PLoS One: let-7 miRNS Family szelektíven az extracelluláris környezet keresztül exoszómák a metasztatikus gyomor sejtvonal

absztrakt

háttér

exoszómák fontos szerepet játszanak a sejt-sejt kommunikációt, célzott sejtek átviteléhez exosomal molekulák, beleértve a fehérjéket, mRNS-ek, és a mikroRNS (miRNS-ek) által egy endocytosis- mint út. miRNS-ek kis nem kódoló RNS-molekulák átlagosan 22 nukleotid hosszúságú, amelyek szabályozzák a számos biológiai folyamatban, beleértve a rák patogenezisében és közvetíteni a génex-down-regulációja célzott mRNS-eket indukálni RNS lebomlás és /vagy zavarja fordítást. A legújabb jelentések azt jelenti, hogy miRNS stabilan kimutatni a keringő plazma és szérum óta miRNS vannak csomagolva által exoszómák védeni kell a RNS lebomlását. Így profilalkotás exosomal miRNS van, hogy tisztázni kell az intercelluláris jelátvitel, és fedezze fel az új betegség marker is. Katalógusa

Módszertan /fő eredményei katalógusa

exoszómák izoláltunk tenyésztett rákos sejtvonalak és minősége jóváhagyták elemzésekkel a transzmissziós elektronmikroszkópos és western blot. Az egyik vizsgált sejtvonalban, egy metasztatikus gyomorrák sejtvonal, AZ-P7a, mutatta a legnagyobb RNS-hozam a felszabadított exoszómák és jellegzetes alakja morfológiáját. Ezen túlmenően, RNS-eket izoláltunk a sejtekből és táptalajok, és a profilok a három miRNS frakciókat kapunk mikroarray elemzéssel. Összehasonlításával jelintenzitását microarray adatok, valamint a következő érvényesítés RT-PCR elemzés azt találtuk, hogy let-7 miRNS család bőséges volt mind az intracelluláris és extracelluláris frakciókat AZ-P7a sejtekben, míg az alacsony metasztatikus AZ-521, a szülői sejt vonal aZ-P7a, valamint egyéb rákos sejtvonalak nem mutatott ilyen hajlamot. katalógusa

Következtetések /Jelentés katalógusa

a dúsítási let-7 miRNS család az extracelluláris frakciók, különösen a exoszómák származó aZ-P7a sejtek tükrözik onkogén jellemzők, beleértve a tumorigenezis és metasztázis. Mivel let-7 miRNS általában játszanak tumor elnyomó szerepét célzó onkogének, például a RAS katalógusa és HMGA2 katalógusa, eredményeink arra utalnak, hogy az AZ-P7a sejtek engedje let-7 miRNS keresztül exoszómák a extracelluláris környezetbe, hogy fenntartsák a onkogenezisben.

bevezető hivatkozás: Ohshima K, Inoue K, Fujiwara a, Hatakeyama K, Kanto K, Watanabe Y, et al. (2010) let-7 microRNS Family szelektíven szekretálódik az extracelluláris környezetbe keresztül exoszómák egy metasztatikus gyomor rák sejtvonalhoz. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10,1371 /journal.pone.0013247 katalógusa

Vágó: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Németország katalógusa

Beérkezett: április 14, 2010; Elfogadva: szeptember 10, 2010; Megjelent: október 8, 2010 katalógusa

Copyright © 2010 Ohshima et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Finanszírozás: A munka támogatott a támogatási együttműködésben innovatív technológia és Advanced Research in Evolúciós Area (város területén) a Minisztérium az Oktatási, Kulturális, Sport, Tudományos és Technológiai Japánban. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

sejtek titkos különböző típusú kis membrán vezikulák. Exoszómák az egyik vezikulumok 30-100 nm átmérőjű, és fizikai-kémiai szempontból is különbözik a többi szekretált vezikulák [1]. Belül exoszómák, celluláris gén termékek, beleértve a fehérjéket, mRNS-ek, és a mikroRNS (miRNS-ek) vannak csomagolva, és ezek a molekulák is át recipiens sejtek leszállítani a molekuláris jelátvitelt, például onkogenezisben [2] - [4] és az immunválasz [1], [ ,,,0],5]. Exoszómák szabadulnak fel sokféle sejtek [6], amely magában foglalja a tumor-sejtek, epithelsejtek, és hematopoietikus sejtek, például a retikulociták, citotoxikus T-limfociták, az Epstein-Barr-vírussal transzformált B-sejtek, hízósejtek, dendritikus sejtek, és vérlemezkék. A szekretált exoszómák izoláltak és jellemeztek in vitro
származó tenyésztett sejtvonalakban [7] együtt in vivo
testfolyadékokban [7], beleértve a vér [8], a vizelet, [9] nyál [10], magzatvíz, [11] és a malignus pleurális folyadékgyülem [12]. Mivel megfigyelhető számos proliferáló sejttípusban, elképzelhető, hogy súlyosbítják a tumorsejtek, amint azt a megnövekedett jelenléte a plazmában és pleurális folyadékgyülem a rákos betegek [8], [12]. Ez fokozott jelenlétét nem invazív testnedvek rákbetegek felgyorsította a profil molekuláris komponensek exoszómák felfedezni klinikailag hasznos tumormarkerek és biomarkerek [3], [7], [13]. Katalógusa

miRNS egy osztály a nemkódoló kis RNS, amelyek részt vesznek a transzláció utáni génexpresszió szabályozásában azáltal, hogy gátolják mind a stabilitás és transzlációját mRNS-ek [14]. A legújabb bizonyíték azt mutatja, hogy a miRNS mutációk vagy misexpression korrelál különböző humán rákos megbetegedések és azt jelzik, hogy néhány miRNS működhet onkogének vagy tumorszupresszorok [15], [16]. Elemezni RNS, mindig megfontolandó azok stabilitása lebomlást RN-áz. Újabb eredmények azt mutatják, hogy az endogén plazma miRNS vérmintákban stabilan kimutatható olyan formában, amely ellenáll a RNáz aktivitását [17], amit alátámaszt azonosítása miRNS testfolyadékokban, például vérben [17] - [24], a vizelet [25], és a nyál [10], [26]. katalógusa

Tenyésztett rákos sejtek használtak volna keresni tumormarkerek. Különösen proteinek azonosítására és peptidek szekretálódik a tenyésztő média által kifejlesztett proteomika-alapú megközelítés [27], [28]. Ami a molekuláris aláírás exoszómák, proteomika valamint transcriptomics elemzéseket végeztünk, hogy felfedje a tumorigenezis és azonosítani tumormarker jelöltek [2] - [4], [7], [29]. Itt azonosítani miRNS kapcsolatos tumorigenezis és metasztázis, végeztünk kiterjedt miRNS elemzés három sejtfrakciókban ideértve sejteket, exoszómák, és közepes a tenyésztett sejtekből. Rangsoroló adatokat ezen intracelluláris és extracelluláris miRNS kapott microarray, azt találtuk, hogy let-7 miRNS család gazdag minden kapott frakciók AZ-P7a sejtek egy áttétes gyomorrák sejtvonal, amely termel homogén és a sűrített morfológia, és magas helyreállítási aránya exosomal miRNS. Ezek az eredmények eltértek más sejtvonalak, beleértve a tüdőrák sejtvonalak (SBC-3, NCI-H69, és DMS53), kolorektális rákos sejtvonalat (SW480 és SW620), és az AZ-521, a szülői sejtvonal AZ-P7a. Tekintettel arra, hogy let-7 miRNS családi funkciók elsősorban a tumor szupresszor gének [30], hogy a cél az onkogének, például RAS katalógusa és high mobility group A2 ( HMGA2 katalógusa) [31], azt javasoljuk, hogy az AZ -P7a sejtek szelektíven titkos let-7 miRNS az extracelluláris környezetbe keresztül exoszómák hogy fenntartsák daganatkelto és metasztatikus hajlamait. katalógusa

Eredmények katalógusa

izolálása exoszómák különböző rákos sejtvonalak

exoszómák előállított belső sejtek az extracelluláris környezetbe keresztül exocitózis-szerű útvonal [1]. Amellett, hogy a testfolyadékok, mint például szérum és plazma a perifériás vérből [7], [8], exoszómák találhatók a közegben tenyésztett sejtek [7], elősegítve azonosítását exosomal molekulák, beleértve a fehérjéket, mRNS-ek, és miRNS a cél az klinikai használatra. Profilozó ilyen exosomal molekulák tenyésztett rákos sejtek vezettek felfedezni új jelölt marker és antigén onkológiai diagnosztika és immunterápia [7]. Ebben a vizsgálatban, a célból, profilozási exosomal miRNS, először izolált exoszómák táptalajából 46 rákos sejtvonalak különböző szöveti típusú, amelyek magukban foglalják a 8 gyomor, 16 tüdő-, 5 vastagbél, 9 hasnyálmirigy, 3 a prosztata és 5 mell. Miután a sejteket növesztjük 48 órán át, exoszómák gyűjtöttük kombinációjával egymást követő centrifugálással, és molekulatömeg cut-off membránok leírt Anyagok és módszerek. Az tisztaságát exosomal frakciók értékelték elemzések transzmissziós elektronmikroszkóppal és western blot. Transzmissziós elektronmikroszkópiával mutatta, kör alakú hólyagos membrán szerkezetek körülbelül belül a méret a 100 nm átmérőjű. Közül három sejtvonal, SBC-3, AZ-521, és az AZ-P7a, ez az érdeklődés, hogy a morfológiában AZ-P7a sejtek homogénebb és kondenzáljuk mint más sejtek (1a ábra). Immun-vizsgálatok azt mutatták, hogy az extracelluláris részecskéket izoláltuk a táptalajból az AZ-P7a sejteknek immunreaktivitás elleni antitesttel CD63, az egyik a exosomal membrán fehérjék, a kapszuláris membránokon (1b ábra). A jelenléte ismert exosomal proteinek, köztük CD29 /β1-integrin, Aip1 /Alix és a tumor fogékonyság gén 101 (Tsg101) igazoltuk Western-blot analízissel, míg a fehérje lokalizálódik endoplazmatikus retikulum, Bip /grp78 volt kimutatható (1C). Ez az eredmény azt jelzi, hogy a szennyeződés származó anyagok egyéb celluláris rekesz a exosomal frakciókat minimális volt. A hozam a exosomal fehérjék AZ-P7a sejteket 10-szer magasabb, mint amelyet a AZ-521-sejtek; -2,5 Mg fehérjét kapunk 1 × 10 ^{8 AZ-P7a sejtek. Katalógusa}

gazdagítása exosomal származó RNS-ek AZ-P7a sejtek katalógusa

Az izolálás után exosomal teljes RNS-t izoláltunk 46 tenyésztett sejtvonalakban. Érdekes, hogy az RNS-hozamok AZ-P7a sejtek sokkal nagyobb, mint a más sejtek (2A ábra). Az elosztó hosszúságú jelenlétét mutatta nagy mennyiségű kis RNS-ek in exoszómák (középső panel, 2B ábra). Meg kell jegyezni, hogy van egy jelentős különbség a teljes exoszómák és a exosomal miRNS szintek közötti betegek tüdő adenocarcinoma és ellenőrzések [8]. AZ-P7a sejtvonalat hoztunk létre ismételt beoltás a szülői AZ-521 sejtek egerekben eredményezett magas peritoneális-metasztatikus potenciállal [32], [33]. Így a magas hozamok mindkét RNS és fehérje együtt a morfológiai jellemzők AZ-P7a sejtek tulajdonítható magas tumorigén és metasztatikus hajlamok. Mivel miRNS mutattak sejtmentes testfolyadékok [17] - [20], azt is végeztünk közvetlen izolálását teljes RNS táptalajból nélkül eljárás izolálására exoszómák. Az összegek a teljes RNS-re tápközeget általában nagyobb, mint a re exoszómák (2A ábra). RNS-eloszlás hosszúságú azt mutatta, hogy a miRNS frakciókat detektáltunk a tartomány 10-40 nukleotid hosszúságú RNS-ek előállíthatók táptalajból (jobb panel), valamint a exoszómák (középső panel) származó AZ-P7a sejtek (2b ábra). Szerint a gyártó protokollja Bioanalyzer, csúcsok hosszabb, mint 40 nukleotid hosszúságú tartalmazhat más kis RNS beleértve tRNS-ek a 70~90, 5S riboszóma RNS 100, és 5,8S riboszómális RNS, 150, megfigyelt intracelluláris frakció (bal panel) . Ezek az eredmények arra utalnak, hogy miRNS-ek létezhetnek a táptalajban kívül exosomal frakció bár RNS úgy gondolják, hogy védeni kell a RNázok, mint amelyek csomagolt exoszómák. Különösen, szemben a tapadó sejteket, a növekmény RNS hozamok meglepően nagyobb lebegő sejtek (NCI-H69 és Lu-135), vagy a sejtek Mix populációi úszó és az adherens sejtek (Colo205), amely lehet tükröz szennyeződése RNS shed a lizált sejtekből, amelyeket folyamatosan maradt tápközegekben.

miRNS profilozás által microarray

miRNS profilok az intracelluláris és extracelluláris frakciókat határoztuk microarray hét rákos sejtvonalak, beleértve a AZ- 521, AZ-P7a, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480, és SW620. Származó mintákat táptalajok valamint exoszómák feltéve hibridizációs jelek (3. ábra), jelezve a létezését miRNS ezekben a mintákban. A mai napig, elemzése microarray adatok miRNS között minták, nem világos módszerek tettek normalizálására jel intenzitását, mivel nehéz megtalálni a megfelelő belső standard anyaga [34]. Így miRNS microarray adatok kerültek általában elemzett nélkül normalizáció, feltételezve, hogy a teljes összeget az input-RNS-ek állandó minták közötti [34], [35]. Ebben a vizsgálatban, átlagolása után miRNS microarray adatok között két ismétlésben, mi rangsorolt ​​miRNS aszerint, hogy azok jel intenzitását. Azt találtuk, hogy let-7 miRNS család, mint a let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e let-7F, let-7 g, és hagyjuk-7i észleltek viszonylag nagy jeleket az egész leginkább az intracelluláris frakciók a hét sejtvonal (1. táblázat, 3. ábra). Azonban nem vagy kevés jel intenzitását a let-7 miRNS detektáltunk az extracelluláris frakciókat, kivéve a két extracelluláris frakciókat AZ-P7a sejtek és táptalaj frakciójának NCI-H69 sejteket (1. táblázat, 3. ábra). Különösen, mind az extracelluláris frakciókat AZ-P7a sejtek, mind a nyolc let-7 miRNS mutattunk bár rangot let-7g alacsonyabb volt, mint a többi hét let-7 miRNS. Alapján a különböző szokások let-7 miRNS szinten a három sejtfrakciókkal osztottuk a hét sejtvonal három csoportba (3. ábra) az alábbiak szerint: (1) AZ-P7a, sejtek, let-7 miRNS találtak mind a három frakció, (2) AZ-521 együtt SBC-3, DMS53, SW480, és SW620 sejtek, amelyek let-7 miRNS általában megtalálhatók csak intracelluláris frakciók, (3) NCI-H69, sejtek, let-7 miRNS találtak a sejten belüli frakciók, valamint a tenyésztő táptalajban, hogy bizonyos mértékig.

RT-PCR-elemzéseket az intracelluláris és extracelluláris Letter 7 miRNS család katalógusa

ezután végre kvantitatív RT-PCR a nyolc let-7 miRNS család, hogy érvényesítse a microarray adatok. let-7 miRNS voltak könnyen kimutatható az intracelluláris és extracelluláris frakciókat AZ-P7a sejtek (4a ábra) és az AZ-521 sejteket (4b ábra). A szintek let-7 miRNS bemenet RNS általában magasabbak voltak az extracelluláris frakciókat AZ-P7a sejtek, mint az elejétől-521 sejtekben. Normalizálását a szintek cél miRNS kapott RT-PCR-rel, U6 snRNS már általánosan használják, mint egy belső kontroll. Megfigyeltük jelenlétében U6 snRNS mindhárom frakciókat AZ-P7a sejtek és az AZ-521 sejteket (4C), majd összehasonlítottuk a szintek let-7 miRNS között a megfelelő frakciókat ebből a két sejtvonal. Normalizálás után, a szintek let-7 miRNS beleértve let-7a, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, és legyen-7i mind a frakciók exoszómák és táptalaj tól Z-521 sejteket csökkentette azokhoz képest, akik ettől aZ-P7a sejteket. Éppen ellenkezőleg, nem volt nagy különbség a szintek az intracelluláris let-7 miRNS. Mi a következő képest szintjét exosomal let-7a tól Z-P7a sejtek a más rákos sejtvonalak, beleértve SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 és SW620, és megállapította, hogy a let-7a szinten csak SW620 sejteket viszonylag közel (0,7-szerese), hogy a megfelelő szintet aZ-P7a sejtek (ábra 4E). Meg kell jegyezni, hogy a sejten belüli szintje let-7a-re az SW620 sejteket körülbelül 3,5-szer nagyobb mennyiségben, mint amelyet AZ-P7a sejteket. Ezen eredmények alapján feltételeztük, lokalizációja let-7a a frakciókban a sejtek és exoszómák (5. ábra), és amelyet a további elemzést. Normalizálódott U6 mellett azt számított relatív szintjét let-7a csomagolva exoszómák per szintje celluláris let-7a (4F). Ennek eredményeként, az összeg a exosomal let-7a sokkal nagyobb volt a AZ-P7a sejtek, mint a többi hat sejtek, ami arra utal, hogy az AZ-P7a sejteket szelektíven és aktívan szekretálódik let-7 miRNS család az extracelluláris környezetbe keresztül exoszómák.

Vita katalógusa

a jelen tanulmányban azt mutatta, hogy a let-7 miRNS család az extracelluláris környezetbe keresztül exosomal közlekedés, amely jellemző a metasztatikus gyomorrák sejtvonal aZ-P7a. let-7 miRNS család emberi áll a 10-szekvenciák 13 prekurzorok [30]. Általánosságban, let-7 miRNS jár, mint a tumor szuppresszor célzásával onkogének, például a RAS
és a HMGA2
és a let-7 miRNS vannak downregulált számos rák szilárd szervek [31]. AZ-P7a sejt rendelkezik egy áttétes képes peritoneális terjesztését nude egerekben [32], [33]. Így azt javasoljuk, hogy a exosomal megjelenése let-7 miRNS az extracelluláris környezetbe eredmények csökkenése elleni tumorképző hatását a sejteken belül, mely vezet, hogy fenntartsák a onkogenezis és invazív. Másrészt, let-7 miRNS kevésbé gyakran játszanak onkogén funkció miatt, hogy növelje az expressziót hipometiláció a let-7 lókusz [36] vagy a célzási kaszpáz-3 mRNS [37]. Ebben az esetben a exosomal felszabadulását let-7 miRNS okozhat átalakulás célsejteket áthelyező onkogén tulajdonságai.

tüdőrákos betegek, a teljes szintek exoszómák és azok miRNS növekedést jelent a kontrollokhoz képest [8 ]. Bebizonyosodott, hogy a tumor exoszómák indukálnak immunválaszt menekülési mechanizmus rák által spontán T-sejt-apoptózist [38] - [40]. Ebben a tanulmányban kimutatták, homogén morfológiája és gazdagítása RNS-eket exoszómák metasztatikus AZ-P7a sejteket. Ez tükröződik által tumorképző.

miRNS nagyon stabilak a vérplazmában és a szérumban, mivel védve RNázok [17]. Így, ez teszi miRNS szinten vizsgáltuk klinikai diagnózis felállítása, tumormarkerek és biomarkerek. Hogyan történik ez? Chin et al. javasolták két hipotézis forrását miRNS keringő vért; ez lehet az oka, hogy eredményeként a tumorsejt halál és lizálja vagy engedje a tumorsejtek által az extracelluláris mikrokörnyezetében erek [19]. Éppen ellenkezőleg a letapadt sejteket, azt tapasztaltuk, hogy az össz-RNS-eket táptalaj viszonylag magasabb, mint a exoszómák sejtek változó tulajdonság, mint a NCI-H69, Lu-135, és Colo205. Ez a növekedés valószínűleg eredményezte szennyezettsége származó RNS elhalt sejteket táptalajon. Katalógusa

A felfedezés új vér tumormarkerek és biomarkerek omika közelít így a proteomika és transcriptomics végzik akár közvetlen vérminták elemzése vagy alkalmazás profilozás szövetminta. Vannak ellentmondó jelentéseket, ha e profilok miRNS és mRNS véráramba párhuzamosak a tumor profilját. Az aláírás exosomal miRNS tükrözi, hogy a származó tumorsejtek betegeknél tüdő adenocarcinoma [8] és az emlőrák [41]. Másrészt, Skog et al. kimutatták, hogy a mikroarray analízise mRNS származó glioblasztóma sejtek és a megfelelő exoszómák feltárta mRNS kizárólag kimutatható mikroüregek, spekuláció, hogy mRNS-eket lokalizált egy adott régióban a citoplazma [3]. Ezen túlmenően, Tanaka et al. bebizonyították, hogy a szint a miR-92a csökkent a vérplazma akut leukémiás beteg, miközben az erős expressziót találtunk a szöveti mintákat [24]. Eredményeink szelektív dúsító let-7 miRNS család AZ-P7a sejtek eredetű exoszómák illeszkedik utóbbi esetben. Hacsak cél molekulák miRNS származó keringő tumorsejtek, azt sugallja, alapos vizsgálat van szükség, hogy használni miRNS profilok szövetmintákban történő kimutatására a szérum vagy plazma mintákat.

Mivel exoszómák gyártják hematopoietikus sejtekben, valamint a hámsejtek a keringő vér tartalmaz exoszómák származó mindkét típusú sejteket. Általánosságban elmondható, hogy vizsgálja exosomal profilok a fehérjék, mRNS-ek, és a miRNS-ek a szérumban és a plazmában, exoszómák származó tumorok epithelialis jellemzőkkel elválasztjuk azoktól származó vérképző sejtek [8], [13]. Ezt végezzük affinitás tisztítás elleni antitestekkel molekulák, mint például EpCAM, amelyek kifejezik a felszínen a hámsejtek. Eredményeink arra, hogy hasonló szintű let-7 miRNS család között exoszómák és táptalaj tól Z-P7a sejteket arra utalnak, hogy ezek a miRNS-szint mérhető izolálása nélkül exoszómák klinikai mintákból, mint például szérumból vagy plazmából. Katalógusa

Összefoglalva, ez a vizsgálat kimutatta, hogy a let-7 miRNS család gazdag exoszómák egy áttétes gyomorrák sejtvonal aZ-P7a sejteket. Mivel let-7 miRNS részt vesznek proliferációs folyamat [31], ezek exosomal szekréció játszhatnak fontos szerepet tumorigenezis és metasztázis.

Anyagok és módszerek

Sejtkultúra

emberi gyomor rákos sejtvonalat (AZ-521, MKN45, KATOIII, és NUGC-3), humán tüdőrák sejtvonalak (SBC-3, Lu-65, Lu-135, és KNS-62), és a humán hasnyálmirigyrák sejtek ( suit-2) vásároltunk a japán Collection of Research Bioresources. Emberi gyomor rákos sejtek (SNU-1), humán tüdőrák sejtvonalak (DMS-53, DMS114, NCI-H69, A549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, és HCC827), humán mesothelioma sejtek (MSTO-H211), humán kolorektális rákos sejtvonalak (SW480, SW620, Colo205, LoVo és HCT116 emberi hasnyálmirigy rákos sejtvonalat (BxPC-3, aspC-1, Panc-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45, és Capan-2), humán prosztatarák sejtvonalat (PC-3, SU145, és LNCaP), és humán emlőrák sejtvonal (T-47D, MCF7, SK-BR-3, a BT -474, és az MDA-MB-231) vásároltunk a American Type Culture Collection. MKN28 (humán gyomorrák sejtek) és PSN-1 (humán hasnyálmirigy-rák sejtek) vásároltunk a Immuno-Biological Laboratories és European Collection of Cell Culture, illetőleg . emberi gyomor rákos sejtvonalak, AZ-P7a [32], [33] és a MKN45P [42] voltak ajándéka Drs. Yutaka Yonemura és Yoshio Endo. az AZ-521 és az AZ-P7a sejtek NO RT-PCR-termékek figyeltek 14 retrovírusok, beleértve a HPV16, EBV, CMV, SV40-ből, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, HIV1, HIV-2 esetében, és ADV 1-es típusú (nem közölt adatok), kivéve a fertőzés által ezek retrovírusok mind a sejtvonalak . A sejteket RPMI-1640 tápközegben (Sigma-Aldrich), kiegészítve 10% hővel inaktivált borjúembrió-szérumot (Invitrogen), 100 U /ml penicillinnel és 0,1 mg /ml sztreptomicint.

termelésére és izolálására az exoszómák

az adherens sejteket oltottunk, hogy 150 mm-ételeket megfelelő sejtszámot kezdve a 3 × 10 ^{6-1 × 10 7 sejt per edény, míg a lebegő sejtet oltunk 75 cm 2-lombikban 2~2.5 × 10 7 sejt per lombikba. A sejteket komplett RPMI-1640 közegben, 25 ml és 50 ml ételek és kémcsövek, illetve 24 órán át 37 ° C-on és 5% CO _{2, kétszer mossuk foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBS), és inkubáljuk 48 órán fenolvörös-mentes RPMI-1640 közegben (Sigma-Aldrich), amely 10% hővel inaktivált magzati borjúszérummal, amely korábban a kimerült szennyező mikroüregek éjszakán centrifugálással 100.000 x g. Exoszómák izoláljuk a teljes sejtek kezdve 6 × 10 7-3 × 10 8-sejtek a korábban leírtak [29]. Röviden, a tápoldatot összegyűjtöttük és centrifugáltuk 800 × g-vel 5 percig, és további 2000 × g-vel 10 percig, hogy távolítsa felemelte sejteket. A felülúszót vetjük alá szűréssel 0,1 jim pórus poliéterszulfon membrán szűrő (Corning), hogy eltávolítsuk a sejttörmeléket és a nagy vezikulumok, majd koncentrációját olyan 100.000 Mw cut-off membránt (Centriplus-70, Millipore). A kötet a felülúszót csökkentett körülbelül 250-500 ml-től körülbelül 30 ml-re. A felülúszót ezután ultracentrifugáltuk 100000 g-n 1 órán át 4 ° C-on 70Ti rotor (Beckman Coulter). A kapott üledéket 6 ml PBS-sel és ultracentrifugáltuk 100,000 × g-vel 1 órán át 4 ° C-on 100Ti rotort (Beckman Coulter).}}

transzmissziós elektronmikroszkópos

A pelletizált exoszómák összekevertük egyenlő mennyiségű frissen készített 2% -os glutáraldehid, PBS-ben, éjszakán át inkubáljuk 4 ° C-on, utófixáltuk 1% -os ozmium-tetroxid, PBS-ben 4 ° C-on 2 órán át, és a dehidratált egy fokozatos sorozat etanolt. Miután a kiszáradást, a mintákat vittük át a propilén-oxid és a beágyazott epoxigyanta Quetol 812 (Nisshin EM). Ultravékony metszeteket Ultracut UCT (LEICA) uranil-acetát és ólom-citrát, és figyelték a JEM-1230 elektronmikroszkópos (JEOL). Immun-mikroszkópos elemzés szerint végeztük által leírt módszer Xiao és munkatársai. [43], kisebb módosításokkal. Röviden, exoszómák összekeverünk és inkubáljuk egér anti-humán CD63 monoklonális antitesttel (katalógusszám. SC-51662, Santa Cruz), 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A mintát dobunk az membrán felületére réz háló (kollódium /szén bevonatú 400 mesh, Nisshin EM) és inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Mosás után PBS-sel, immunogold konjugált kecske anti-egér IgG-t (katalógusszám. EM.GMHL15, BBInternational) hígítottuk 01:20 volt ejtenek a membránon. A réz hálót lebegett a cseppekben annak membrán felületén szembe le szobahőmérsékleten 30 percig keverjük. Mosás után PBS-sel, uranil-acetát csepp került rá a réz háló felület és megfestettük szobahőmérsékleten 30 s. Exoszómák fekete kolloid arany részecskéket a tok membránokat jelölve pozitív értelmében a transzmissziós elektronmikroszkóp. Katalógusa

Western blot analízis katalógusa

A sejteket és a exosomal frakciókat mostuk, újraszuszpendáltuk egy lízispufferben [7,5 M karbamid (Sigma-Aldrich), 2,5 M tiokarbamid (Sigma-Aldrich), 12,5% glicerin (Wako), 50 mM Tris, 2,5% n-oktil-béta-D-glükozid (Sigma-Aldrich), 6,25 mM Tris (2- karboxi-etil) -foszfin-hidroklorid (Sigma-Aldrich), 1,25 mM proteázinhibitor (katalógusszám. P2714, Sigma-Aldrich)], és inkubáljuk 1 órán át 4 ° C-on a forgató RT-50 (TAITEC). Centrifugálás után 14,000 g-n 60 percig 4 ° C-on, a felülúszót összegyűjtöttük és a fehérje koncentrációt határoztuk meg Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad). Egy része fehérjék (10 ng) denaturáljuk forrázással Laemmli minta pufferben futtattuk 10% -os SDS-poliakrilamid gélen, és átvittük Immobilon-P PVDF membránokra (0,45 um pórusméret, Millipore). A blotokat blokkoltuk 1 órán 5% zsírmentes száraz tej Tris-pufferolt fiziológiás sóoldattal, amely Tween 20-at (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl és 0,01% Tween 20). Blokkolás után a membránokat inkubáltuk az egyes primer antitesttel vagy antiszérummal beleértve nyúl anti-Tsg101 szérummal (katalógusszám. T5951, Sigma-Aldrich), kecske anti-Aip1 /Alix szérum (katalógusszám. SC-49268, Santa Cruz), egér monoklonális anti-CD29 /β1-integrin (katalógusszám. SC-610468, BD Biosciences), és az egér monoklonális anti-Bip /GRP78 (katalógusszám. 610.979, BD Biosciences) hígításban 1:200 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A blotokat ezután inkubáljuk a megfelelő anti-IgG másodlagos antitesttel konjugált torma-peroxidáz (Jackson Laboratories) hígításban 1:2,000 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Specifikus fehérjék tettük láthatóvá az ECL rendszer (GE Healthcare), és a FUJIFILM foszforeszkáló képelemző LAS3000 (Fuji Film). A fehérje molekulatömege vezettük le a Precision Plus Protein Standard (Bio-Rad Laboratories).

RNS Isolation

RNS izolálása táptalaj, sejteket oltottunk a fent leírtak szerint. 48 óra után termesztett, tápoldatot összegyűjtöttük és centrifugáltuk 800 × g-vel 5 percig, és további 2000 × g-vel 10 percig. A felülúszót vetjük alá szűrés egy 0,22 jim pórus poliéterszulfon membrán szűrő (Corning), majd koncentráció, egy 5000 Mw cut-off membránt (Centricon Plus-70, Millipore). A végső térfogat felülúszót körülbelül 10-20 ml-re az eredeti térfogat 250-500 ml. A felülúszót összekevertük azonos térfogatú QIAzol lízis reagens (Qiagen), és eljárást követte az RNS izolálás alábbiakban ismertetjük. Teljes RNS-t izoláltunk a sejtekből, exoszómák, vagy a táptalajból a miRNeasy Mini Kit (Qiagen) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Eltávolításához genomiális DNS-t, 40 ng celluláris teljes RNS inkubáltunk 40 egység RQ1 RNase-Free DNase (Promega), 37 ° C-on 30 percig a jelenlétében 40 egység RNasin Plus RNáz inhibitor (Promega). A teljes RNS-t exoszómák és táptalajok, minden összeg nyers termékek kezeltük ugyanabban az eljárásban, kivéve a használat 5 U DN-áz. RNS-t tisztítottunk az RNeasy MinElute Cleanup kit (Qiagen) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Az RNS-mintákat számszerűsíthetők NanoDrop spektrofotométerrel (Thermo Fisher Scientific) és értékeljék a Agilent kis RNS Kit és a Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Katalógusa

A microarray analízis katalógusa

A miRNS profilalkotás 100 ng és 20 ng celluláris és extracelluláris teljes RNS-ek, illetve voltak fluoreszcens-jelölt a miRNS Complete jelző reagenst és Hyb Kit (Agilent Technologies) szerinti gyártási protokollja (Agilent miRNS microarray verzió: 2.2). Az átfogó miRNS elemzést végeztünk az Emberi miRNS microarray Kit (8 × 15 K) Ver.3.0 (Agilent). A hibridizációs jelek detektálására a DNS Microarray Scanner (Agilent Technologies). A szkennelt képek segítségével analizáltuk Agilent Feature Extraction program és az adatok elemzése segítségével végeztük GeneSpring GX software (Agilent Technologies). Az adatok az ebben kézirat letétbe NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) és keresztül érhető GEO Series elérési száma GSE21350: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE21350). katalógusa

Reverz transzkripció (RT) és kvantitatív RT-PCR analízis miRNS katalógusa

a mennyiségi miRNS szintek meghatározása valós idejű RT-PCR-rel az Applied Biosystems 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems), TaqMan® Gene Expression assay (Applied Biosystems), az emberi let-7a (assay ID 000.377), let-7b (assay ID 002.619), let-7c (assay ID 000.379), let-7d (assay ID 002.283 ), legyen-7e (vizsgálati ID 002406), legyen-7f (vizsgálati ID 000382), legyen-7g (esszé azonosító 002282), legyen-7i (vizsgálati ID 002221), és U6 snRNS (vizsgálati ID 001973) endogén kontroll . Tíz ng teljes RNS-t reverz transzkripció és TaqMan® Universal PCR Master Mix Nem AmpErase (Applied Biosystems) és a megfelelő TaqMan® Reagensek célgének. RT-PCR-t végeztünk a teljes térfogatban 20 ul reakcióelegy szerint a gyártó protokollt. Az amplifikációt a következőképpen hajtjuk végre: 95 ° C-on 10 percig, 40 ciklus 95 ° C-on 15 s és 60 ° C-on 60 másodpercig. A mintákat három példányban biológiai párhuzamos vagy négy technikai párhuzamos. A miRNS szintek meghatározása a ciklus küszöb (Ct), az összehasonlító Ct módszer, és a normalizálás a szintje U6 snRNS az egyes mintákban. Fold növeli vagy csökkenti az egyes miRNS szinten vizsgált sejtvonalban arra való hivatkozással határozzák meg az a szint, AZ-P7a sejtvonal. Katalógusa

Köszönetnyilvánítás katalógusa

Köszönjük a tagok a Shizuoka Cancer Center Research Institute azok sok hasznos javaslatokat. Mi is köszönjük dr. Yutaka Yonemura és Yoshio Endo ajándék az AZ-P7a és MKN45P sejtvonalak. Katalógusa

• PLoS One: A Gene Expression aláírása szerzett kemorezisztenciájának a ciszplatin + fluorouracil kombinált kemoterápia gyomorrákban Patients
• PLoS One: hipoxia-indukálható faktor 1α Meghatározza gyomorkarcinóma kemoszenzitivitás módosításán keresztül p53 és NF-kB