įskaitant vėžį patogenezę ir tarpininkauti geną žemyn reguliavimo nukreipiant mRNR sukelti RNR degradacija ir /arba trukdyti su vertimu. Naujausi pranešimai leidžia manyti, kad miRNAs galima stabiliai aptikta kraujo plazmoje ir serume, nes miRNAs yra pakuojami exosomes būti apsaugoti nuo RNR degradacija. Taigi, profiliavimo exosomal miRNAs esate reikia išsiaiškinti tarpląstelinį signalizacijos ir atrasti romaną ligos žymenį, taip pat.

Metodologija /Pagrindinės išvados

Exosomes buvo izoliuotas nuo išaugintų vėžio ląstelių linijas, o jų kokybė buvo patvirtinta iki analizių perdavimo elektroniniu mikroskopu ir Imunoblotingo. Vienas iš ląstelių linijų išbandytų A skrandžio vėžiui ląstelių linija AZ-P7a parodė aukščiausią RNR derlių išleistas exosomes ir skiriamojo figūrą morfologijos. Be to, RNR buvo išskirta iš ląstelių ir kultūrų terpių ir profilius šių trijų Mirna frakcijų buvo gauti naudojant mikrogardeliq analizę. Lyginant signalo intensyvumo microarray duomenis ir po patvirtinimo, naudojant PGR analizė, mes nustatėme, kad tegul-7 Mirna šeima buvo gausu tiek ląstelės viduje ir ekstraląsteliniuose frakcijas nuo AZ-P7a ląstelių, o mažos metastazavusiu AZ-521, tėvų ląstelių linija AZ-P7a, taip pat kitų vėžio ląstelių linijų neparodė tokį polinkį.

Išvados /Reikšmė

ir tegul-7 Mirna šeimos sodrinimo į ekstraląsteliniuose frakcijas, ypač į exosomes nuo AZ-P7a ląstelių gali atspindėti savo onkogeninių charakteristikas, įskaitant Tumorigenesis ir metastazių. Nuo tegul-7 miRNAs paprastai vaidina naviko slopinančio vaidmenį orientacija onkogenų tokių kaip , anksčiau parsisiųsti ir HMGA2
, mūsų rezultatai rodo, kad AZ-P7a ląstelės išleisti tegul-7 miRNAs per exosomes Into the Ekstraląstelinė aplinka išlaikyti savo onkogenezei

nurodomoji dalis:. Ohshima K Inoue K Fujiwara A Hatakeyama K Kanto K Watanabe Y et al., (2010) Tegul-7 MicroRNA Šeimos selektyviai išskiriamas į tarpląstelinio Aplinkos per Exosomes į skrandžio vėžiui ląstelių linija. PLoS ONE 5 (10): e13247. Doi: 10,1371 /journal.pone.0013247

redaktorius: Stefanas Wölfl Universität Heidelberg, Vokietija

Įstojo: balandžio 14, 2010; Priimta rugsėjo 10 ", 2010; Paskelbta: Balandis 8, 2010

Visos teisės saugomos: © 2010 Ohshima et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Darbas parėmė bendradarbiaujant su naujoviškų technologijų ir pažangiųjų tyrimų iš švietimo, kultūros, sporto, mokslo ir technologijų Japonijos ministerijos evoliucinių erdvės (miesto plotas) dotacija. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Ląstelės išskirti įvairių tipų mažoms membraninių pūslelių. Exosomes yra vienas iš pūslelių su 30-100 nm skersmens ir physicochemically skiriasi nuo kitų išskiriami pūslelių [1]. Viduje exosomes, korinio genų produktų, įskaitant baltymų, mRNR, ir mikro RNR (miRNAs) yra supakuoti ir šios molekulės gali būti perkelti į gaunančių ląstelių pristatyti savo molekulinę signalizacijos, pavyzdžiui, onkogenezei [2] - [4] ir imuninis atsakas [1], [ ,,,0],5]. Exosomes paleidžia daugelio tipų ląstelių [6], kuris taip pat yra naviko ląstelių, epitelio ląsteles ir hematopoetinės ląstelės, pavyzdžiui, retikulocitų, citotoksinių T limfocitų, Epstein-Barr viruso-transformuota B ląstelių, mastocitai, dendritinių ląstelių, ir trombocitų. Išskiriami exosomes buvo izoliuotas ir pasižymi in vitro
iš išaugintų ląstelių linijų [7], kartu su vivo
organizmo skysčiuose, [7], įskaitant kraujo [8], su šlapimu [9], seilių [10], amniono [11], ir piktybinės pleuros ertmėse [12]. Nuo pastebėta daugelyje proliferuojančias ląstelių tipų, tai suprantama, didina vėžinių ląstelių, kaip rodo jų aktyvesnio kraujo plazmoje ir pleuros ertmėse sergančiųjų vėžiu [8], [12]. Tai padidino buvimas neinvazinių kūno skysčiais vėžiu sergantiems pacientams paspartėjo į profilį molekulinius komponentus į exosomes atrasti kliniškai naudingus naviko žymenų ir biologinius žymenis [3], [7], [13].

miRNAs yra klasė nekoduojamame mažų RNR, kurios dalyvauja po transliacijos reguliuoja genų ekspresiją, slopindamas tiek stabilumą ir vertimas mRNR [14]. Naujausi duomenys rodo, kad Mirna mutacijos ar misexpression koreliuoja su įvairiais žmogaus vėžio ir rodo, kad kai kurie miRNAs gali veikti kaip onkogenų ar naviko slopintuvai [15], [16]. Analizuoti RNR, tai visada apsvarstyti jų stabilumą nuo degradacijos pagal RNaze. Naujausi duomenys rodo, kad endogeninių plazmoje miRNAs kraujo mėginiuose yra stabiliai aptinkama tokia forma, kuri yra atspari RNaze veiklos [17], liudija identifikavimo miRNAs kūno skysčiuose, pvz kraujo [17] - [24], šlapimo [25], ir seilių [10], [26].

išauginti vėžio ląstelės buvo panaudotos ieškoti naviko žymenų. Visų pirma, identifikuojantys baltymai ir peptidai, išskiriami į terpėje buvo sukurta proteomiką pagrįsto požiūrio [27], [28]. Kaip ir molekulinės parašą exosomes, buvo atliktas proteomiką kaip pat kaip transkriptomika analizes atskleisti tumorigenezei ir nustatyti naviko žymenų kandidatų sąrašą [2] - [4], [7], [29]. Čia, nustatyti Mirna susiję su Tumorigenesis ir metastazių, mes atliekame daug Mirna analizę trimis mobiliojo ryšio frakcijų, įskaitant ląstelių, exosomes ir laikmenoje išaugintų ląstelių. Reitingas duomenis šių ląstelėje ir ekstraląsteliniuose miRNAs gautų mikrogardeliq analizės, mes nustatėme, kad tegul-7 Mirna šeima yra turtinga visų frakcijų nuo AZ-P7a ląstelių A skrandžio vėžiui ląstelių linija, kuri gamina homogenišką ir kondensuotas morfologiją ir aukštos atkūrimas norma exosomal miRNAs. Šios išvados buvo atskirtas nuo kitų ląstelių linijas, įskaitant plaučių vėžio ląstelių linijų (SBC-3, NVI-H69, ir DMS53), storosios žarnos vėžio ląstelių linijas (SW480 ir SW620) ir AZ-521, tėvų ląstelių linijos AZ-P7a. MANYDAMOS, kad tegul-7 Mirna šeimos funkcijas daugiausia vėžinių slopintuvas genų [30], kad būtų nukreipti onkogenų tokių kaip , anksčiau parsisiųsti ir aukštos mobilumo grupė A2 ( HMGA2
) [31], mes siūlome, kad AZ -P7a ląstelės selektyviai išskirti tegul-7 miRNAs į tarpląstelinio aplinką per exosomes išlaikyti savo tumorogeninį ir metastazavusiu polinkių.

rezultatai

išskyrimas exosomes iš įvairių vėžinių ląstelių linijų

Exosomes yra pagaminti iš vidinių ląstelėse iki ekstraląstelinio aplinkos per egzocitozės būdu-kaip būdo [1]. Be to, skirti naudoti kūno skysčiuose, pvz serumo ir plazmos iš periferinio kraujo [7], [8], exosomes randama iš fermentuotų [7] ląstelių terpėje, sudarytos geresnės galimybės nustatyti exosomal molekulių įskaitant baltymų, mRNR, ir miRNAs, skirtos naudoti siekiant jų klinikiniam naudojimui. Profiliavimo tokius exosomal molekules kultūroje vėžinių ląstelių paskatino atrasti romaną kandidatūrą žymeklį ir antigeną, vėžio diagnostikos ir imunoterapija [7]. Šiame tyrime dėl profiliavimo exosomal miRNAs tikslais, pirmiausia izoliuoti exosomes iš terpėje 46 vėžio ląstelių linijas su įvairiais audinių tipų, tarp kurių yra 8 bambą, 16 plaučių, 5 gaubtinės žarnos, 9 už kasos, 3 prostatos ir 5 krūties. Po ląstelės buvo auginamos 48 h, exosomes buvo surinkti su eilės centrifuguojant ir molekulinės masės ribinės membranos, kaip aprašyta medžiagų ir metodų derinį. Jų grynumas exosomal frakcijų buvo įvertintas analizių perdavimo elektroniniu mikroskopu ir Imunoblotingo. Perdavimo elektronų mikroskopija parodė apskritojo formos vezikulines membranos struktūras maždaug per 100 nm skersmens dydžio. Tarp trijų ląstelių linijų, SBC-3 AZ-521, ir AZ-P7a, ji yra suinteresuota, kad morfologija nuo AZ-P7a ląstelių buvo labiau vienarūšiai, kondensuotas nei kitų ląstelių (1a pav.) Imunoelektronine mikroskopija parodė, kad ekstraląstelinės dalies dalelės yra išskirti iš mitybinės terpės, kai AZ-P7a ląstelėse reaktyvumas su antikūnu prieš CD63, vienas iš exosomal membranos baltymų, dėl kapsulinio membranų (1b paveiksle). Iš žinomų exosomal baltymų, įskaitant CD29 /β1-integrinu, Aip1 /Alix ir naviko jautrumo geno 101 (Tsg101) buvimas buvo patvirtintas Vakarų dėmė analizės, o baltymas lokalizuota Endoplazminis tinklas, Bip /Grp78 buvo neaptinkama (1c pav). Šis rezultatas rodo, kad medžiagos, gautos iš kitų ląstelinių sekcijas exosomal frakcijų užteršimas buvo minimalus. Iš exosomal baltymų nuo AZ-P7a ląstelių išeiga buvo 10 kartų didesnis nei nuo AZ-521 ląstelių; ~2.5 Mg baltymai gaunami iš 1 × 10 ^{8 AZ-P7a ląsteles.}

sodrinimas exosomal RNR, gautų iš AZ-P7a ląstelių

Po sukėlėjo išskyrimo, exosomal viso RNR buvo išskirtas iš 46 išauginti ląstelių linijos. Įdomu tai, kad RNR pajamingumas nuo AZ-P7a ląstelės buvo daug didesnis, nei iš kitų ląstelių (2a pav.) Į ilgio pasiskirstymas parodė, kad dideliais kiekiais mažų RNR į exosomes centro (ekranų, 2b pav) buvimą. Reikia pažymėti, kad yra didelis skirtumas iš viso exosomes ir exosomal Mirna lygių tarp pacientų, sergančių plaučių adenokarcinomos ir [8] kontrolę. AZ-P7a ląstelių linija buvo įkurta pakartotinai Sėjimas į tėvų AZ-521 ląstelių pelėms, parodė didelį peritoninės-metastazavusiu potencialo [32], [33]. Taigi, didelis derlingumas tiek RNR ir baltymų kartu su morfologines savybes AZ-P7a ląstelių gali būti priskirtas prie jų aukštų kancerogeniniam ir metastazavusiu polinkių. Nuo miRNAs buvo aptikta ląstelių be kūno skysčiuose [17] - [20], taip pat atlikti tiesioginį izoliaciją visų RNR iš mitybinės terpės be tvarkos izoliuoti exosomes. Iš viso RNR iš terpėje sumos paprastai buvo didesnis, nei iš exosomes (2A pav.) RNR pasiskirstymas ilgio parodė, kad mirna frakcijos buvo aptikta intervale 10-40 nukleotidų ilgis RNR, pagamintus iš mitybinės terpės (dešinės skydelyje), taip pat exosomes centro (grupė) nuo AZ-P7a ląstelių (2b pav). Pagal gamybos protokole dėl Bioanalyzer, viršūnės su ilgiau nei 40 nukleotidų ilgio yra kitų smulkių RNR įskaitant tRNAs ne 70~90, 5S ribosomų RNR 100 ir 5.8S ribosomų RNR 150, kaip pastebėta ląstelėje frakcija (kairiajame skydelyje) , Šie rezultatai rodo, kad gali egzistuoti miRNAs į terpę ne exosomal frakcija nors RNR yra manoma, kad būti apsaugotas nuo RNases kaip yra supakuotas exosomes. Ypač, palyginti su lipnių ląstelių RNR išeigą prieaugis buvo nepaprastai didesnis plaukiojantieji ląstelių (NVI-H69 Lu-135) ar ląstelių mišinio populiacijų plaukiojantis ir lipnių ląstelių (Colo205), kuri gali atsispindėti užteršimo RNR sąsiauris nuo lizuotų ląstelių, kurios buvo nuolat paliktų terpėje.

Mirna profiliavimo "mikrogardeliq analizės

Mirna profilius ląstelėje ir ekstraląsteliniuose frakcijų lėmė mikrogardeliq analizės septynerius vėžio ląstelių linijas, įskaitant AZ- 521 AZ-P7a, SBC-3, NVI-H69, DMS53, SW480 ir SW620. Mėginiai iš terpėje taip pat exosomes numatytos hibridizacijos signalai (3 paveikslas), nurodant, kad miRNAs šiuose ėminiuose egzistavimą. Iki metu, analizuojant microarray duomenis Mirna tarp mėginių, nebuvo padaryta jokių aiškių metodų normalizuoti signalo intensyvumo, nes sunku rasti tinkamą vidaus standartinė medžiaga [34]. Taigi, Mirna mikrogardeliq duomenys buvo apskritai analizuojami be normalizavimo, darant prielaidą, kad bendras kiekis įvesties RNR yra pastovus tarp mėginių [34], [35]. Šiame tyrime, po vidutiniškai Mirna microarray duomenis tarp dviejų lygiagrečių, mes užėmė miRNAs pagal jų signalo intensyvumo. Mes nustatėme, kad leisti-7 Mirna šeimą, pavyzdžiui, leisti-7a, tegul-7b, tegul-7c, tegul-7d, tegul-7e, tegul-7f, tegul-7g ir tegul-7i buvo aptikta gana didelis signalų beveik visoje iš ląstelėje frakcijas septynių ląstelių linijas (1 lentelė, 3 pav.) Tačiau nėra arba mažai signalo intensyvumas į tegul-7 miRNAs buvo aptikta ekstraląsteliniuose frakcijų, išskyrus abiejų ekstraląsteliniuose frakcijas AZ-P7a ląstelių ir mitybinės terpės frakcija iš NVI-H69 ląstelių (1 lentelė, 3 pav.) Ypač, abiem ekstraląsteliniuose frakcijas AZ-P7a ląstelių, visi aštuoni tegul-7 miRNAs buvo aptikta nors tegul-7g rangas buvo mažesnis nei kitų septynių tegul-7 miRNAs. Remiantis skirtingų modelių tegul-7 Mirna lygių tarp trijų mobiliojo ryšio frakcijas, mes suskirstė septynis ląstelių linijas į tris grupes (3 paveikslas) taip; (1) AZ-P7a, ląstelės, kurios leidžia-7 miRNAs buvo rasti visų trijų frakcijų (2), AZ-521 kartu su SBC-3, DMS53, SW480 ir SW620, ląstelės, kurios leidžia-7 miRNAs paprastai buvo rasta tik ląstelėje frakcijos, (3) NVI-H69, ląstelės, kurios leidžia-7 miRNAs buvo rasta ląstelėje frakcijų, taip pat mitybinės terpės tam tikru mastu.

AT-PGR analizė ląstelės viduje ir tarpląstelinio let- 7 Mirna šeimos

tada atliekama kiekybinė RT-PGR už aštuonių tegul-7 Mirna šeimos patvirtinti mikrogardeliq duomenis. tegul-7 miRNAs buvo lengvai aptinkama ląstelėje ir ekstraląsteliniuose frakcijas AZ-P7a ląstelių (4a pav) ir AZ-521 ląstelių (4b pav.) Į tegul-7 miRNAs per įvesties RNR lygis paprastai buvo didesnis ekstra frakcijos nuo AZ-P7a ląstelių nei nuo AZ-521 ląstelių. Normalizuoti tikslinių miRNAs, gautas RT-PGR lygius, U6 snRNA buvo dažniausiai jis naudojamas kaip vidaus kontrolės. Mes stebėjo U6 snRNA buvimą visose trijose frakcijose nuo AZ-P7a ląstelių ir AZ-521 ląstelių (4c pav), o tada palyginti su let-7 miRNAs tarp atitinkamų frakcijų iš šių dviejų ląstelių linijų lygį. Po normalizavimo, iš let-7 miRNAs lygiai taip pat atvangos 7a, tegul-7B, tegul-7c, tegul-7d, tegul-7e, ir tegul-7i tiek iš exosomes ir kultūra žiniasklaidos frakcijas nuo AZ-521 ląstelės buvo Sumažinome, palyginti su tais, nuo AZ-P7a ląsteles. Priešingai, nebuvo didelio skirtumo tarp ląstelėje lygių tegul-7 miRNAs. Mes šalia palygino exosomal lygį tegul-7a nuo AZ-P7a ląstelių su kitų vėžio ląstelių linijas, įskaitant SBC-3, NVI-H69, DMS53, SW480 ir SW620, ir nustatė, kad tegul-7a lygis tik iš SW620 ląstelių buvo gana arti (0,7 karto) iki tokio lygio, nuo AZ-P7a ląstelių (4e pav). Reikėtų pažymėti, kad ląstelėje lygis atvangos 7a nuo SW620 ląstelių buvo maždaug 3,5 karto daugiau gausi nei iš AZ-P7a ląsteles. Remiantis šiais rezultatais, mes prielaidą, lokalizacijos atvangos 7a į ląstelių ir exosomes (5 paveikslas) frakcijų, ir atliko tolesnį tyrimą. Normalizavosi U6 lygius, mes apskaičiuojamas santykinis lygis tegul-7a supakuoti exosomes vienam iš ląstelių tegul-7a (4F paveikslas) lygių. Kaip rezultatas, exosomal suma tegul-7a buvo daug didesnis AZ-P7a ląstelių nei kitų šešių ląstelių, o tai rodo, kad AZ-P7a ląstelės buvo selektyviai ir aktyviai išsiskiria tegul-7 Mirna šeimą į tarpląstelinio aplinką per exosomes.

Diskusijos

Šiame tyrime mes atskleidė, kad tegul-7 Mirna šeima buvo išskiriamas į tarpląstelinio aplinką per exosomal transporto, kuris buvo būdingas tam skrandžio vėžiui ląstelių linijos, AZ-P7a. tegul-7 Mirna šeima žmogaus susideda iš 10 sekų 13 prekursorių [30]. Apskritai, tegul-7 miRNAs veikti kaip naviko slopintuvas nukreipiant onkogenų tokių kaip , anksčiau parsisiųsti ir HMGA2 parsisiųsti ir leisti-7 miRNAs yra downregulated daugelyje vėžio iš kietų organų [31]. AZ-P7a ląstelės turėti metastazavusiu gebėjimą peritoninės sklaidos nuogas pelių [32], [33]. Taigi, mes siūlome, kad exosomal spaudai tegul-7 miRNAs į ekstraląsteliniuose aplinkos rezultatų sumažėjimo anti-tumorogeniškas poveikis per ląstelių, kurios veda išlaikyti savo onkogenezei ir invaziškumo. Kita vertus, tegul-7 miRNAs rečiau vaidina onkogeninio funkciją, tinkamai padidinti išraiškos tuo tegul-7 lokuso [36] arba nukreipti kaspazės-3 iRNR [37] hipometilinimą. Šiuo atveju exosomal spaudai tegul-7 miRNAs gali sukelti transformaciją tikslinėse ląstelėse perduoti savo onkogeninių savybes.

Pacientams, sergantiems plaučių vėžiu, bendra iš exosomes lygiai ir jų miRNAs daugiau, palyginti su kontrole [8 ]. Buvo įrodyta, kad auglio exosomes sukelti imuninę pabėgti mechanizmą vėžio savaime T ląstelių apoptozę [38] - [40]. Šiame tyrime mes parodėme, homogeniška morfologiją ir sodrinti RNR į exosomes iš metastazavusiu AZ-P7a ląsteles. Tai gali atsispindėti jų tumorogeniš-.

miRNAs yra labai stabilus kraujo plazmos ir serumo nuo apsaugotas nuo RNases [17]. Taigi, ji daro Mirna lygius patikrintas klinikine diagnoze kaip naviko žymenų ir biologinių žymenų. Kaip tai vyksta? Taisome ir kt. pasiūlė dvi hipotezės apie miRNAs ant cirkuliuojančių kraujo mėginius šaltinio; ji gali būti dėl to, kad naviko ląstelių mirties ir lizuoja rezultatas arba išleidimo auglio ląstelių į ekstraląstelinio mikroaplinkos kraujagyslių [19]. Priešingai prie lipnių ląstelių, mes nustatėme, kad iš visų RNR kultivavimui skirtoje terpėje sumos buvo palyginti didesnis nei exosomes ląsteles su kintama nuosavybe, pavyzdžiui, NVI-H69, Lu-135, ir Colo205. Šis padidėjimas tikriausiai lėmė RNR užteršimo nuo negyvų ląstelių kultivavimui skirtoje terpėje.

Dėl naujų kraujo naviko žymenų ir biologinių žymenų atradimas, panašioms mokslo šakoms metodams, įskaitant proteomiką ir transkriptomika yra vykdoma arba tiesioginės analizės kraujo mėginiai ar taikymo profiliavimas audinių pavyzdžius. Yra prieštaringų ataskaitose, jei, ar Mirna ir mRNR profiliai kraują yra lygiagrečios su naviku profiliu. Iš exosomal miRNAs parašas atspindi, kad iš kilmės vėžinių ląstelių pacientams, sergantiems plaučių adenokarcinomos [8] ir krūties vėžio [41]. Kita vertus, Skog ir kt. parodė, kad mikrogardeliq analizę mRNR, gautų iš glioblastomos ląstelių ir atitinkamų exosomes atskleidė mRNR aptiktos tik microvesicles, tikintis, kad mRNR yra lokalizuota į konkretaus regiono citoplazmoje [3]. Be to, Tanaka et al. parodė, kad miR-92a lygis sumažėjo kraujo plazmoje ūmine leukemija sergantiems pacientams o stiprus išraiška buvo rastas audinių pavyzdžių [24]. Mūsų rezultatai selektyviosios turtinimo tegul-7 Mirna šeimos AZ-P7a ląstelių pagamintų exosomes suderinti ir su pastaruoju atveju. Nebent tikslinės molekulės yra miRNAs gautos iš cirkuliuojančių vėžinių ląstelių, tai rodo, kruopščiai tyrimą reikia naudoti Mirna profilius audinių mėginių aptikti serumo ar plazmos mėginiuose.

Nuo exosomes gaminami kraujodaros ląstelių, taip pat epitelio ląstelių , cirkuliuojančio kraujo yra exosomes gautų iš abiejų ląstelių tipo. Apskritai, ištirti exosomal profilius baltymų, mRNR, ir miRNAs į serumo ir plazmos, exosomes, gautos iš navikų su epitelio charakteristikomis, yra atskirti nuo tų iš kraujodaros ląstelių [8], [13]. Tai yra atliekama naudojant išgryninti su antikūnų prieš molekulių, tokių kaip EpCAM, kurios ekspresuoja dėl epitelio ląstelių paviršiuje. Mūsų išvados, kad buvo panašūs lygiai tegul-7 Mirna šeimos tarp exosomes ir kultūra žiniasklaidos nuo AZ-P7a ląstelių rodo, kad šie Mirna lygiai gali būti matuojamas, neatskiriant exosomes iš klinikinių mėginių, pavyzdžiui, kraujo serume ir plazmoje.

išvada, ši studija parodė, kad tegul-7 Mirna šeima yra turtinga exosomes iš skrandžio vėžiui ląstelių linijos, AZ-P7a ląsteles. Nuo tegul-7 miRNAs dalyvauja proliferacijos procesą [31], jų exosomal sekrecija gali vaidinti svarbų vaidmenį Tumorigenesis ir metastazių.

Medžiagos ir metodai

Mobilusis kultūra

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas (AZ-521, MKN45, KATOIII ir NUGC-3), žmogaus plaučių vėžio ląstelių linijas (SBC-3, Lu-65, Lu-135, ir KNS-62), ir žmogaus kasos vėžio ląstelės ( Kombinezonas-2) buvo nupirkta iš Japonijos rinkimas tyrimų Bioresources. Žmogaus skrandžio vėžio ląstelės (SNU-1), žmogaus plaučių vėžio ląstelių linijas (DMS-53, DMS114, NVI-H69, A549, NVI-H1299, NVI-H1155, NVI-H520, NVI-H1560, SK-ŠMM-1, ir HCC827), žmogaus mezoteliomą ląstelės (MSTO-H211), žmogaus storosios žarnos vėžio ląstelių linijas (SW480, SW620, Colo205, Lovo, ir HCT116, žmogaus kasos vėžio ląstelių linijas (BxPC-3, ASPC-1, Panc-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45 ir Capan-2), žmogaus prostatos vėžio ląstelių linijas (PC-3, SU145, ir LNCaP), ir žmogaus krūties vėžio ląstelių linijas (T-47D, McF7 SK-BR-3, BT -474, ir MDA-MB-231) buvo įsigytos iš Amerikos tipas kultūros kolekcija. MKN28 (žmogaus skrandžio vėžio ląstelės) ir PSN-1 (žmogaus kasos vėžio ląstelės), buvo įsigytas iš imuniteto Biologinių laboratorijų ir Europos rinkimas ląstelių kultūros, atitinkamai . Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijos AZ-P7a [32], [33] ir MKN45P [42] buvo dovana Drs. Yutaka Yonemura ir Yoshio endo. AZ-521 ir AZ-P7a ląsteles, pastebėta jokių RT-PGR produktai 14 retrovirusų įskaitant HPV16, EBV, CMV, SV40 HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, ŽIV-1, HIV2 ir ADV 1 tipo (duomenys neparodyti), išskyrus infekcijos šių retrovirusų abiejų ląstelių linijų , Ląstelės ir buvo išlaikytos RPMI-1640 terpėje (Sigma-Aldrich), papildytoje su 10% šilumos-inaktyvuota vaisiaus galvijų serumo (Invitrogen), 100 U /ml penicilino, ir 0,1 mg /ml streptomicino deriniai.

gamybą ir izoliaciją iš exosomes

prilipusios ląstelės buvo pasėjamos 150 mm patiekalų tinkamą ląstelių skaičių nuo 3 × 10 ^{6 iki 1 × 10 7 ląstelės per patiekalas, o plaukiojančios ląstelės buvo Inokuliuoti į 75 cm, 2-kolboje 2~2.5 × 10 7 ląstelės per kolbą. Ląstelės buvo auginamos visiškai RPMI-1640 terpėje 25 ml ir 50 ml indai ir kolbos, atitinkamai, 24 h 37 ° C temperatūroje ir 5% CO _{2, plaunama du kartus fosfatas-buferinio tirpalo (PBS), ir inkubuojama 48 h per fenolio raudonasis be RPMI-1640 terpę (Sigma-Aldrich), kuriame yra 10% šilumos, inaktyvuota vaisiaus jaučio serumo, kuris anksčiau buvo išeikvoti užteršė microvesicles ne 100,000 × g iki nakties centrifuguojant. Exosomes buvo izoliuotas nuo visų ląstelių nuo 6 × 10 7 3 × 10 8 langeliai kaip buvo aprašyta anksčiau [29]. Trumpai, kultūros terpė buvo surinkti ir centrifuguojamas esant 800 × g 5 min ir papildomas 2000 × g 10 min pašalinti nutrauktas ląsteles. Virš nuosėdų buvo atliktas filtracijos 0,1 mkm porų Polietersulfono membraninį filtrą (Corning) pašalinti ląstelių šiukšles ir dideli pūslelės, po koncentraciją 100000 Mw atjungimo membraną (CentriPlus-70, Millipore). Iš supernatanto tūris buvo sumažintas nuo maždaug 250-500 ml iki maždaug 30 ml. tada supernatantas buvo ultracentrifuguojami, esant 100000 × g 1 h, esant 4 ° C temperatūrai, naudodami 70Ti rotorių ( "Beckman Coulter"). Gautos granulės buvo resuspenduotos 6 ml PBS ir ultracentrifuguojami, esant 100000 × g 1 h, esant 4 ° C temperatūrai, naudodami 100Ti rotorių ( "Beckman Coulter").}}

Perdavimo elektronų mikroskopija

granuliuotus exosomes buvo sumaišyti su vienodais kiekiais šviežiai paruoštų 2% glutaraldehido PBS, inkubuotus per naktį 4 ° C, pinigų skaičiaus su 1% osmio tetrokside PBS esant 4 ° C temperatūroje 2 h, ir dehidratuotas surūšiuoti serijos etanolio. Po dehidratacijos, mėginiai buvo perkelti į propileno oksido ir įdėta į epoksidinės dervos Quetol 812 (Nisshin EM). Plono skyriai buvo pjaustomos Ultracut UCT (LEICA), tamsintas su uranilo acetato ir švino citrato ir pastebėta su JEM-1230 elektroninis mikroskopas (JEOL). Imunoelektronine mikroskopinis analizė buvo atlikta pagal aprašytą metodą Xiao et al. [43] su nedideliais pakeitimais. Trumpai tariant, exosomes buvo sumaišyti ir inkubuojami su pelės anti-žmogaus CD63 monokloninio antikūno (katalogas Nr. SC-51662, Santa Cruz) 1 val kambario temperatūroje. Mėginys buvo sumažėjo ant membranos paviršiaus vario tinkleliu (Kolodijus /anglies dengtos 400 sieto, Nisshin EM) ir inkubuojami 1 h kambario temperatūroje. Po plovimo su PBS, immunogold konjuguoto ožkos anti-pelės IgG (katalogas Nr. EM.GMHL15, BBInternational) skiesti ne 1:20 buvo numestas ant membranos. Vario tinklelio buvo plaukti į lašelių su savo membranos paviršiaus, su kuria susiduria žemyn kambario temperatūroje 30 min. Po to, kai plovimo su PBS, uranilo acetato lašai buvo įdėti ant vario tinkleliu paviršiaus ir nusidažiusios esant kambario temperatūroje 30 s. Exosomes su juoda koloidinis aukso dalelių apie kapsulinio membranų buvo pažymėtas kaip teigiama pagal perdavimo elektroniniu mikroskopu.

Vakarų dėmė analizė

elementų ir exosomal frakcijos nuplauti, sumaišymo į lizės buferiniame tirpale [7.5 M karbamido (Sigma-Aldrich), 2,5 M tiokarbamidas (Sigma-Aldrich), 12,5% glicerolio (Wako), 50 mmol Tris, 2,5% n-oktilo-beta-D-glikozido (Sigma-Aldrich), 6,25 mmol Tris (2- karboksietil) fosfino hidrochlorido (Sigma-Aldrich), 1,25 mM proteazės inhibitorius (katalogas Nr. P2714, Sigma-Aldrich)], ir inkubuojami 1 h, esant 4 ° C temperatūroje, naudojant sukamojo RT-50 (TAITEC). Po to, kai centrifuguojant 14,000 × g 60 min, esant 4 ° C, supernatantas buvo surinkti ir baltymo koncentracija buvo nustatomas pagal Bradfordo Baltymų Analizės Kit (Bio-Rad). Iš baltymų dalis (10 mikrogramų) buvo denatūruotas verdant Laemmli mėginio buferio, paleisti 10% SDS-poliakrilamido geliai, ir perkelti į Immobilon-P PVDF membranos (0,45 mkm porų dydis, Millipore). Kad dėmės buvo blokuotos 1 h su 5% neriebalinė sausoji pieno tri-buferio druskų tirpalu, kurio sudėtyje yra Tween 20 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl ir 0,01% Tween 20). Po blokuoja membranas buvo inkubuojami su kiekvienos pirminės antikūno arba antiseruminį įskaitant triušių anti-Tsg101 serume (katalogas nėra. T5951, Sigma-Aldrich), ožkų anti-Aip1 /Alix serume (katalogas Nr. SC-49.268, Santa Cruz), pelės monokloninis anti-CD29 /β1-integrino (katalogas Nr. SC-610.468, BD biomokslai) ir pelės monokloninis anti-Bip /Grp78 (katalogas Nr. 610.979, BD biomokslai) esant 1:200 praskiedus 1 val kambario temperatūroje. tada dėmės buvo inkubuojamos su atitinkama anti-IgG antrinio antikūno konjuguota su krienų peroksidazės (Jackson Laboratories) esant 1:2,000 skiedimo 1 val kambario temperatūroje. Specifinių baltymų buvo ryškinamos naudojant ECL sistemą ( "GE Healthcare") ir FUJIFILM liuminescenciniai Image Analyzer "LAS3000 (" Fuji Film "). Baltymų molekulinės masės buvo daryti išvadą, naudojant Tikslioji Plus baltymų standartai (Bio-Rad Laboratories).

RNR išskyrimas

RNR išskyrimo iš mitybinės terpės, ląstelės buvo pasėjamos, kaip aprašyta aukščiau. 48 h po to, kai auginami, kultūros terpė buvo surinkti ir centrifuguojamas esant 800 × g 5 min ir papildomas 2000 × g 10 min. Supernatantas buvo atliktas-filtracijos 0,22 mkm porų polietersulfono membraninį filtrą (Corning), o po to koncentracijos su 5000 Mw atjungimo membraną (Centricon plius-70, "Millipore). Galutinis tūris supernatantą buvo maždaug 10-20 ml nuo pradinio tūrio 250-500 ml. Supernatantas buvo sumaišyti su vienodo tūrio QIAzol lizės reagentas (Qiagen) ir po, kad RNR išskyrimo tvarka, aprašyta žemiau. Iš viso RNR buvo išskirta iš ląstelių, exosomes ar kultivavimui skirtoje terpėje, naudojant miRNeasy Mini rinkinį (QIAGEN) pagal gamybos instrukcijas. Pašalinti genomo DNR, 40 mikrogramų korinio viso RNR, buvo inkubuojamas su 40 vienetų RQ1 RNazės, laisvos nuo DNaze (Promega) 37 ° C temperatūroje 30 min į 40 vienetų RNasin plius RNaze inhibitorių (PROMEGA) buvimą. Dėl viso RNR nuo exosomes ir kultūra žiniasklaidos, visi žalios produktų kiekiai buvo traktuojami pačia tvarka, išskyrus 5 U DNaze naudojimui. RNR buvo išgrynintas naudojant RNeasy MinElute valymo rinkinį (QIAGEN) pagal gamintojo instrukcijas. RNR mėginiai buvo kiekybiškai su NanoDrop spektrofotometru (Thermo Fisher Scientific) ir vertinami naudojant AGILENT Mažos RNR rinkinys ir Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).

mikrogardeliq analizė

Mirna profiliavimo, 100 ng ir 20 ng ląstelių ir ekstraląsteliniuose visų RNR, atitinkamai, buvo fluoresouojančio naudojant Mirna Užbaigti ženklinimo reagento HYB rinkinį (Agilent Technologies) pagal Gamyba protokole (Agilent Mirna mikrogardelių versija 2.2). Išsami Mirna analizė buvo atlikta naudojant žmogaus Mirna mikrogardeliq komplektas (8 × 15 K), Ver.3.0 (AGILENT). Hibridizacijos signalai buvo aptikti su DNR mikrogardeliq Skeneriai (Agilent Technologies). Nuskenuoti nuotraukas buvo analizuojami naudojant "Agilent požymių išskyrimas programinė įranga ir duomenų analizė buvo atlikta naudojant GeneSpring GX programinę įrangą (Agilent Technologies). Aptarti šio rankraščio duomenys buvo pervestas į ncbi anketa genų ekspresijos Omnibus (GEO) ir yra prieinama per gėjų serijos inventorinį numerį GSE21350: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE21350).

atvirkštinės transkripcijos (RT), kiekybinį RT-PGR už Mirna analizės

Kiekybiniai Mirna koncentracija buvo nustatoma naudojant realaus laiko RT-PGR su Applied Biosystems 7900 HT seka aptikimo sistema (Taikomoji Biosystems), TaqMan® genų ekspresijos tyrimas (Applied Biosystems) žmonėms tegul-7a (tyrimas ID 000.377), tegul-7b (tyrimas ID 002.619), tegul-7c (tyrimas ID 000.379), tegul-7d (tyrimas ID 002.283 ), tegul-7e (tyrimas ID 002.406), tegul-7f (tyrimas ID, 000.382), tegul-7G (tyrimas ID, 002.282), tegul-7i (tyrimas ID, 002.221) ir U6 snRNA (tyrimas ID, 001.973), kaip endogeninio kontrolės , Dešimt ng visos RNR buvo atliktas atvirkštinę transkripciją su TaqMan® Universal PGR Master Mix Nr AmpErase (Applied Biosystems) ir atitinkamų TaqMan® reagentų tikslinių genų. RT-PGR buvo atliktas, kad bendras tūris 20 mikrol, reakcijos mišinio pagal gamyba protokolo vertę. Amplifikacija buvo atliekama taip: 95 ° C temperatūroje 10 min, 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 15 S ir 60 ° C temperatūroje 60 s. Mėginiai buvo analizuojami trimis egzemplioriais, kaip biologinės atkartoti ar keturiais egzemplioriais kaip techninės kopija. Į Mirna lygiai buvo nustatyti iš ciklo riba (CT), lyginamosios Ct būdą, normalizuoti pagal U6 snRNA lygio kiekvienam mėginiui. Sulenkite padidėja arba sumažėja kiekvienos Mirna lygio ląstelių linijų tiriamų nustatoma atsižvelgiant į AZ-P7a ląstelių linijos lygyje.

Padėka

padėkoti Šidzuokos Cancer Center tyrimų instituto prisijungę jų daug naudingų patarimų. Taip pat dėkojame Drs. Yutaka Yonemura ir Yoshio endo dovanų AZ-P7a ir MKN45P ląstelių linijų.

• PLoS ONE: genų ekspresija Parašas įgytų Atsparumas cheminėms cisplatinos ir fluorouracilu kombinuotos chemoterapijos skrandžio vėžio Patients
• PLoS ONE: Hipoksija-indukuojamąją faktorius 1α Nustato skrandžio vėžys Chemosensitivity per moduliavimo p53 ir NF-κB